专利名称：医用纳米粒子的制备方法
技术领域：
本发明涉及纳米材料制备领域，特别涉及一种制备医用双功能纳米粒子的方法。
背景技术：
聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子因其独特的分子结构而显示出特殊的性质，最 初的研究主要集中在合成上。现在研究兴趣已转向性能和与应用上。如在催化、医疗、微电 子、液晶材料、新纳米材料等方面都有许多新的应用。目前国外对树枝状大分子的应用潜力 得到了极其广泛的研究，其中在医学领域的研究主要集中在基因载体、药物载体、磁共振造 影剂和硼中子俘获治疗试剂等。树枝状大分子新型结构可用作内_外受体基质(主_客) 相互作用的多功能平台。在设计新型包裹剂和用作蛋白质作用的模型时可研究内受体特 点，而在设计人工基因转染材料、磁共振成像造影剂时，作为外受体已被研究。国内医学对 该领域的研究尚不多见。 聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子表面大量的氨基官能团和内部的空腔可与多个 分子结合。树枝状大分子化学家通过各种技术，包括荧光和光学吸收探针、电子顺磁共振 (EPR)技术以及分子模拟等研究分子的形状、大小、表面性质及小分子在内腔和外表面的吸 附行为。研究主要集中在树状分子的表面和内部空腔与小分子键合实验及其机理研究上。 Chen等人用荧光光谱法研究了 6. 0GPAMAM树状大分子与探针分子5- 二甲胺基-1-萘酚磺 酸(DNS)结合的机理。发现在带正电荷的树枝状大分子与带负电的DNS之间是靠静电作 用结合的。Kojima等人用PEG修饰树枝状大分子，不仅在适当条件下可释放阿霉素和甲氨 蝶呤，而且同时加强了载体的生物相容性。Zhuo等人合成了具有环状核的PAMAM树状大分 子，在27oC、 pH为7. 4的磷酸缓冲溶液中成功缓释出游离的5-氟脲嘧啶。研究表明，聚酰 胺_胺树状大分子有希望成为抗癌药物可控释放的运载体系。 肿瘤是危害全人类的头号疾病。肿瘤的早期诊断、早期治疗和靶向治疗是人们一 直关注和研究的内容。用于细胞生物学研究的传统荧光染料存在很多无法客服的局限性， 如激发波长要求严格，荧光效率低，发射波长和激发波长容易交叠，光稳定性差，等等，给生 物学研究带来了很多不便。量子点由于其量子尺寸效应而具有奇特的性质，包括荧光发射 波长可控、激发波谱宽而连续、荧光强、光稳定好、耐光漂白、能实现一元激发多元发射的同 时多色标等独特性能，可弥补现有有机荧光染料的不足，甚至在某些情况下可替代有机荧 光染料。量子点的独特性能将有利于其在医学实验和临床检测上的应用，相比传统荧光试 剂在生物分析方面有着巨大的优势。 目前，量子点在生物医学研究中的应用越来越受到重视。最主要是作为生物荧光 探针标记物。但现在通常使用的量子点表面都被大量有机溶剂分子氧化三辛基膦/三辛 基膦(T0P0/T0P)，十八胺(0DA)等包覆而呈疏水性，而生物大分子或者药物一般是溶解或 分散在水溶剂中的，所以必须进行水溶性改进。目前的量子点(QDs)的修饰方法大致可以 分为以下几种(1)通过双功能分子连接改性。主要是利用Zn、Cd等II族原子与硫原子之 间有效的键合作用，用带有巯基的双功能分子，如巯基羧酸类、二硫苏糖醇(DTT)、硫代胆碱等取代QDs表面的有机分子，以使其从疏水性转变为亲水性，然后通过另一端的功能基团 可以与生物大分子连接，这种方法简单、重复性好，但由于使用的是小分子作为连接物，修 饰以后原有的有机分子对量子点的保护和稳定性得不到有效的替代，所以稳定性不好，荧 光性质也大大减弱。(2)通过在量子点(QDs)表面包覆硅或硅烷等进行修饰。修饰后的量 子点稳定性、水溶性以及进一步连接的可操作性都比较理想，但是修饰过程极为烦琐、周期 长、重复性无法保证。(3)将量子点直接包埋入聚合物的空腔或形成的疏水腔。由于采用这 类方法量子点表面的有机分子没有损失，所以其性能基本不受影响。但是，这种方法包覆的 量子点的粒径较大，不利于在生物方面的应用。(4)通过双亲性高分子与量子点表面的烷基 链疏水作用实现包裹，由于这种方法也未破坏量子点表面的有机分子，其光学性质也基本 不受影响，但使用大量的有机溶剂，过程复杂，纯化困难。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服背景技术存在的问题和缺陷，提供一种制备医 用双功能纳米粒子的方法，制备粒径在lnm 13nm之间的、用于肿瘤早期检测和靶向治疗 的双功能纳米粒子，该制备方法使量子点的稳定性、水溶性、靶向性以及生物相容性得到提 高的同时，还可以使抗癌药物定位到肿瘤部位进行缓释，降低毒副作用，所制备的纳米粒子 适用于生物标记、细胞成像、肿瘤靶向和显影、癌症靶向治疗以及对治疗效时机实时监测等 多个领域。 本发明制备医用双功能纳米粒子的方法，采用连有叶酸和紫杉醇的聚酰胺-胺 (PAMAM)树枝状分子对油溶性量子点进行包覆的方法。该方法包括如下步骤用聚乙二醇 修饰聚酰胺_胺、在聚乙二醇上修饰叶酸、用聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺_胺包覆量子 点、将抗癌药夹到聚酰胺_胺内或连接到聚酰胺_胺表面； 所述的用聚乙二醇修饰聚酰胺_胺是将聚酰胺_胺溶解在水或甲醇中；在冰盐 浴的条件下，按聚酰胺-胺与两侧为氨基的聚乙二醇的摩尔比为l : 1 128，将聚酰胺-胺 溶液滴加到聚乙二醇中，滴加完毕撤掉冰盐浴，室温反应4 48小时，产物经过透析、旋蒸 后得到两侧为氨基的聚乙二醇修饰的聚酰胺_胺；通过控制加入两侧为氨基的聚乙二醇的 量及反应条件，合成了一侧连有聚酰胺_胺另一侧为氨基的聚乙二醇(PAMAM-PEG-NH2)。
所述的在聚乙二醇上修饰叶酸是，将叶酸和聚酰胺-胺-聚乙二醇溶解在二甲 基亚砜中，所述叶酸的用量与聚酰胺-胺-聚乙二醇中的聚乙二醇等摩尔量；然后加入N， N- 二环己基碳酰亚胺和4- 二甲氨基吡啶，所述N， N- 二环己基碳酰亚胺和4- 二甲氨基吡 啶的用量分别与叶酸等摩尔量；室温反应2 24小时，加入水后，离心，上清液用pH = 6 12的缓冲溶液透析，再用去离子水透析，除去溶剂得到中间产物；按聚酰胺-胺与乙二胺的 摩尔比为l : 2 64，在冰盐浴的条件下，直接将所述中间产物逐滴加入到乙二胺中，滴加 完毕后，撤掉冰盐浴，室温反应2 48小时，反应完全后，除去溶剂得到浅黄色固体，经过透 析处理后，得到产物表面为氨基的聚酰胺-胺-聚乙二醇-叶酸(PAMAM-PEG-FA);
所述的用聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺-胺包覆量子点是，将连有油溶性配体的
量子点溶解在氯仿或四氢呋喃或甲苯中，聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺-胺溶解在甲醇或 水中，将两种溶液混合，用四甲基氢氧化胺控制pH值在6 14之间，在20 8(TC温度下反 应1 24小时，冷却至室温后，用乙酸乙酯或丙酮洗后，得到的固体溶解在水中，过滤除去溶剂后得到具有靶向检测功能的量子点。 经过一步配体交换可以把油溶性量子点转变为水溶性的，同时还达到了功能化的 目的。该方法制备的量子点应用于检测细胞膜上表达有高水平叶酸受体的肿瘤细胞。在量 子点表面包覆上树枝状PAMAM和PEG高分子层，能使量子点更稳定的同时，生物相容性也进
一步提咼o 所述的将抗癌药夹到聚酰胺_胺内或连接到聚酰胺_胺表面是，采用非化学键的 方法使抗癌药夹到聚酰胺-胺的内部空腔中，或者采用化学键的方法使抗癌药连接到聚酰 胺-胺表面； 其中，所述非化学键方法的具体步骤是，在温度为20 7(TC、搅拌的条件下，按具 有靶向检测功能的量子点与抗癌药的摩尔比为1 : 1 20，将抗癌药缓慢加入到具有靶向 检测功能的量子点的水溶液中，反应1 48小时后，过滤除去未反应的抗癌药，得到纳米粒 子的水溶液； 所述化学键方法的具体步骤是，在N， N' -二环己基碳酰亚胺和4_二甲氨基吡啶 的作用下，抗癌药与丁二酸按摩尔比为1 : 1，在20 8(TC温度下反应1 48小时后，得 到羧基化的抗癌药；再在N，N'-二环己基碳酰亚胺和4-二甲氨基吡啶的作用下，表面为氨 基的聚乙二醇-叶酸与羧基化的抗癌药按摩尔比为1 : 1 128，在20 8(TC温度下反应 1 48小时后，加入一定量的水，过滤除去不溶物，透析处理后得到双功能的纳米配体；将 连有油溶性配体的量子点溶解在氯仿或四氢呋喃或甲苯中，双功能的纳米配体溶解在甲醇 或水中，将两种溶液混合，用四甲基氢氧化胺控制pH值在6 14之间，在20 8(TC温度下 反应1 24小时，冷却至室温后，用乙酸乙酯或丙酮洗后，得到的固体溶解在水中，过滤除 去溶剂后得到纳米粒子的水溶液。 在功能化量子点的基础上引入抗癌药，合成了集肿瘤早期检测和靶向治疗为一体 双功能纳米粒子，使抗癌药可以直接定位到病灶位置，同时，还可以通过荧光实时跟踪监测 治疗效果，这大大降低了抗癌药对正常组织的毒副作用。 所述的量子点包括II-VI和III-V的量子点及其组成的核_壳结构的量子点，是 表面连有三苯基膦或十六胺或十八胺的CdS、 ZnS、 HgS、 GdSe、 ZnSe、 HgSe、 GdTe、 ZnTe、 ZnO、 PbSe、 HgTe、 CaAs、 InP、 InAs、 InCaAs、 CdS/ZnS、 CdS/Ag2S、 CdS/PbS、 CdS/Cd (OH) 2、 CdS/HgS、 CdS/HgS/CdS、 ZnS/CdS、 ZnS/CdS/ZnS、 ZnS/HgS/ZnS/CdS、 CdSe/CdS、 CdSe/ZnS、 CdSe/ZnSe、 CdSe/CuSe、 CdSe/HgTe、 CdSe/HgSe、 CdSe/HgSe/CdSe、 CdTe/HgS、 InAs/InP、 InAs/CdSe、 InAs/ZnSe或氧化铁磁性纳米粒子。 所述的聚酰胺-胺是0. 5 6. 5代的半代树枝状聚合物。
所述的聚酰胺-胺的分子直径在lnm至13nm之间。 所述的抗癌药是紫杉醇(Taxol)、阿霉素(Dox)或氨甲喋呤(MTX)等常见的抗癌 药。 所述的聚乙二醇为所有不同分子量的聚乙二醇。 本发明方法制备的纳米粒子具有肿瘤早期检测和靶向治疗的双重功能。应用于检 测细胞膜上表达有高水平叶酸受体的肿瘤细胞以及肿瘤的靶向治疗和实时监测治疗的效 果。通过这种有效的方法将叶酸修饰到量子点表面，作为量子点表面靶向功能分子。叶酸 是肿瘤细胞中代谢旺盛的主要原料之一，它与肿瘤细胞膜表面的叶酸受体特异性地结合而进入细胞参与细胞代谢，肿瘤细胞的细胞膜表面的叶酸受体水平远远高于正常细胞。故叶 酸受体以作为许多治疗肿瘤的药物的靶向功能受体分子。本发明把叶酸成功地修饰到了量 子点表面，使得这些量子点可以特异性地识别表达有高水平叶酸受体的癌细胞，从而可以 作为荧光探针用于细胞学研究。 同时，把树枝状聚酰胺_胺(PAMAM)和聚乙二醇(PEG)修饰到量子点表面，在量 子点表面形成比较致密的水溶性高分子层，能更好的保护量子点，由于树枝状聚酰胺-胺 (PAMAM)较大空间位阻，能避免环境介质渗入而造成量子点的发光性能的破坏(如光降解、 光漂白以及Cd离子的渗出而产生毒性)，可以很大程度地提高量子点的稳定性。这种方法 制备的水溶性量子点产物具有非常优异的荧光性质，基本维持了原有油溶性量子点的光学 性质，水溶液的稳定性长达十个月。而且树枝状聚酰胺-胺(PAMAM)和聚乙二醇(PEG)都 有很好的生物相容性和很小的毒性，使其在生物学上的应用提供了可行性。
除此之外，这种制备方法使量子点的稳定性、水溶性、靶向性以及生物相容性得到 提高的同时，还把抗癌药夹入到聚酰胺-胺(PAMAM)的内部空腔中，或者将抗癌药连接到聚 酰胺-胺(PAMAM)表面，使药物直接定位到肿瘤部位进行缓释，大大降低了药物对正常组织 的毒副作用。同时，可以通过荧光对抗癌药的治疗效果进行实时监测。本方法制备的双功 能纳米粒子可以广泛用于生物标记、细胞成像、肿瘤靶向和显影、癌症靶向治疗以及对治疗 效果的实时监测等多个生物分析领域。而且本方法制备的用于肿瘤早期检测和靶向治疗的 双功能纳米粒子粒径为纳米级，且粒径分布较窄。
图1是本发明树枝状配体PAMAM-PEG-FA的合成路线示意图； 图2是本发明树枝状配体PAMAM-PEG-FA-Taxol的合成路线示意图； 图3是本发明双功能纳米粒子的非化学键合成路线示意图； 图4是本发明双功能纳米粒子的化学键合成路线示意图； 图5是本发明应用于免疫细胞化学方法检测细胞表面的叶酸受体的实施例示意 图； 图6是本发明应用于免疫细胞化学方法检测细胞表面叶酸受体的效果图之一 ； 图7是本发明应用于免疫细胞化学方法检测细胞表面叶酸受体的效果图之二。
具体实施例方式
实施例1 :聚酰胺-胺型树枝状分子(PAMAM)的合成1 聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状分子的合成采用发散法，即分子由核心部分开始向外
生长。根据树木分枝的规律将预先制备好的单体按发射状的顺序、分支的枝梢再分枝，依次
重复组合起来。以乙二胺为起始物，在甲醇中通过与过量的甲基丙烯酸甲酯发生麦克尔加
成反应，得到0. 5代的树枝状聚酰胺_胺(PAMAM)分子，然后用0. 5代的树枝状聚酰胺_胺
(PAMAM)与过量的乙二胺发生氨解反应，得到l.O代的树枝状聚酰胺-胺(PAMAM)，重复以
上两步反应，就可以得到更高代数的树枝状分子。 实施例2 :聚酰胺-胺型树枝状分子(PAMAM)的合成2 树枝状分子聚酰胺_胺(PAMAM) 合成采用收敛法，即采用将预先合成好的树枝状低聚物依次连接在核心分子上的合成策略。该种方法与上面提到的发散法正好相反，其 合成步骤是先合成一个一个的小分支，然后这些小分支两两相连，发展成较大的"枝"，最后 两个(或多个)对称的大"枝"连在一起形成树枝状大分子。
实施例3 :用聚乙二醇修饰聚酰胺_胺(PAMAM-PEG-NH2) 1 将2.5代树枝状聚酰胺-胺(PAMAM)溶解在甲醇中，在冰盐浴条件下，按聚酰 胺-胺(PAMAM)和两侧为氨基的聚乙二醇(PEG)的摩尔比为1 : l，将聚酰胺-胺(PAMAM) 逐滴加入到聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)中，滴加完毕后，撤掉冰盐浴，室温反应2小时后，透 析、旋蒸得到产物聚酰胺_胺_聚乙二醇；(PAMAM-PEG-NH2)。
实施例4 :用聚乙二醇修饰聚酰胺_胺(PAMAM-PEG-NH2) 2 将4.5代树枝状聚酰胺-胺(PAMAM)溶解在甲醇中，在冰盐浴条件下，按聚酰 胺-胺(PAMAM)和两侧为氨基的聚乙二醇(PEG)的摩尔比为1 : 40，将聚酰胺-胺(PAMAM) 逐滴加入到聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)中，滴加完毕后，撤掉冰盐浴，室温反应12小时后，透 析、旋蒸得到产物聚酰胺_胺_聚乙二醇(PAMAM-PEG-NH2)。
实施例5 :用聚乙二醇修饰聚酰胺_胺(PAMAM-PEG-NH2) 3 将6. 5代树枝状聚酰胺_胺(PAMAM)溶解在甲醇中，在冰盐浴条件下，按聚酰 胺-胺(PAMAM)和两侧为氨基的聚乙二醇(PEG)的摩尔比为l : 128，将聚酰胺-胺(PAMAM) 逐滴加入到NH2-PEG-NH2中，滴加完毕后，撤掉冰盐浴，室温反应48小时后，透析、旋蒸得到 产物聚酰胺_胺_聚乙二醇(PAMAM-PEG-NH2)。
实施例6 :在聚乙二醇上修饰叶酸(PAMAM-PEG-FA) 1 参见图l，将叶酸和聚酰胺_胺_聚乙二醇(PAMAM-PEG-NH2)溶解在二甲基亚砜 (DMS0)中，所述叶酸的用量与聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG-NH2)中的聚乙二醇(PEG) 等摩尔量；然后加入N， N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，所述N， N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的用量分别与叶酸等摩尔量；室温 反应2小时，加入水后，离心，上清液用pH = 6的缓冲溶液透析，再用去离子水透析，除去溶 剂得到中间产物。按聚酰胺-胺(PAMAM)与乙二胺(EDA)的摩尔比为1 : 2，在冰盐浴的条 件下，直接将所述中间产物逐滴加入到乙二胺(EDA)中，滴加完毕后，撤掉冰盐浴，室温反 应2小时，反应完全后，除去溶剂得到浅黄色固体，经过透析处理后，得到产物表面为氨基 的聚酰胺_胺_聚乙二醇_叶酸(PAMAM-PEG-FA)。
实施例7 :在聚乙二醇上修饰叶酸(PAMAM-PEG-FA) 2 参见图l，将叶酸和聚酰胺_胺_聚乙二醇(PAMAM-PEG-NH2)溶解在二甲基亚砜 (DMS0)中，所述叶酸的用量与聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG-NH2)中的聚乙二醇(PEG) 等摩尔量；然后加入N， N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，所述N， N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的用量分别与叶酸等摩尔量；室温 反应4小时，加入水后，离心，上清液用pH = 8的缓冲溶液透析，再用去离子水透析，除去溶 剂得到中间产物。按聚酰胺-胺(PAMAM)与乙二胺(EDA)的摩尔比为1 : 8，在冰盐浴的条 件下，直接将所述中间产物逐滴加入到乙二胺(EDA)中，滴加完毕后，撤掉冰盐浴，室温反 应6小时，反应完全后，除去溶剂得到浅黄色固体，经过透析处理后，得到产物表面为氨基 的聚酰胺_胺_聚乙二醇_叶酸(PAMAM-PEG-FA)。
实施例8 :在聚乙二醇上修饰叶酸(PAMAM-PEG-FA) 3
参见图l，将叶酸和聚酰胺_胺_聚乙二醇(PAMAM-PEG-NH2)溶解在二甲基亚砜 (DMS0)中，所述叶酸的用量与聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG-NH2)中的聚乙二醇(PEG) 等摩尔量；然后加入N， N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，所述N， N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的用量分别与叶酸等摩尔量；室温 反应8小时，加入水后，离心，上清液用pH = 10的缓冲溶液透析，再用去离子水透析，除去 溶剂得到中间产物。按聚酰胺-胺(PAMAM)与乙二胺(EDA)的摩尔比为1 : 24，在冰盐浴 的条件下，直接将所述中间产物逐滴加入到乙二胺(EDA)中，滴加完毕后，撤掉冰盐浴，室 温反应12小时，反应完全后，除去溶剂得到浅黄色固体，经过透析处理后，得到产物表面为 氨基的聚酰胺_胺_聚乙二醇_叶酸(PAMAM-PEG-FA)。
实施例9 :在聚乙二醇上修饰叶酸(PAMAM-PEG-FA) 4 参见图l，将叶酸和聚酰胺_胺_聚乙二醇(PAMAM-PEG-NH2)溶解在二甲基亚砜 (DMSO)中，所述叶酸的用量与聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG-NH2)中的聚乙二醇(PEG) 等摩尔量；然后加入N， N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，所述N， N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的用量分别与叶酸等摩尔量；室温 反应24小时，加入水后，离心，上清液用pH = 12的缓冲溶液透析，再用去离子水透析，除去 溶剂得到中间产物。按聚酰胺-胺(PAMAM)与乙二胺(EDA)的摩尔比为1 : 64，在冰盐浴 的条件下，直接将所述中间产物逐滴加入到乙二胺(EDA)中，滴加完毕后，撤掉冰盐浴，室 温反应48小时，反应完全后，除去溶剂得到浅黄色固体，经过透析处理后，得到产物表面为 氨基的聚酰胺_胺_聚乙二醇_叶酸(PAMAM-PEG-FA)。 实施例10 :用聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺-胺包覆量子点 (QDs-PA應-PEG-FA) 1 将表面连有氧化三辛基膦(TOPO)的CdS油溶性量子点溶解在四氢呋喃中， PAMAM-PEG-FA溶解在水中，将两种溶液混合，用四甲基氢氧化胺控制pH = 6，在30°C反应2 小时，冷却至室温后，用乙酸乙酯洗后，得到的固体溶解在水中，过滤，除去溶剂后得到目标 产物QDs-PAMAM-PEG-FA。 实施例11 :用聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺_胺包覆量子点 (QDs-PAMAM-PEG-FA)2 将表面连有十八胺的CdSe/ZnS油溶性量子点溶解在氯仿中，PAMAM_PEG_FA溶 解在甲醇中，将两种溶液混合，用四甲基氢氧化胺控制pH = 10，在4(TC反应4小时，冷 却至室温后，用乙酸乙酯洗后，得到的固体溶解在水中，过滤，除去溶剂后得到目标产物 QDs-PA應-PEG-FA。 实施例12 :用聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺-胺包覆量子点 (QDs-PAMAM-PEG-FA)3 将表面连有十八胺的CdS/ZnS油溶性量子点溶解在甲苯中，PAMAM_PEG_FA溶 解在甲醇中，将两种溶液混合，用四甲基氢氧化胺控制pH = 8，在6(TC反应8小时，冷 却至室温后，用乙酸乙酯洗后，得到的固体溶解在水中，过滤，除去溶剂后得到目标产物 QDs-PAMAM-PEG-FA。 实施例13 :用聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺-胺包覆量子点 (QDs-PAMAM-PEG-FA)4
将表面连有十六胺的HgS油溶性量子点溶解在氯仿中，PAMAM-PEG-FA溶解 在水中，将两种溶液混合，用四甲基氢氧化胺控制pH = 9，在70 °C反应24小时，冷却 至室温后，用乙酸乙酯洗后，得到的固体溶解在水中，过滤，除去溶剂后得到目标产物 QDs-PA應-PEG-FA。 实施例14 :用聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺-胺包覆量子点 (QDs-PA應-PEG-FA) 5 用其它表面连有氧化三辛基膦(T0P0)或十八胺或十六胺的CdS， ZnS， HgS， GdSe， ZnSe， HgSe， GdTe， ZnTe， ZnO， PbSe， HgTe， CaAs， InP， InAs， InCaAs， CdS/ZnS， CdS/Ag2S， CdS/ PbS， CdS/Cd(OH)2， CdS/HgS， CdS/HgS/CdS， ZnS/CdS， ZnS/CdS/ZnS， ZnS/HgS/ZnS/CdS， CdSe/ CdS， CdSe/ZnS， CdSe/ZnSe， CdSe/CuSe， CdSe/HgTe， CdSe/HgSe， CdSe/HgSe/CdSe， CdTe/HgS， InAs/InP， InAs/CdSe， InAs/ZnSe或氧化铁磁性纳米粒子，替代实施例10-13中表面连有氧 化三辛基膦(TOPO)的CdS油溶性量子点、表面连有十八胺的CdSe/ZnS油溶性量子点、表面 连有十八胺的CdS/ZnS油溶性量子点或表面连有十六胺的HgS油溶性量子点，均可得到目 标产物QDs-PA應-PEG-FA。 实施例15 :将抗癌药夹到聚酰胺_胺内部空腔(QDs-PAMAM-PEG-FA-Taxol) 1
参见图2与图3，在温度为2(TC、搅拌的条件下，按QDs-PAMAM-PEG-FA与紫杉醇 (Taxol)的摩尔比为l : l，将紫杉醇(Taxol)缓慢加入到QDs-PAMAM-PEG-FA的水溶液中， 反应2小时后，过滤除去未反应的紫杉醇(Taxol)，得到集检测和靶向治疗为一体的双功能 纳米粒子QDs-PAMAM-PEG-FA-Taxol的水溶液。 实施例16 :将抗癌药夹到聚酰胺_胺内部空腔(QDs-PAMAM-PEG-FA-Taxol) 2
参见图2与图3，在温度为4(TC、搅拌的条件下，按QDs-PAMAM-PEG-FA与紫杉醇 (Taxol)的摩尔比为1 : IO，将紫杉醇(Taxol)缓慢加入到QDs-PAMAM-PEG-FA的水溶液 中，反应12小时后，过滤除去未反应的紫杉醇(Taxol)，得到集检测和靶向治疗为一体的双 功能纳米粒子QDs-PAMAM-PEG-FA-紫杉醇(Taxol)的水溶液。 实施例17 :将抗癌药夹到聚酰胺_胺内部空腔(QDs-PAMAM-PEG-FA-Taxol) 3 参见图2与图3，在温度为7(TC、搅拌的条件下，按QDs-PAMAM-PEG-FA与紫杉醇
(Taxol)的摩尔比为1 : 20，将紫杉醇(Taxol)缓慢加入到QDs-PAMAM-PEG-FA的水溶液
中，反应48小时后，过滤除去未反应的紫杉醇(Taxol)，得到集检测和靶向治疗为一体的双
功能纳米粒子QDs-PAMAM-PEG-FA-紫杉醇(Taxol)的水溶液。 实施例18 :将抗癌药连接到聚酰胺_胺表面(PAMAM-PEG-FA-Taxol) 1 参见图2与图4，在N'N- 二环己基碳酰亚胺(DCC)和4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)的
作用下，抗癌药紫杉醇(Taxol)与丁二酸(SA)按摩尔比l : 1，在2(TC温度下反应4小时
后，得到羧基化的紫杉醇(Taxol-SA);再在N' N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基
吡啶(DMAP)的作用下，表面为氨基的聚酰胺_胺_聚乙二醇_叶酸(PAMAM-PEG-FA)与羧
基化的紫杉醇(Taxol-SA)按摩尔比为1 : 1，在2(TC温度下反应4小时后，加入一定量的
水，过滤除去不溶物，透析处理后得到双功能的纳米配体(PAMAM-PEG-FA-Taxol)。 实施例19 :将抗癌药连接到聚酰胺_胺表面(PAMAM-PEG-FA-Taxol) 2 参见图2与图4，在N'N- 二环己基碳酰亚胺(DCC)和4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)的
作用下，抗癌药紫杉醇(Taxol)与丁二酸(SA)按摩尔比1 : 1，在4(TC温度下反应8小时后，得到羧基化的紫杉醇(Taxol-SA);再在N' N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基 吡啶(DMAP)的作用下，表面为氨基的聚酰胺_胺_聚乙二醇_叶酸(PAMAM-PEG-FA)与羧 基化的紫杉醇(Taxol-SA)按摩尔比为1 : 5，在4(TC温度下反应8小时后，加入一定量的 水，过滤除去不溶物，透析处理后得到双功能的纳米配体(PAMAM-PEG-FA-Taxol)。
实施例20 :将抗癌药连接到聚酰胺_胺表面(PAMAM-PEG-FA-Taxol) 3
参见图2与图4，在N'N- 二环己基碳酰亚胺(DCC)和4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)的 作用下，抗癌药紫杉醇(Taxol)与丁二酸(SA)按摩尔比1 : 1，在6(TC温度下反应48小时 后，得到羧基化的紫杉醇(Taxol-SA);再在N' N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基 吡啶(DMAP)的作用下，表面为氨基的聚酰胺-胺-聚乙二醇-叶酸(PAMAM-PEG-FA)与羧 基化的紫杉醇(Taxol-SA)按摩尔比为1 : 20，在6(TC温度下反应48小时后，加入一定量 的水，过滤除去不溶物，透析处理后得到双功能的纳米配体(PAMAM-PEG-FA-Taxol)。
实施例21 :将抗癌药连接到聚酰胺_胺表面(PAMAM-PEG-FA-Taxol) 4
参见图2与图4，在N'N- 二环己基碳酰亚胺(DCC)和4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)的 作用下，抗癌药紫杉醇(Taxol)与丁二酸(SA)按摩尔比1 : 1，在8(TC温度下反应24小时 后，得到羧基化的紫杉醇(Taxol-SA);再在N' N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基 吡啶(DMAP)的作用下，表面为氨基的聚酰胺_胺_聚乙二醇_叶酸(PAMAM-PEG-FA)与羧 基化的紫杉醇(Taxol-SA)按摩尔比为1 : 128，在8(TC温度下反应24小时后，加入一定量 的水，过滤除去不溶物，透析处理后得到双功能的纳米配体(PAMAM-PEG-FA-Taxol)。
实施例22 :将抗癌药连接到聚酰胺_胺表面(QDs-PAMAM-PEG-FA-Taxol) 5
参见图2与图4，将表面连有十八胺的CdSe/CdS油溶性量子点溶解在甲苯中， 双功能的纳米配体(PAMAM-PEG-FA-Taxol)溶解在甲醇中，将两种溶液混合，用四甲基氢 氧化胺控制pH = 6，在2(TC温度下反应1小时，冷却至室温后，用乙酸乙酯洗后，得到 的固体溶解在水中，过滤，除去溶剂后得到集检测和靶向治疗为一体的双功能纳米粒子 QDs-PAMAM-PEG-FA-Taxol。 实施例23 :将抗癌药连接到聚酰胺_胺表面(QDs-PAMAM-PEG-FA-Taxol) 6
参见图2与图4，将表面连有氧化三辛基膦(T0P0)的CdTe油溶性量子点溶解在 氯仿中，双功能的纳米配体(PAMAM-PEG-FA-Taxol)溶解在甲醇中，将两种溶液混合，用四 甲基氢氧化胺控制PH = 9，在4(TC温度下反应4小时，冷却至室温后，用乙酸乙酯洗后，得 到的固体溶解在水中，过滤，除去溶剂后得到集检测和靶向治疗为一体的双功能纳米粒子 QDs-PAMAM-PEG-FA-Taxol。 实施例24 :将抗癌药连接到聚酰胺_胺表面(QDs-PAMAM-PEG-FA-Taxol) 7
参见图2与图4，将表面连有十六胺的ZnS油溶性量子点溶解在四氢呋喃中， 双功能的纳米配体(PAMAM-PEG-FA-Taxol)溶解在水中，将两种溶液混合，用四甲基氢氧 化胺控制pH = 12，在8(TC温度下反应24小时，冷却至室温后，用乙酸乙酯洗后，得到
的固体溶解在水中，过滤，除去溶剂后得到集检测和靶向治疗为一体的双功能纳米粒子 QDs-PAMAM-PEG-FA-Taxol。 实施例25 :将抗癌药连接到聚酰胺_胺表面(QDs-PAMAM-PEG-FA-Taxol) 8
参见图2与图4，用其它表面连有氧化三辛基膦(T0P0)或十八胺或十六胺的CdS， ZnS， HgS， GdSe， ZnSe， HgSe， GdTe， ZnTe， Zn0， PbSe， HgTe， CaAs， InP， InAs， InCaAs， CdS/ZnS， CdS/Ag2S， CdS/PbS， CdS/Cd(0H)2， CdS/HgS， CdS/HgS/CdS， ZnS/CdS， ZnS/CdS/ZnS， ZnS/HgS/ZnS/CdS， CdSe/CdS， CdSe/ZnS， CdSe/ZnSe， CdSe/CuSe， CdSe/HgTe， CdSe/HgSe， CdSe/HgSe/CdSe， CdTe/HgS， InAs/InP， InAs/CdSe， InAs/ZnSe或氧化铁磁性纳米粒子， 替代实施例22-24中表面连有十八胺的CdSe/CdS油溶性量子点、表面连有氧化三辛基膦 (T0P0)的CdTe油溶性量子点或表面连有十六胺的ZnS油溶性量子点，均可得到目标产物 QDs-PA應-PEG-FA-Taxol 。 实施例26 :具有耙向检测功能的量子点(QDs-PAMAM-PEG-FA)对细胞的培养 参见图5，利用常规的细胞培养方法，选择Hela细胞或SK0V3细胞等表达有高水平
叶酸受体(FR)的肿瘤细胞与具有靶向检测功能的量子点(QDs-PAMAM-PEG-FA)共同培养，
然后用激光共聚显微镜观测，证明了肿瘤细胞对量子点的特异性吸收。 实施例27 :集检测和靶向治疗为 一 体的双功能纳米粒子
(QDs-PA應-PEG-FA-Taxol)对细胞的培养 参见图6与图7，利用常规的细胞培养方法，选择Hela细胞或SK0V3细胞等表 达有高水平叶酸受体(FR)的肿瘤细胞与集检测和靶向治疗为一体的双功能纳米粒子 (QDs-PAMAM-PEG-FA-Taxol)共同培养，然后用激光共聚显微镜观测，证明了肿瘤细胞对量 子点的特异性吸收；并且可以通过荧光实时检测抗癌药紫杉醇(Taxol)对肿瘤细胞的治疗 效果。
权利要求
一种医用纳米粒子的制备方法，其特征在于包括如下步骤用聚乙二醇修饰聚酰胺-胺、在聚乙二醇上修饰叶酸、用聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺-胺包覆量子点、将抗癌药夹到聚酰胺-胺内或连接到聚酰胺-胺表面；所述的用聚乙二醇修饰聚酰胺-胺是将聚酰胺-胺溶解在水或甲醇中；在冰盐浴的条件下，按聚酰胺-胺与两侧为氨基的聚乙二醇的摩尔比为1∶1～128，将聚酰胺-胺溶液滴加到聚乙二醇中，滴加完毕撤掉冰盐浴，室温反应4～48小时，产物经过透析、旋蒸后得到聚酰胺-胺-聚乙二醇；所述的在聚乙二醇上修饰叶酸是将叶酸和聚酰胺-胺-聚乙二醇溶解在二甲基亚砜中，所述叶酸的用量与聚酰胺-胺-聚乙二醇中的聚乙二醇等摩尔量；然后加入N，N-二环己基碳酰亚胺和4-二甲氨基吡啶，所述N，N-二环己基碳酰亚胺和4-二甲氨基吡啶的用量分别与叶酸等摩尔量；室温反应2～24小时，加入水后，离心，上清液用pH＝6～12的缓冲溶液透析，再用去离子水透析，除去溶剂得到中间产物；按聚酰胺-胺与乙二胺的摩尔比为1∶2～64，在冰盐浴的条件下，直接将所述中间产物逐滴加入到乙二胺中，滴加完毕后，撤掉冰盐浴，室温反应2～48小时，反应完全后，除去溶剂得到浅黄色固体，经过透析处理后，得到产物表面为氨基的聚酰胺-胺-聚乙二醇-叶酸。所述的用聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺-胺包覆量子点是，将量子点溶解在氯仿或四氢呋喃或甲苯中，聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺-胺溶解在甲醇或水中，将两种溶液混合，控制pH值在6～14之间，在20～80℃温度下反应1～24小时，冷却至室温后，用乙酸乙酯或丙酮洗后，得到的固体溶解在水中，过滤除去溶剂后得到量子点；所述的将抗癌药夹到聚酰胺-胺内或连接到聚酰胺-胺表面是，采用非化学键的方法将抗癌药夹到聚酰胺-胺的内部空腔中，或者采用化学键的方法将抗癌药连接到聚酰胺-胺表面。
2. 按照权利要求l所述的医用纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的非化学键方法的具体步骤是，在温度为20 7(TC、搅拌的条件下，按量子点与抗癌药的摩尔比为1 : 1 20，将抗癌药加入到量子点的水溶液中，反应1 48小时后，过滤，得到纳米粒子的水溶液。
3. 按照权利要求1所述的医用纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的化学键方法的具体步骤是，按聚乙二醇-叶酸与羧基化的抗癌药的摩尔比为l : 1 128，在20 8(TC温度下反应1 48小时后，加入水，过滤，透析后得到纳米配体；将量子点溶解在氯仿或四氢呋喃或甲苯中，纳米配体溶解在甲醇或水中，将两种溶液混合，控制pH值在6 14之间，在20 8(TC温度下反应1 24小时，冷却至室温后，用乙酸乙酯或丙酮洗后，得到的固体溶解在水中，过滤后得到纳米粒子的水溶液。
4. 按照权利要求1、2或3所述的医用纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的量子点包括II-VI和III-V的量子点及其组成的核_壳结构的量子点，是表面连有三苯基膦或十六胺或十八胺的CdS、 ZnS、 HgS、 GdSe 、 ZnSe 、 HgSe 、 GdTe 、 ZnTe 、 ZnO、 PbSe 、 HgTe 、 CaAs 、 InP、InAs、 InCaAs、 CdS/ZnS、 CdS/Ag2S、 CdS/PbS、 CdS/Cd (OH) 2、 CdS/HgS、 CdS/HgS/CdS、 ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、 ZnS/HgS/ZnS/CdS、 CdSe/CdS、 CdSe/ZnS、 CdSe/ZnSe、 CdSe/CuSe、 CdSe/HgTe、CdSe/HgSe、 CdSe/HgSe/CdSe、 CdTe/HgS、 InAs/InP、 InAs/CdSe、 InAs/ZnSe或氧化铁磁性纳米粒子。
5. 按照权利要求l所述的医用纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的聚酰胺-胺是0. 5-6. 5代的半代树枝状聚合物。
6. 按照权利要求1、2或3所述的医用纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的抗癌 药是紫杉醇、阿霉素或甲氨喋呤。
7. 按照权利要求1或5所述的医用纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的聚酰 胺_胺的分子直径在lnm至13nm之间。
全文摘要
本发明涉及一种医用纳米粒子的制备方法，属于纳米材料制备领域。该方法包括如下步骤用聚乙二醇修饰聚酰胺-胺、在聚乙二醇上修饰叶酸、用聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺-胺包覆量子点以及将抗癌药夹到聚酰胺-胺内或连接到聚酰胺-胺表面。采用聚酰胺-胺包覆油溶性量子点作为核壳结构的纳米配体，再将叶酸和聚乙二醇修饰到其表面，利用肿瘤细胞表面的叶酸受体与叶酸的特殊亲和力，将其定位到肿瘤细胞表面。同时，由于PAMAM的特殊结构特征，可以在其内部空腔中夹入抗癌药或者在其表面连接上抗癌药，大大降低了药物对正常组织的毒副作用。并且提高了量子点的稳定性和水溶性。
文档编号A61K47/34GK101695476SQ20091021775
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月26日 优先权日2009年10月26日
发明者李亚鹏, 王静媛, 赵义丽 申请人:吉林大学;