专利名称：用钙调蛋白激酶ii抑制剂治疗结构性心脏病中的心肌功能障碍的制作方法
技术领域：
本发明涉及钙调蛋白激酶II(CaMKII)的抑制。更具体而言，CaMKII的抑制可以治疗或预防结构性心脏病，例如，心肌梗塞后出现的收缩功能障碍，或者扩张性心肌病。
背景技术：
心肌梗塞是美国及全世界其它许多国家中具有显著性的残疾和死亡的主要原因，并且也是约2/3心力衰竭病例的原因。7某些引起疾病的事件(如心肌梗塞、未经治疗的高血压、收缩蛋白的先天性突变)可以导致包括心腔室扩张在内的常见心脏病表型，并减弱收缩功能(即减少心脏收缩期间由每个心室的射血分数)从而导致心力衰竭的临床综合征。7扩张性心肌病包括两种独特的疾病实体。此处所用的扩张性心肌病包括缺血性心肌病，该病是以左心室扩张与收缩功能减弱为特征的疾病实体。当心肌梗塞后存活的未梗塞心肌的正常代偿性肥厚不足时，便可能出现该病症。7“扩张性心肌病”也可以包括在没有心肌梗塞的情况下，由于心肌蛋白的遗传异常而导致的心肌重量增加，收缩功能减弱。7扩张性心肌病受试者是由于心室扩张而导致心脏收缩性降低的受试者。因此，与存活的未梗塞心肌肥厚以补偿梗塞心肌的受试者相比，扩张性心肌病和收缩功能障碍受试者的功能障碍是不同且更为严重的。此外，扩张性心肌病和收缩功能障碍受试者所患疾病不同于包括异常松弛在内的其它心脏病(即心脏舒张功能障碍和心律失常)。
可用于心力衰竭的疗法不足，因而需要新的治疗方法。心脏对梗塞的反应是通过残存心肌的肥厚以尽量维持正常收缩。然而，当肥厚不足以补偿时，结果是扩张性心肌病和减弱的收缩功能将导致心力衰竭和死亡。19尽管医学疗法在防止心肌梗塞后的心脏功能障碍和心力衰竭方面已取得重大进展，15这些问题却仍然是一个重要且未解决的公共卫生难题。
没有一种针对扩张性心肌病的药理学疗法是有效或令人满意的，许多受试者死亡或者在特定病例中需要进行心脏移植。目前，用于缓解心力衰竭受试者的心脏功能障碍并降低其死亡率的可利用药理学疗法可以被分为三个主要种类血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、β肾上腺素能受体(βAR)拮抗剂和醛固酮拮抗剂。尽管死亡率降低了，与无心力衰竭的同年龄对照受试者相比，经过这些药物治疗的受试者所承受的死亡风险仍然是显著增加了。ACE抑制剂、11βAR拮抗剂4和(至少一种类型的)醛固酮受体拮抗剂12均可以显著降低心肌梗塞后心脏功能障碍和心力衰竭的发病率并减轻发病程度。其它可利用的药理学疗法包括硝酸甘油、利尿剂、正性变力剂(强心剂)，以及脑利尿钠肽(BNP)。后几种药剂可以缓解症状，但与心力衰竭受试者死亡率的降低无关。
ACE抑制剂与10％受试者出现的咳嗽现象有关，并且可以在双侧肾动脉狭窄或其它严重肾病的稳定期间导致肾衰竭。7βAR拮抗剂则与阳痿和抑郁症有关，并且忌用于哮喘受试者；此外，在βAR拮抗剂的起始作用下，受试者可能进一步出现恶化的心力衰竭、低血压、心动过缓、心传导阻滞，以及疲劳。7醛固酮受体拮抗剂则会引发10％男性受试者显著的高血钾症和令人痛苦的男性乳房发育症。7，12未被证实有利于降低死亡率的药剂也与诸多难题有关；最值得注意的是不断发现许多强心剂虽然改善了症状，但实际上却很可能通过引发致命的心律失常而提高了死亡率。7与之相比，目前已知的是，CaMKII抑制可以减少动物模型的心律失常现象，20，21因而代表了一种可以增强心脏功能却不加重心律失常的新方法。目前可利用的药理学疗法无效且受限于其显著的有害副作用，因此具有改良功效且较少严重副作用的新疗法的进展便成为一个重要的公共卫生目标。
钙调蛋白激酶II是存在于心脏中，当心脏细胞内的Ca2+浓度提高时便被激活，并与结合了Ca2+的蛋白质钙调蛋白结合的一种酶。3CaMKII活性在严重心肌病受试者体内可能提高，但CaMKII却从未引起心力衰竭情况中的扩张性心肌病或收缩退化。
本发明提供了通过抑制CaMKII改善(提高)心肌收缩功能，以治疗扩张性心肌病和心力衰竭的方法。本发明进一步提供了通过选择性CaMKII抑制肽AC3-I的转基因过表达，实现针对心脏的CaMKII抑制的小鼠模型。因此，该AC3-I转基因小鼠是一种新的可以检验心脏疾病中慢性CaMKII抑制效果的重要工具。
发明内容
本发明提供了一种治疗或预防受试者心肌梗塞后的心肌功能障碍的方法，该方法包括给予受试者有效量的钙调蛋白激酶II(CaMKII)抑制剂，给予该抑制剂可以改善受试者心肌梗塞后的心肌收缩功能。
本发明提供了一种在被诊断患有扩张性心肌病或其它结构性心脏病的受试者中，治疗或预防出现在扩张性心肌病或其它结构性心脏病(如末期心瓣膜疾病)中的心肌功能障碍的方法，该方法包括给予受试者有效量的CaMKII抑制剂，给予该抑制剂可以治疗或预防受试者的扩张性心肌病或其它结构性心脏病。
本发明提供了一种在被诊断患有扩张性心肌病的受试者中，治疗或预防出现在扩张性心肌病中的心肌功能障碍的方法，该方法包括给予受试者有效量的CaMKII抑制剂，给予该抑制剂可以治疗或预防受试者的扩张性心肌病或其它结构性心脏病。
本发明提供了一种在被诊断患有扩张性心肌病的受试者中，提高其心肌收缩性的方法，该方法包括给予受试者有效量的CaMKII抑制剂，给予该抑制剂可以提高受试者的心肌收缩性。
本发明进一步提供了一种在被诊断患有心肌梗塞后的心功能障碍和/或收缩性降低的受试者中，提高其心肌收缩性的方法，该方法包括给予受试者有效量的CaMKII抑制剂，给予该抑制剂可以提高受试者的心肌收缩性。
本发明进一步提供了一种在被诊断患有心肌梗塞后的心肌收缩性降低的受试者中，提高其心肌收缩性的方法，该方法包括给予受试者有效量的CaMKII抑制剂，给予该抑制剂可以提高受试者的心肌收缩性。
本发明提供了鉴定可以治疗结构性心脏病的化合物的方法，该方法包括a)测定患有结构性心脏病的动物的心脏收缩性；b)将该化合物给予步骤a)中的动物；c)测定步骤b)中动物的心脏收缩性；并检测与步骤a)中动物的心脏收缩性相比，步骤b)中动物的心脏收缩性的增加，对心脏收缩性增加的检测鉴定出可以治疗结构性心脏病的化合物。
本发明提供了一种治疗受试者结构性心脏病的方法，该方法包括给予受试者有效量的通过本发明方法鉴定的化合物。
本发明提供了一种表达编码CaMKII抑制剂的核酸的转基因动物。
本发明也提供了一种表达编码一种肽的核酸的转基因动物，该肽包括被称为AC3-C的SEQ ID NO8的肽。
本发明进一步提供了一种双重转基因动物，该动物可以表达编码CaMKII抑制剂的核酸，并表达编码钙调磷酸酶的核酸。
图1.CaMKI、II和IV，以及针对本研究工程化的AC3-I和AC3-C转基因小鼠体内表达的CaMKII抑制肽和对照肽的结构域结构图示。CaMKII和IV均具有一个由CaM-结合区和自抑制(AI)区构成的调节域(阴影矩形)。CaMKII的CaM结合区(296-309，根据CaMKII编号，并由斜体字标记)与CaMKIV中的CaM结合区非常相似(相同的氨基酸下有划线)，并且针对CaMKII中的CaM结合序列的抑制肽同样地抑制CaMKIV的活化作用17。AC3-I是根据以Thr286(标有箭头)为中心的CaMKII的AI区建立的，并且CaMKII和CaMKIV中的AI区是不同的。CaMKI的CaM结合区或AI区均不与CaMKII或IV同源，但是，与AI区形成对比的是，针对CaMKII或IV的CaM结合区的抑制肽仍然可以抑制CaMKI，因为CaM结合域通常共有一个螺旋结构，却往往缺乏一级序列同源性。
图2.A-E.AC3-I小鼠具有正常心脏大小和收缩功能。A和B图中，在AC3-I小鼠和野生型(WT)同窝出生小鼠对照之间，心脏舒张期(A)或收缩期(B)的超声心动图左心室尺寸无明显差异。C和D图中，在AC3-C小鼠和WT同窝出生小鼠对照之间，心脏舒张期(C)或收缩期(D)的室间隔厚度无差异。E图中，AC3-I和基线的WT同窝出生小鼠对照之间，左心室的射血分数缩短无差异。所有图示中，空白柱为WT，阴影柱为AC3-I转基因(TG)。所有图示中，各个种系编号(标注于图E中)中对应的研究小鼠数量(n)均相同。
图3A-B.与野生型(WT)同窝出生小鼠对照相比，AC3-I小鼠具有显著降低的心脏CaMKII活性(A)，以及在心肌梗塞外科手术后显著较好的左心室射血分数缩短(B)。CaMKII活性测定获得自完整心脏组织匀浆物。
图4.通过GFP蛋白质印迹法确定AC3-I和AC3-C小鼠体内的转基因表达。括号中标示的种系编号表示蛋白质印迹和相应的定量磷光体成像结果中的特性(根据AC3-I5系标准化数据)。所有转基因小鼠的遗传特性均通过DNA印迹分析而得以证实，但AC3-I种系3则不表达转基因。
图5A-C.AC3-C转基因小鼠(来自种系1)出现了扩张性心肌病。心脏舒张期间，AC3-C(B)的左心室内径(LVID)明显大于AC3-I小鼠(B，**P＜0.01，来自种系4)，表明了扩张的表型。心脏收缩期间，AC3-C(B)体内的LVID缩短明显少于AC3-I(A，***P＜0.001)小鼠，表明了降低的心室功能。与LVID相比，心脏舒张或收缩期间，AC3-I和AC3-C小鼠的室间隔(IVS)和左心室后壁(LVPW)均无显著差异。C.与AC3-I小鼠(P＜0.001)相比，左心室射血分数缩短在AC3-C体内有显著降低。D.在AC3-I和AC3-C小鼠之间没有心率上的差异。
图6A-B.与AC3-C小鼠和野生型(WT)同窝出生小鼠相比，AC3-I来源的心室匀浆物的总CaMKII活性有显著降低。A.总CaMKII活性。B.CaMKII活性中不依赖Ca2+的部分。
图7A-D.CaMKII抑制作用改善了心肌梗塞外科手术后的心脏收缩功能。对心肌梗塞外科手术后3周未麻醉小鼠的超声心动图测量的结果表明CaMKII抑制作用显著保护了小鼠的左心室功能。A.与野生型同窝出生小鼠对照(WT)或者经由无活性KN-93同源物KN-92(30μmol/Kg体重)每日处理过的WT小鼠相比，经由CaMKII抑制剂KN-93(以1和10μmol/Kg体重剂量)每日处理过的小鼠，和具有转基因靶定CaMKII抑制作用的AC3-I小鼠的左心室(LV)射血分数缩短均有显著增加。通过方差分析(ANOVA)的P＜0.001和星号表示采用Bonferroni-校正t检验与WT相比的显著差异。B.心脏舒张期间的LV内径(LVID)是LV心室扩张的指标。心脏舒张期间的各组LVID无显著差异。C.心脏舒张期间的LV后壁(LVPW)壁厚度是衡量未梗塞壁的LV肥厚的指标。心脏舒张期间的各组LVPW无显著差异。D.具有转基因靶定CaMKII抑制作用的AC3-I小鼠的心率显著地慢于其它所有组的小鼠。
图8.在扩张性心肌病情况中，CaMKII抑制作用缓解了左心室扩张，也改善了左心室收缩功能。与CAN+转基因小鼠相比，双重转基因小鼠(AC3-I+/CAN+)的左心室(LV)扩张得到缓解，LV射血分数缩短也改善了。10对未麻醉的钙调磷酸酶(CAN+)转基因小鼠和杂种繁殖的双重转基因AC3-I+/CAN+小鼠进行超声心动图测量的结果显示与CAN+小鼠相比，AC3-I+/CAN小鼠的心脏舒张期间，LV内径(LVID)显著减小，室间隔(IVS)和LV后壁(LVPW)则增厚，这表明通过转基因靶定的CaMKII抑制作用可以部分缓解扩张性心肌病的表型。前4幅图中的测量参数一致左心室内径(LVID)，室间隔(IVS)，左心室后壁(LVPW)。与CAN+小鼠相比，双重转基因AC3-I+/CAN+小鼠的左心室收缩功能显著提高了，表明通过转基因靶定心脏的CaMKII抑制作用可以改善心脏的收缩功能。与之相比，AC3-I+/CAN+和CAN+转基因动物的心率之间无显著差异。所有小鼠均为4～8周龄。
图9A-B.杂种繁殖AC3-I或AC3-C小鼠和钙调磷酸酶(CAN)转基因小鼠的方法。A.方框表示育种对。主要对照是在CAN阳性小鼠之间进行，也显示了可选对照(提供的数据如图8所示)。B.PCR结果表明AC3-I与CAN小鼠之间的杂种繁殖是成功的，并且双重转基因小鼠可以通过标准PCR方法得以鉴定。
具体实施例方式
应当指出，如果上下文没有明确地另外指明，本说明书及所附权利要求中所用的单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数对象。因此，例如，提到的“一种抑制剂”包括该抑制剂的多重拷贝，也可以包括超过一个特定种类的抑制剂。
本发明提供了一种在被诊断患有心肌梗塞后心肌收缩功能障碍的受试者中，治疗或预防心肌梗塞后心肌收缩功能障碍的方法，该方法包括给予受试者有效量的钙调蛋白激酶II(CaMKII)抑制剂，给予该抑制剂可以治疗或预防受试者心肌梗塞后的心肌收缩功能障碍。通常，抑制剂的“有效量”指获得预期一种或多种理想结果所需要的量。“心肌梗塞”意指心脏的局部缺血性损伤，其中心脏的部分心肌(心脏肌肉)坏死或凋亡，即细胞程序性死亡。“局部缺血性损伤”意指由于流向器官或组织的血液中断，即局部缺血事件而导致对器官或组织的损害或潜在损害。贯穿全文所用的“受试者”意指个体。因此，“受试者”可以包括家养的动物，如猫、狗等，家畜(如牛、马、猪、绵羊、山羊等)，实验动物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)以及鸟类。优选的受试者为哺乳动物，如灵长类动物，更为优选的是人类。
该受试者可以是被诊断为患有心肌梗塞的病人。该受试者可以是被诊断为患有梗塞后心脏功能障碍的病人。该受试者可以是被诊断为已患有心肌梗塞的病人，该病人因而具有出现梗塞后心脏功能障碍的高度危险性。此外，该受试者可以是被诊断为患有扩张性心肌病或者具有心力衰竭症状的病人，其中该心力衰竭症状由任何与心室腔扩张表型及心肌收缩功能降低相关导致。该受试者可以是被诊断为心肌收缩性降低的病人。诊断心肌梗塞、梗塞后心脏功能障碍、心肌收缩性降低和扩张性心肌病的方法是本领域技术人员所熟知的。区分患有梗塞后收缩功能障碍或扩张性心肌病受试者与患有心肌梗塞或心肌肥厚的受试者的方法也是本领域技术人员所熟知的。应当认识到，被诊断患有心肌梗塞、心律失常或心肌肥厚的受试者并不一定患有扩张性心肌病或心肌收缩性降低。
CaMKII的抑制剂可以是任何抑制CaMKII活性或表达(如数量或致病效果)的化合物、组合物或药剂。该化合物可以是肽或非肽药剂，包括例如，编码了肽抑制剂的核酸。此外，该药剂可以是抑制心脏中CaMKII表达的反义核酸(见GenBank，编号为L13407，Hoch et al.，Circ Res 1999，其说明书中图9所示的异构体δ3和δ2)5。“抑制”意指限制、阻止或减低。因此，抑制剂是可以，例如减低酶活性和/或酶表达量的药剂。抑制作用可以是可逆或不可逆的。受试者体内的CaMKII活性或CaMKII总量可根据对其功能反应的检测或测量而容易地确定，例如，通过超声心动图或其它临床参数进行确定。此文提供了测定非人类的动物模型体内CaMKII活性的特定方法。因此，对抑制CaMKII的化合物的鉴定是常规实验。
CaMKII抑制剂的一个实例是一种肽，包含SEQ ID NO2的肽，此文也称其为AC3-I。本发明的该抑制剂可以由SEQ ID NO2的肽构成。
CaMKII抑制剂的另一个实例是一种肽，包含SEQ ID NO4的肽，即CaM-KIIN。该抑制剂可以是全长CaM-KIIN(SEQ ID NO4)和/或该全长肽的一个片段；该片段被称为CaM-KIINtide(SEQ ID NO6)。Chang et al.PNAS(USA)19989510890-10895中描述了CaMKIIN和CaM-KIINtide，此处将其完整引入作为参考。
由于这些肽均显示可以抑制CaMKII，因此可以预期含有这些肽之外还包括非必需氨基酸的其它肽和多肽也将具有类似活性。非必需氨基酸是不影响该肽的功能或该肽完成其功能的途径的氨基酸(如其二级结构或该肽活性的最终结果)。本发明非必需氨基酸的实例包括但不仅限于含有GFP，即一种可标记并识别蛋白质或肽以进行纯化的肽标记的氨基酸。
本发明考虑到CaMKII有其它多种抑制剂，其中之一为KN-93。WO98/33491中描述了KN-93这种CaMKII的非肽抑制剂，此处将其完整引入以参考其关于KN-93和CaMKII抑制剂的学说。
本发明进一步提供了一种治疗或预防受试者心肌梗塞后心脏功能障碍的方法，该方法包括给予受试者有效量的CaMKII抑制剂，给予该抑制剂可以治疗或预防受试者的心脏功能障碍。“心脏功能障碍”意指血液泵压室的收缩功能减低，该情况可导致心力衰竭的临床状况。诊断受试者心肌梗塞后心脏功能障碍的方法是本领域技术人员所熟知的。
在治疗或预防受试者心肌梗塞后心脏功能障碍的方法中，该CaMKII抑制剂可以是一种肽，例如该肽包含SEQ ID NO2的肽，或由SEQ ID NO2的肽组成。该CaMKII抑制剂可以是一种肽，它包含SEQ ID NO4的肽，或由SEQ ID NO4的肽所组成。此外，该抑制剂可以是一种肽，它包含SEQ ID NO6的肽，或由SEQ ID NO6的肽所组成。该抑制剂可以是非肽抑制剂，例如，含有KN-93活性区的抑制剂，或者其本身就是KN-93。
本发明也提供了一种治疗或预防受试者的扩张性心肌病或任一原因导致的、具有心脏腔室扩张表型的任何心脏疾病的方法，该方法包括给予受试者有效量的CaMKII抑制剂，给予该抑制剂可以治疗受试者的扩张性心肌病或减少心室扩张。诊断扩张性心肌病受试者的方法是本领域技术人员所熟知的。
在治疗或预防扩张性心肌病的方法中，该CaMKII抑制剂可以是一种肽，例如它包含SEQ ID NO2的肽，或由SEQ ID NO2的肽所组成。该CaMKII抑制剂可以是一种肽，它包含SEQ ID NO4的肽，或由SEQ ID NO4的肽所组成。此外，该抑制剂可以是一种肽，它包含SEQ ID NO6的肽，或由SEQ ID NO6的肽所组成。该抑制剂可以是非肽抑制剂，例如，含有KN-93活性区的抑制剂，或者其本身就是KN-93。
本发明提供了一种在被诊断患有扩张性心肌病，或任一原因导致的、具有心脏腔室扩张或收缩功能降低表型的任何心脏疾病受试者中，提高其心肌收缩性的方法，该方法包括给予受试者有效量的CaMKII抑制剂，给予该抑制剂可以改善受试者的心肌收缩性。测量心脏收缩性的技术，例如超声心动图、放射性核素血管造影术，以及磁共振成像均是本领域技术人员所熟知的。此处所用“心肌收缩性”指一个衡量心肌收缩，更具体而言，是衡量左心室收缩的尺度。如图7所示，AC3-I和KN-93提高了心肌收缩性(正性肌力作用)而未引起心脏肥厚。
此外，本发明还提供了一种在被诊断患有心肌梗塞的受试者中提高其心肌收缩性的方法，该方法包括给予受试者有效量的CaMKII抑制剂，给予该抑制剂可以提高受试者的心肌收缩性。
本发明也提供了一种在被诊断患有心肌梗塞后心脏功能障碍的受试者中，提高其心肌收缩性的方法，该方法包括给予受试者有效量的CaMKII抑制剂，给予该抑制剂可以改善受试者的心肌收缩性。
在提高心肌收缩性的方法中，CaMKII抑制剂可以是一种肽，例如它包含SEQ ID NO2的肽，或者是由SEQ ID NO2的肽所组成。该CaMKII抑制剂可以是一种肽，它包含SEQ ID NO4的肽，或者是由SEQ ID NO4的肽所组成。此外，该抑制剂也可以是一种肽，它包含SEQ ID NO6的肽，或者是由SEQ ID NO6的肽所组成。该抑制剂可以是非肽抑制剂，例如，含有KN-93活性区的抑制剂，或者其本身就是KN-93。
CaMKII抑制剂可以被用于提高心肌的收缩性，而不引起心肌肥厚，因而可以治疗被诊断患有心肌梗塞、心肌梗塞后的心脏功能障碍，和/或扩张性心肌病的受试者。
本发明提供了一种鉴定可治疗结构性心脏病的化合物的方法，该方法包括a)测定患有结构性心脏病的动物的心脏收缩性；b)将该化合物给予步骤a)中的动物；c)测定步骤b)中动物的心脏收缩性；d)确定与步骤a)中动物的心脏收缩性相比，步骤b)中动物的心脏收缩性的增加，检测该心脏收缩性的增加便可鉴定出可以治疗结构性心脏病的化合物。本发明的该方法中，患有结构性心脏病的动物可以是表达AC3-C的转基因动物。测定心脏收缩性的方法是本领域技术人员所熟知的，包括但不仅限于超声心动图。测定方法包括放射性核素血管造影术、磁共振成像，以及左心室血管造影术。
本发明提供了一种鉴定可治疗结构性心脏病的化合物的方法，该方法包括a)测定患有结构性心脏病的动物的脑利尿钠肽；b)将该化合物给予步骤a)中的动物；c)测定步骤b)中动物的脑利尿钠肽；d)确定与步骤a)中动物的脑利尿钠肽相比，步骤b)中动物的脑利尿钠肽的增加，检测该脑利尿钠肽的增加便鉴定出该可以治疗结构性心脏病的化合物。本发明的该方法中，患有结构性心脏病的动物可以是表达AC3-C的转基因动物。
心力衰竭是一种临床综合征，包括由于心脏收缩和组织氧合的减低导致的运动耐受力降低，7因此通过脚踏车或自行车ergonometry进行的运动测试、降低的组织氧摄取、或升高的血浆脑利尿钠肽水平均为心力衰竭严重程度的标志。指示心肌收缩极度和中度损伤、运动能力、最大耗氧量以及循环脑利尿钠肽水平的数值均于治疗心力衰竭领域内有所描述并被技术人员所熟知。7结构性心脏病的实例包括但不仅限于心肌梗塞、心肌梗塞后的心脏功能障碍、心肌收缩性降低，以及扩张性心肌病。
本发明提供了一种治疗受试者心肌梗塞、心肌梗塞后心脏功能障碍和/或扩张性心肌病的方法，该方法包括给予受试者有效量的一种通过上述方法鉴定的化合物，该化合物的给予可以治疗患有心肌梗塞后心脏功能障碍和/或扩张性心肌病的受试者，或者是具有心力衰竭、心脏腔室扩张及左心室收缩性降低等症状的病人。
本发明提供了表达编码CaMKII抑制剂的核酸的转基因动物。“转基因动物”指其身体的所有细胞均含有一种外源核酸的动物。本发明转基因动物的一个实例中，该转基因特异表达于心肌细胞中，并由心脏细胞特异启动子启动。该小鼠是采用心脏特异α肌球蛋白重链启动子(GenBank编号U71441)进行设计的。制备转基因动物的方法是本领域技术人员所熟知的，并于此文得以具体例证。
本发明的转基因动物体内表达的CaMKII抑制剂可以是一种肽，它包含SEQ ID NO2的肽。此外，本发明的转基因动物可以表达由SEQID NO2的肽所组成的肽。最近的报导发现在心脏中至少有4种不同的CaMKIIδ异构体，5并且由于靶定的调节域的保守性，AC3-I(SEQ IDNO2)可以抑制所有的CaMKII异构体。3CaMKII内的AC3-I靶定的域与其它CaMK类型(即CaMKI和CaMKIV，图1)中的类似功能域不同，并且实际上缺乏针对蛋白质激酶A和C的活性。3本发明的转基因动物体内表达的CaMKII抑制剂可以是一种肽，它包含SEQ ID NO4的肽。此外，本发明的该转基因动物可以表达由SEQ ID NO4的肽所组成的肽。
本发明进一步提供了于心肌细胞中表达编码一种肽的核酸的转基因动物，该肽包含SEQ ID NO8、也被称为AC3-C的肽。如图4和5所示，AC3-I和AC3-C小鼠具有相似的转基因表达，但是AC3-C小鼠表现出心肌病，而具有CaMKII抑制作用的AC3-I小鼠则表现正常。如图6所示，与患有心肌病的病人中所观察到的结果一样，AC3-C小鼠具有高的总CaMKII活性。因此，该转基因动物可以被应用于鉴定一种可以治疗结构性心脏病的化合物的本发明方法中。由于AC3-C被认为是无活性的，因此这些结果可能需要通过AC3-C-GFP转基因的绿色荧光蛋白(GFP)部分的作用来解释。6这种小鼠是遵照制备AC3-I转基因小鼠的基础方法获得的。
本发明也提供了一种于心肌细胞中表达编码AC3-I的核酸，和编码钙调磷酸酶的核酸的双重转基因动物(AC3-I+/CAN+)。该钙调磷酸酶(CAN+)转基因小鼠是公认患有严重扩张性心肌病的模型。10已知CAN拮抗剂可以‘挽救’多种小鼠模型中出现的心肌病表型，16但CaMKII抑制却从未被预期可以改善这些或任何其它心肌病模型的心脏功能或结构。如图8所例证的，除CAN之外还表达CaMKII抑制剂的该双重转基因动物的左心室功能得到改善，并且与CAN+动物模型比较时，显示出左心室扩张和肥厚的症状也得到缓解。因此，这种动物体内的CaMKII抑制可以治疗扩张性心肌病。
本发明的方法中，可以通过已知途径给予CaMKII抑制剂。一个特定实例中，肽抑制剂被制成细胞膜渗透性的。细胞“膜渗透”意指可以通过膜上的开口或间隙16。该方法采用了被添加到抑制肽中的肽序列，但豆蔻酰基化是使肽通过细胞膜的另一种方法。
本发明的组合物也可以被包含在药学可接受载体中被给予进体内。“药学可接受”意指一种符合生物学或其它方面需要的材料，即该材料可连同组分被给予受试者，而不引起任何不希望发生的生物效应，或者不会以有害的方式与包含其的药物组合物的任何其它组分相互作用。正如本领域技术人员所熟知的，该载体应当可以使有效成分的任何降解程度最小化，并最小化受试者体内有害副作用的发生。
尽管局部鼻内给药或通过吸入给药是典型优选的给药方式，仍然可以通过口服、肠胃外(如静脉内注射、肌肉内注射、鞘内注射、动脉内注射和腹膜内注射)、经皮、体外、局部等方式给予该组合物。此处所用的“局部鼻内给药”意指经由一个或两个鼻孔将该组合物送递至鼻孔和鼻道内，可以包括通过喷雾器或滴液器，或者通过雾化治疗剂实现的送递。该组合物的送递也可以是通过插管直接到下呼吸道的任意部位(如气管、支气管和肺)。根据受试者的人种、年龄、体重和全身状态、所治疗状况的严重程度、所用的特定组合物、其给药模式等，不同受试者所需组合物的准确量均不相同。因此，不可能指定每种组合物的准确量。不过，可以通过本领域一种普通技术，仅利用此处所提供方法的常规实验便可确定合适量。
如果采用肠胃外给予该组合物，其给药特征通常为注射。可以将可注射物制备成常规形式，如液体溶液或悬液，适用于注射前在液体中溶解成悬液的固体形式或乳剂。最近修订的肠胃外给药方法涉及缓释或持续释放体系的应用，可以维持恒定剂量。见例如U.S.Patent No.3,610,795，此处引入了该文献以作参考。
该物质可以溶于溶液、悬液(例如被掺入微粒、脂质体或细胞)中。借助于抗体、受体或受体配体可以将这些物质靶定到特定细胞类型上。下述文献是利用该技术将特定蛋白质靶定到肿瘤组织上的实例(Senter，et al.，Bioconjugate Chem.，2447-451，(1991)；Bagshawe，K.D.，Br.J.Cancer，60275-281，(1989)；Bagshawe，et al.，Br.J.Cancer，58700-703，(1988)；Senter，et al.，Bioconjugate Chem.，43-9，(1993)；Battelli，et al.，CancerImmunol.Immunother.，35421-425，(1992)；Pietersz andMcKenzie，Immunolog.Reviews，12957-80，(1992)；and Roffler，et al.，Biochem.Pharmacol，422062-2065，(1991))。载体如“隐形”脂质体及其它偶联抗体的脂质体(包括介导治疗结肠癌药物的脂质)，经由细胞特异配体介导DNA靶定的受体，靶定肿瘤的淋巴细胞，及靶定鼠科动物体内神经胶质瘤细胞的高特异治疗性逆转录病毒。下述文献是利用该技术将特定蛋白质靶定到肿瘤组织上的实例(Hughes et al.，Cancer Research，496214-6220，(1989)；andLitzinger and Huang，Biochimica et Biophysica Acta，1104179-187，(1992))。通常，受体被组成型或由配体诱导地包含在胞吞作用途径。网格蛋白包被的小窝中的这些受体簇，借助于网格蛋白包被的小囊泡进入细胞中，经过酸化的内涵体，在该酸化内体中受体被分类，继而或者再循环至细胞表面，被储存在细胞内，或者在溶酶体中被降解。内化途径具有多种功能，如营养的摄取、活化蛋白质的移除、大分子的清除、病毒及毒素的机会性入侵、配体的分离和降解，以及受体水平的调节。许多受体参与超过一个的细胞内途径，这取决于该细胞类型、受体浓度、配体类型、配体价及配体浓度。受体介导的胞吞作用的分子和细胞机理已有评述(Brown and Greene，DNA and Cell Biology106，399-409(1991))。
本发明的组合物可以包括编码一种抑制剂的核酸，或者可以包括CaMKII反义核酸。可通过多种途径将该公开组合物送递至目标细胞。例如，可通过电穿孔、脂转染，或者磷酸钙沉淀方法送递该组合物。所选择的送递机理部分地根据目标细胞的类型，以及该送递是否发生，例如于体内或体外。
因此，除了所公开的组合物或载体以外，该组合物还可以含有例如，诸如脂质体，如阳离子脂质体(如DOTMA、DOPE、DC-胆固醇)或阴离子脂质体的脂类。如必要，脂质体可以进一步含有蛋白质，以利于靶定特定细胞。组合物的给药包括将化合物和阳离子脂质体给药至血液中，以送递至目标器官，或者将其吸入进呼吸道内，以送递至呼吸道的目标细胞。关于脂质体，见例如Brigham et al.Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.195-100(1989)；Felgner et al Proc.Natl.Acad.Sci USA 847413-7417(1987)；U.S.Pat.No.4,897,355。此外，可以将该化合物作为一种微胶囊的组分给药，该微胶囊可以被靶定到特定细胞类型上，如巨噬细胞，或者将该化合物从该微胶囊中的扩散或送递设计成特定速率或剂量。
上述包括给予外源DNA并将其送递至受试者细胞内的方法(即基因转导或转染)中，可借助于多种机理将该组合物送递至细胞。其中一个实例是借助于脂质体送递组合物，即采用商业可利用的脂质体制剂，如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，WI)，以及其它根据本领域的操作标准研发的脂质体。另外，通过电穿孔可以体内送递本发明的核酸或载体，可采用Genetronics，Inc.(San Diego，CA)的方法，并通过SONOPORATION机械途径(ImaRx Pharmaceutical Corp.，Tucson，AZ)应用该技术。
被送递至细胞，并将被整合进宿主细胞基因组内的核酸典型地含有整合序列。这些序列通常为病毒相关序列，尤其是当采用基于病毒的体系时。这些病毒整合体系也可以被整合进有待于采用非基于核酸，如脂质体的送递体系被送递的核酸中，从而使得该送递体系中包含的核酸可以被整合进宿主基因组中。此处所用“核酸”包括单链或双链分子，即可能是由核苷酸碱基A、T、C、G组成的DNA，或者由碱基A、U(替代T)、C和G组成的RNA。该核酸可以代表编码链或其互补链。该核酸的序列可能与自然存在的序列的一部分相同，或者可能包括可选密码子，这些密码子编码了与自然存在序列中所发现氨基酸相同的氨基酸。此外，如本领域技术人员所熟知的，核酸可以包括代表氨基酸保守取代的密码子。
用于整合进宿主基因组的其它通用技术包括，例如设计为可以促进与宿主基因组进行同源性重组的体系。这些体系典型地依赖待表达核酸的侧翼序列，该序列与宿主细胞基因组内的目标序列充分同源，发生了载体核酸与目标核酸的重组，并导致送递的核酸被整合进宿主基因组内。本领域技术人员已知这些体系和方法对促进同源重组而言是必需的。
如上所述，可以借助于药学可接受载体给予该组合物，并且通过本领域技术人员所熟知的多种机理(如裸NDA的摄取、脂质体融合、借助于基因枪的DNA肌肉内注射、胞吞作用等)以体内和/或体外方式将该组合物送递至受试者细胞中。如果应用的是体外方法，可以根据本领域技术人员所熟知的标准操作方法将细胞或组织移出并维持在体外。借助于任何基因转移机理，例如磷酸钙介导的基因送递、电穿孔、微注射或蛋白磷脂体法，均可以将该组合物导入细胞中。继而可以根据细胞或组织类型经由标准方法将该转导细胞注入(如在药学可接受载体中)或等位移植回受试者体内。将多种细胞移植或注入受试者体内的标准方法是已知的。
该抑制剂可以任意有效抑制CaMKII活性或量的剂量给药。如上文所指出的，对CaMKII活性或量的减少的检测在从业医师的技能范围内。更具体而言，该抑制剂的给药剂量为每公斤体重大约0.05mg到大约5.0mg。可选的，该抑制剂的给药剂量为每公斤体重大约0.3mg到大约3.0mg。
下述实施例的描述是为本领域普通技术人员提供了完整的公开内容，以及如何制备并评定此处要求保护的组合物和/或方法的说明书，这些实施例仅为本发明的例证，并未对本发明者所认定的本发明范畴构成限制。发明者已努力确保数字(如数量、温度等)的准确性，但仍然存在某些误差和偏差。下述实施例中更为具体地描述了本发明，由于其中出现的多处改动及变化对本领域技术人员而言将是显而易懂的，因此这些实施例仅具有说明性。
实施例AC3-I转基因小鼠该AC3-I小鼠是以用于AC3-I的肽序列为基础进行的小基因合成而得以制备的(图1)。编码AC3-I(KKALHRQEAVDCL)的‘小基因’、2CaMKII抑制肽均是采用这些互补寡核苷酸构建的(SEQ ID NO1)GATCAAAAAAGCCCTTCACCGCCAGGAGGCAGTTGACTGCCTTGCTTTTTTCGGGAAGTGGCGGTCCTCCGTCAACTGACGGAACGCTAG，同样采用下列互补寡核苷酸构建用于相关无活性对照肽AC3-C(KKALHAQERVDCL)的小基因(SEQ ID NO7)GATCAAAAAAGCCCTTCACGCACAGGAGCGCGTTGACTGCCTTGCTTTTTTCGGGAAGTGCGTGTCCTCGCGCAACTGACGGAACGCTAG将该小基因与EGFP框内插入在pEGFP-C1(Clontech)的BspEI位点，使得EGFP位于该肽的N末端。该AC3-I小基因包括Kozak共有序列翻译起始位点。继而进行测序并在HEK293细胞中表达，显示出绿色荧光。早前的研究指出AC3-I-GST-MTS融合肽保留了对合成CaMKII底物(AC3-I-GST-MTS IC50＝0.4μM；AC3-I IC500.5μM)的全部CaMKII抑制效力，表明AC3-I-GFP蛋白质也保留了CaMKII抑制活性。继而采用PCR扩增800bp AC3-I-GFP序列，对扩增产物进行纯化并将其亚克隆进含有α-MHC启动子载体(GenBank编号U71441)和人类生长激素(HGH)多聚腺苷酸尾部(由Dr.J.Robbins研发)的pBluescript载体的SalI位点。通过测序及在鼠科动物心房肿瘤细胞系(HL1)中表达并显示出绿色荧光便可验证该构建体。在Vanderbilt转基因小鼠核心设施内将鼠科动物胚胎干细胞连同线性化的DNA(2ng/ml)注射并移植进B6D2伪孕雌性小鼠体内。
当于显微镜下检视组织切片时，AC3-I与绿色荧光蛋白(GFP)相连可以显示出遍及心脏的同源表达。这些AC3-I小鼠是存活的，并且具有正常的基础心脏尺寸和功能(图2)。不过，这些小鼠的心脏所具有的总心脏CaMKII活性显著降低(图3(A))了，并且与野生型同窝出生小鼠对照相比，在心肌梗塞实验之后，这些小鼠的心脏功能损伤显著地较少(图3(B))。这些发现表明CaMKII活性是心肌梗塞后心脏功能障碍的一个新信号，并且也是我们要求保护的通过抑制CaMKII治疗心肌梗塞受试者的方法的基础。
AC3-I+/CAN+转基因小鼠采用图9所示方法步骤杂交繁殖双重转基因小鼠。为了对第一代进行基因分型，于小鼠3周龄时进行尾部活检，并于55℃，在含有0.5Mg/ml蛋白酶K、50mM Tris(pH8.0)、100mM EDTA和0.5％SDS的溶液中培养过夜。在采用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)进行两次提取后，采用等体积的异丙醇沉淀基因组DNA。于50μl含有2.5μg RNA酶A的1/10TE(pH8.0)溶液中溶解DNA。采用EcoRI完全消化15μg的基因组DNA，并于1xTAE中，采用0.8％琼脂糖凝胶分离已消化的DNA。电泳后，于0.25N HCl中温育凝胶30分钟，于0.5M NaOH-1.5M NaCl中进行15分钟的中和反应两次，并于0.5M Tris-1.5M NaCl中平衡两次各15分钟。在MSI尼龙转移膜(Micron separations Inc.Westborought，MA)上使凝胶印迹过夜，并对该滤膜进行紫外交联。由随机寡核苷酸所引发(Stratagene，La Jolla，CA)的32P标记的GFP-AC3I或GFP-AC3C DNA片段作为探针。在50％甲酰胺、5xSSPE、5xDenhardt溶液、0.1％SDS和100μg/ml变性、破碎的鲑鱼精子DNA存在的条件下，于42℃进行杂交过夜。于65℃，在0.5xSSC-0.1％SDS中洗涤滤膜30分钟，继而于65℃，在0.1％SSC-0.1％SDS中洗涤20分钟两次。将该滤膜曝光到Kodak放射自显影底片上并使其显影。
对第一代之后的转基因小鼠的常规筛选是通过PCR进行的(见图9)。有两个引物适用于扩增位于人类生长激素(hGH)基因3’末端的442-bp区。这两个引物的序列为5’-Hgh(5’-(SEQ ID NO9)GTCTATTCGGGAACCAAGCT-3’)和3’-Hgh(5’-(SEQ ID NO10)ACAGGCATCTACTGAGTGGACC-3’)。将100ng的已纯化基因组DNA与200pM的每种引物混合，并根据下述步骤进行扩增95℃下5分钟，继而进行30个包括95℃下45秒、50℃下45秒、72℃下1分钟的循环，最后于72℃下进行最后7分钟的延伸。在0.5μg/ml溴化乙锭存在条件下，将所有样品上样于1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，并于紫外光照射下目测染色的DNA条带。新的引物组是针对杂种繁殖的双重转基因小鼠(图9)研发的，并且可用于区分双重和单一转基因动物。
超声心动图超声心动图是采用Hewlett Packard Sonos5500(完全针对鼠科动物的研究)以及特别研制的12MHz探针进行的。心脏尺寸获得自2维导向的M模式图像，并采用前沿方法，通过封闭、独立读数器取短轴和胸骨长轴面离线读数。采用戊巴比妥(15mg/Kg，i.p.)便可容易地使动物镇静；不过也可以无需麻醉地进行测量，其中小鼠需要经历一个短暂的‘训练’期以适应整个过程。可以将大约90％的小鼠训练得可以承受超声心动图研究，而不产生麻醉的心脏抑制效应。将来自LV后壁(LVPW)、室间隔(IVS)和LV内径(LVID)的3次连续搏动进行平均获得测定值。射血分数缩短(FS)被用于评估心脏收缩功能，并且可以根据公式FS＝(LVID心脏舒张期-LVID心脏收缩期)/LVID舒张期x100计算出来。
心肌梗塞外科手术该外科手术是在Vanderbilt小鼠生理学核心实验室中进行的，并且与其它已发表的报导基本一致188。14简言之，麻醉小鼠(戊巴比妥33μg/g和氯胺酮33μg/g，i.p.)，将其置于啮齿类动物呼吸器(潮气容积0.5ml，速率120次呼吸/分钟)上，采用左胸骨旁开胸术将其胸腔打开，并采用8-0缝合线将左前降枝动脉中部区域缝合。闭合胸腔(5-0缝合线)，并将该动物断离呼吸器。通过增加的肺部湿干重可以确定野生型小鼠典型地出现心力衰竭。假手术省略结扎步骤。大约75％的存活动物通过外科手术成功地具有了梗塞的前壁。
CaMKII活性分析CaMKII活性是采用我们之前公开的方法1，在AC3-I小鼠和同窝出生小鼠对照中，采用具有对CaMKII比对CaMKIV超过约50倍选择性的syntide 2这种合成底物，从完整心脏(心室)匀浆物中进行分析获得的。
扩张性心肌病在通过抑制CaMKII对扩张性心肌病进行的预防中获得了引人注目的数据。制备了表达与AC3-C(AC3-I的一种无活性同源物)相连的GFP的对照转基因小鼠。该小鼠便出现了在AC3-I-GFP小鼠中不存在的相当严重的扩张性心肌病，并具有非常高水平的CaMKII活性(图5)。
贯穿本申请，参考了多种出版物。为了更为完整地描述本发明所属领域的状况，此文将这些出版物的公开内容完整引入该申请中，作为参考。
对本领域技术人员而言，应当清楚的是本发明可以进行多种改动和变化，并不偏离本发明的范畴和实质。考虑到本发明此处所公开的说明书及实践，本发明的其它实施方案对本领域的技术人员而言将是显而易懂的。该说明书和实施例仅为例证，本发明的真实范畴及实质由下述权利要求指明。
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序列表<110>范德比尔特大学M.安德森<120>用钙调蛋白激酶II抑制剂治疗结构性心脏病中的心肌功能障碍<130>22000.0117P1<140>PCT/US02/31496<141>2002-10-01<150>60/328,010<151>2001-10-08<150>60/326,576<151>2001-10-01<160>10<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>90<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明；注释＝合成构建体<400>1gatcaaaaaa gcccttcacc gccaggaggc agttgactgc cttgcttttt tcgggaagtg60gcggtcctcc gtcaactgac ggaacgctag 90<210>2<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明；注释＝
合成构建体<400>2Lys Lys Ala Leu His Arg Gln Glu Ala Val Asp Cys Leu1 5 10<210>3<211>255<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明；注释＝合成构建体<400>3cggctcccct gctgagctag ggccggtccg gcagtcagcc tctgcccgtg ccccgccgca60gtccctagcc cgcccggtgc ccgccgcctg caggacacca actccttctt cgctggcaac120caggccaagc ggccccccaa gctgggccag atcggccgag ccaagagagt ggtgatcgag180gatgaccgga tagacgacgt gctgaagggg atgggggaga agcctccgtc cggagtgtag240acgcgccggc tctgg 255<210>4<211>79<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明；注释＝合成构建体<400>4Met Ser Glu Ile Leu Pro Tyr Gly Glu Asp Lys Met Gly Arg Phe Gly1 5 10 15Ala Asp Pro Glu Gly Ser Asp Leu Ser Phe Ser Cys Arg Leu Gln Asp20 25 30Thr Asn Ser Phe Phe Ala Gly Asn Gln Ala Lys Arg Pro Pro Lys Leu35 40 45Gly Gln Ile Gly Arg Ala Lys Arg Val Val Ile Glu Asp Asp Arg Ile50 55 60Asp Asp Val Leu Lys Gly Met Gly Glu Lys Pro Pro Ser Gly Val65 70 75<210>5
<211>129<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明；注释＝合成构建体<400>5aagcggcccc ccaagctggg ccagatcggc cgagccaaga gagtggtgat cgaggatgac 60cggatagacg acgtgctgaa ggggatgggg gagaagcctc cgtccggagt gtagacgcgc120cggctctgg129<210>6<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明；注释＝合成构建体<400>6Lys Arg Pro Pro Lys Leu Gly Gln Ile Gly Arg Ala Lys Arg Val Val1 5 10 15Ile Glu Asp Asp Arg Ile Asp Asp Val Leu Lys20 25<210>7<211>90<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明；注释＝合成构建体<400>7gatcaaaaaa gcccttcacg cacaggagcg cgttgactgc cttgcttttt tcgggaagtg60cgtgtcctcg cgcaactgac ggaacgctag 90<210>8<211>13<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明；注释＝合成构建体<400>8Lys Lys Ala Leu His Ala Gln Glu Arg Val Asp Cys Leu1 5 10<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明；注释＝合成构建体<400>9gtctattcgg gaaccaagct 20<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明；注释＝合成构建体<400>10acaggcatct actgagtgga cc 2权利要求
1.钙调蛋白激酶II抑制剂在鉴定可以治疗结构性心脏病的化合物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述结构性心脏病可以是扩张性心肌病或心肌收缩功能障碍中的至少一种。
全文摘要
本发明提供了一种治疗受试者结构性心脏病的方法，该方法包括给予受试者有效量的一种CaMKII抑制剂，通过该抑制剂的给药可以治疗受试者的结构性心脏病。本发明也提供了用于治疗结构性心脏病的转基因动物模型。本发明进一步提供了筛选可以治疗结构性心脏病的化合物的途径。
文档编号A61P9/00GK1840186SQ20061000445
公开日2006年10月4日 申请日期2002年10月1日 优先权日2001年10月1日
发明者M·安德森 申请人:范德比尔特大学