TBST2:Tris 3.0275g，NaCl 4.38g，Tween200.5mL，HC1 调 pH 至 7.5，定容至 500mL
[0049]ECL显色法中使用的试剂盒为:B1-Rad#1705061 ；
[0050]BCA法测定提取样品的蛋白浓度使用的试剂盒为Thermo#23225 ；
[0051]蛋白质免疫沉淀试验中使用的试剂盒:Thermo#26146。
[0052]本发明提供一种钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，包括:
[0053]步骤一、将含有f丐蛋白酶的蛋白样品的蛋白浓度调至5.83?12.5 μ g/ μ 1，之后向其中加入磷酸化抗体，所述磷酸化抗体与所述含有钙蛋白酶的蛋白样品中的蛋白的总反应量的质量比为1:1750?2500，然后将含有钙蛋白酶的蛋白样品与磷酸化抗体于4°C下震荡孵育，以形成免疫复合物，再通过蛋白质免疫沉淀方法富集得到磷酸化的钙蛋白酶样品；以及，
[0054]步骤二、通过蛋白质免疫印迹方法检测所述步骤一中得到的所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平。
[0055]在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，通过蛋白质免疫沉淀方法富集得到所述磷酸化的钙蛋白酶样品的具体步骤包括:
[0056]1.1)取Protein A/G琼脂糖树脂楽液并使其吸附在离心柱上，其中，所述ProteinA/G琼脂糖树脂浆液与所述钙蛋白样品的体积比为2?3:40?60，且每个离心柱内加入的所述Protein A/G琼脂糖树脂浆液的体积为20-30 μ 1 ;
[0057]1.2)将所述免疫复合物加入经过步骤1.1)处理后的吸附有所述Protein A/G琼脂糖树脂的所述离心柱中，并于4°C恒温震荡孵育lh，之后离心，然后使用IP洗涤缓冲液洗涤所述Protein A/G琼脂糖树脂三次，再用IP条件缓冲液洗涤所述Protein A/G琼脂糖树脂一次，最后所述离心柱上截留的即为钙蛋白酶、磷酸化抗体和Protein A/G琼脂糖树脂的三元复合物；和，
[0058]1.3)向步骤1.2)中截留有所述三元复合物的所述离心柱中添加还原性上样缓冲液，并于100°C下孵育5min，冷却后在室温下lOOOOXg离心lmin，所得的流穿液体即为富集的所述磷酸化的钙蛋白酶样品。
[0059]在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平过程中，与所述钙蛋白酶反应的第一抗体采用μ -calpain单克隆抗体，所述第一抗体的浓度为1.4-2 μ g/ml。
[0060]在上述方案中，作为优选，所述步骤二中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平过程中，与所述第一抗体结合的第二抗体采用ant1-mouse IgG，所述第二抗体的浓度为 0.1-0.3 μ g/mlo
[0061]在本发明的其中一个实施例中，作为优选，在所述步骤一之前还包括提取所述含有I丐蛋白酶的蛋白样品的方法:
[0062]采集动物肌肉样品，并按照质量体积比1:6将所述动物肌肉样品加入组织裂解液或者肌浆抽提液中，将所述动物肌肉样品和所述组织裂解液于冰上匀浆至所述动物肌肉样品和所述组织裂解液形成均一的匀浆液，然后将所述匀浆液于4°C下离心收集上清液即得到所述含有钙蛋白酶的蛋白样品；且所有步骤均在冰上操作或冰浴操作；
[0063]其中，所述组织裂解液包含浓度为25mM的N- 二甘氨酸和150mM的氯化钠，所述组织裂解液的pH为7.6 ;
[0064]所述肌浆抽提液包含浓度为lOOmM的Tris base、10mM的EDTA和0.05%的巯基乙醇，所述肌浆抽提液的pH为8.3。
[0065]在上述方案中，作为优选，所述组织裂解液中还包含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，且所述磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂均需现用现加；
[0066]所述匀浆过程在冰上共进行30s，且每次匀浆时间为10s，每两次匀浆之间间隔20so
[0067]在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，所述磷酸化抗体和所述含有该蛋白酶的蛋白样品的总体积为400-600 μ 1，所述含有钙蛋白酶的蛋白样品中蛋白的总反应量为3500-5000 μ go
[0068]在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，所述磷酸化抗体的浓度为0.2-0.3 μ g/ μ 1，所述磷酸化抗体采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸泛抗单克隆抗体。
[0069]在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，所述含有钙蛋白酶的蛋白样品与磷酸化抗体于4°C下震荡孵育2_14h，以形成所述免疫复合物。
[0070]在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述动物肌肉样品取自羊。
[0071]下述实施例均采用Neofuge 15R型台式高速冷冻离心机、B1-Rad单向电泳系统和B1-Rad湿法转膜仪。
[0072]实施例1
[0073]a)取部分-80°C保存的羊背最长肌样品制备组织裂解物，BCA法测定蛋白浓度；
[0074]b) SDS-PAGE电泳:采用8 %的分离胶和4%的浓缩胶(Acr:Bis = 37.5:1)，凝胶的每孔均加入50 μ g蛋白样品；电泳初始参数设置为70V，当蛋白条带完全进入分离胶后将电压设置为110V继续进行电泳，直至溴酚蓝染料迀移至胶底边缘后结束电泳；
[0075]c)蛋白质免疫印迹(IB):电泳结束后卸下胶板，将凝胶放入转膜缓冲液中平衡；PVDF膜裁剪至凝胶大小后用纯甲醇活化15s，与准备好的转膜专用滤纸一起放入转膜缓冲液中平衡；以湿法转膜技术，在100V下冰浴lOOmin，使得凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上；转膜结束后，用TBS缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次lmin ;
[0076]将PVDF膜放入裁剪好的杂交袋中，加入5ml封闭液，室温下在摇床上震荡封闭lh ；
[0077]第一抗体简称一抗，一抗孵育:在5ml封闭液中加入Abeam公司的μ -calpain单克隆抗体(货号:ab49652)，浓度为1.4 μ g/ml ;更换杂交袋，将PVDF膜与配制好的一抗溶液4°C过夜孵育；
[0078]第二抗体简称二抗，二抗孵育:用TBST1缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次lOmin ;在5ml封闭液中加入Sigma公司的ant1-mouse IgG(货号为A9044)，浓度为0.1 μ 1/ml，作为二抗溶液与PVDF膜室温震荡孵育lh ;
[0079]用TBST2缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次lOmin，之后利用4-氯-1-萘酚显色法显色。
[0080]实施例2
[0081]a)取部分-80°C保存的羊背最长肌样品制备组织裂解物，BCA法测定蛋白浓度；
[0082]b) SDS-PAGE电泳:采用8%的分离胶和4%的浓缩胶(Acr:Bis = 37.5:1)，凝胶的每孔均加入50 μ g蛋白样品；电泳初始参数设置为70V，当蛋白条带完全进入分离胶后将电压设置为110V继续进行电泳，直至溴酚蓝染料迀移至胶底边缘后结束电泳；
[0083]c)蛋白质免疫印迹(IB):电泳结束后卸下胶板，将凝胶放入转膜缓冲液中平衡；PVDF膜裁剪至凝胶大小后用纯甲醇活化15s，与准备好的转膜专用滤纸一起放入转膜缓冲液中平衡；以湿法转膜技术，在100V下冰浴lOOrnin，使得凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上；转膜结束后，用TBS缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次lmin ;
[0084]将PVDF膜放入裁剪好的杂交袋中，加入5ml封闭液，室温下在摇床上震荡封闭lh ；
[0085]—抗孵育:在5ml封闭液中加入Abeam公司的μ-calpain单克隆抗体(货号:ab49652)，浓度为1.4 μ g/ml ;更换杂交袋，将PVDF膜与配制好的一抗溶液4°C过夜孵育；
[0086]二抗孵育:用TBST1缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次lOmin ;在5ml封闭液中加入Sigma公司的ant1-mouse IgG (货号为A9044)，浓度为0.1 μ 1/ml，作为二抗溶液与PVDF膜室温震荡孵育lh ;
[0087]用TBST2缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次lOmin，ECL显色法曝光显色。
[0088]实施例3
[0089]a)取出-80°C下保存的肌肉样品，冷冻状态下称取0.5g，切成小块状后装至离心管中；
[0090]b)加入6倍体积的肌浆抽提液(lOOmM Tris base, 10mM EDTA，0.05%巯基乙醇，ρΗ8.3)，冰上匀浆30s (每匀浆10s间隔20s)；
[0091]c)匀浆液在低温4°C离心机中10，OOOXg离心35min ；
[0092]d)撇去上层脂肪层后取上清液分装；
[0093]e)蛋白质定量:BCA法，测定浓度后于_80°C保存备用；
[0094]f) SDS-PAGE电泳:采用8 %的分离胶和4%的浓缩胶(Acr:Bis = 37.5:1)，凝胶的每孔均加入50 μ g蛋白样品；电泳初始参数设置为70V，当蛋白条带完全进入分离胶后将电压设置为110V继续进行电泳，直至溴酚蓝染料迀移至胶底边缘后结束电泳；
[0095]g)蛋白质免疫印迹(IB):电泳结束后卸下胶板，将凝胶放入转膜缓冲液中平衡；PVDF膜裁剪至凝胶大