无乳链球菌单克隆抗体及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种无乳链球菌单克隆抗体及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 罗非鱼是原产于非洲的热带鱼类，上世界七八十年代我国多次从国外引种，并选 育出长势快、产量高、抗病力强的品种，此后迅速成功推广养殖。目前，我国不仅是世界上最 大的罗非鱼养殖生产国，也是最大的罗非鱼出口国。国内罗非鱼养殖集中在广东、海南、广 西、福建等南方地区。2009年开始在罗非鱼养殖密集区先后暴发罗非鱼"突眼症"，该病来 势凶猛，发病率高达35%，发病鱼死亡率接近100%，且病害持续时间长，药物防治难以控 制病情，养殖户损失惨痛。
[0003] 及时准确的发现和诊断病原，是成功预防和治疗罗非鱼链球菌病的前提。目前，对 于无乳链球菌的诊断，主要采用（1)分子生物学的方法，如PCR法进行诊断，该类方法依赖 于贵重的仪器设备和专业的技术人员，检测时间长达4-6个小时，非常不利于在基层推广 运用。（2)常规的分离培养法，依赖于专业操作人员的显微镜形态判断，容易造成误判，此类 方法的培养时间长达18-24个小时，也不适用于无乳链球菌的快速检测。
【发明内容】
[0004] 为了解决前述问题，本发明提供了一种新的无乳链球菌单克隆抗体及其制备方 法。
[0005] 本发明首先提供了一种产生无乳链球菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，它是由中国 典型培养物中心（CCTCC)保藏的保藏号：CCTCC NO. C2015178的细胞株。
[0006] 本发明表达单抗NC7b的细胞株，于2015年10月21日保藏在中国典型培养物中 心（CCTCC)，其地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏号为：CCTCC NO. C2015178。
[0007] 本发明提供了前述杂交瘤细胞株的方法，它包括如下步骤：
[0008] (1)以氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示重组蛋白为抗原，接种BALB/c小鼠，分离小 鼠脾细胞；
[0009] (2)取小鼠脾细胞，与骨髓细胞融合，筛选，即可。
[0010] 本发明提供了一种无乳链球菌单克隆抗体，它是由前述细胞株分泌的单克隆抗 体。
[0011] 本发明提供了前述单克隆抗体的方法，它包括如下步骤：
[0012] 1)取前述杂交瘤细胞株，注射入BALB/c小鼠腹水中增殖；
[0013] 2)收集腹水，使用Protein G Sepharose亲和层析柱纯化，即可。
[0014] 本发明提供了前述无乳链球菌单克隆抗体在检测无乳链球菌中的用途。
[0015] 本发明提供了前述无乳链球菌单克隆抗体在制备检测无乳链球菌的试剂中的用 途。
[0016] 本发明提供了前述无乳链球菌单克隆抗体在制备检测无乳链球菌的胶体金快速 检测试纸中的用途。
[0017] 优选地，待检样本为养殖水体或者鱼体。
[0018] 本发明还提供了 SEQ ID NO. 1所示重组蛋白。
[0019]采用本发明制备得到了无乳链球菌Sip单抗NC7b，其本身的特异性强，仅与无乳 链球菌结合，而与其他细菌无交叉反应，滴度高，结合能力强，采用该蛋白制备的无乳链球 菌检测试纸灵敏度高、特异性强、重复性好，能准确检测实际样品，可以有效解决现有无乳 链球菌检测存在复杂、不准确的问题，应用前景良好。
[0020] 在本抗体制备的试纸成功研制之前，国际上尚无针对无乳链球菌的快速检测试纸 的报道。从已有文献来看，研制该试纸所需要的生物材料非常难以制备和获取。因此，成功 研制由本抗体制备的试纸在世界上尚属首次，处于世界领先水平。
[0021] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0022] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0023] 图1本发明单抗的纯化结果；
[0024] 图2水产常见细菌免疫印迹结果。1-A第一抗体：NC7b ;1_B第一抗体：CE12;
[0025] 图3试纸的结构，1 :PVC底板；2:硝酸纤维素膜；3:胶体金垫；4:吸水垫；5:检测 线；6 :质控线；7 :样品塾；
[0026]图 4 灵敏度检测结果。1 :6X101QCFU/ml ;2 :6X109CFU/ml ;3 :6X10sCFU/ml ;4: 6X107CFU/ml ;5 :6X106CFU/ml ;C Line:质控线；T Line:检测线；
[0027] 图5试纸条的特异性测试；
[0028] 图6发病鱼组织及水体的检测结果。
【具体实施方式】
[0029] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照试剂盒 说明书选择。
[0030] 实验材料：
[0031]细菌：无乳链球菌TW3用于克隆和制备重组抗原，无乳链球菌（ATCC 51487)、无乳 链球菌C918 (牛源）、无乳链球菌TW7 (鱼源）、无乳链球菌TW10 (鱼源）、鮰爱德华氏菌、粪肠 球菌、海豚链球菌、豚鼠气单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧 菌、嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、腐败希瓦氏菌、肺炎克雷伯氏菌、 幽门螺杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、奇异变形杆菌、热带念珠菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏 菌、粘质沙雷氏菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌、弗氏柠檬酸杆菌、绿脓杆菌、溶血葡萄球菌、 鲍曼不动杆菌和淋病柰瑟氏菌由通威股份动物保健研究所保存。
[0032] 实施例1本发明抗无乳链球菌Sip单抗NC7b的制备
[0033]1、杂交瘤制备
[0034] 1. 1重组抗原的制备
[0035] 1)基因克隆。用Promega公司的DNA提取试剂盒提取无乳链球菌TW3的基因组 DNA，根据无乳链球菌sip基因（罗非鱼源，HQ878436. 1，Genbank)，设计如表1所示的引物， 上下游引物分别包含BamH I和Sal I限制性内切酶位点。采用设计的引物对扩增sip基 因，扩增条件如下：DNA 94°C预变性5min后，设置程序94°C、30s，55°C、35s和72°C、78s，共 30个循环；然后72°C延伸lOmin。
[0036] 2)转化、表达与纯化。将扩增后的sip DNA连接到pET32a载体上，该载体含有编 码六聚组氨酸的序列。用pET32a-sip转化大肠埃希氏菌BL21。转化子在含有100yg/mL 卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养。加入0. 8mM异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG) 并于37°C再培养5h，以表达带六聚组氨酸标签的重组Sip (rSip)。超声震荡提取含有rSip 的可溶部分，然后使用IMAC亲和层析柱进行纯化和洗脱，并使用二喹啉甲酸检测试剂盒 (Sigma-Aldrich)测定蛋白浓度。
[0037] 表1用于表达sip基因的引物增子（~1302bp)
[0038]
[0039] 3)电泳和免疫印迹。对纯化的rSip进行SDS-PAGE电泳（凝胶浓度12% )，考马 斯亮蓝染色或免疫印迹来显示蛋白质条，同时使用针对无乳链球菌的多抗，以检测rSip的 活性。
[0040] 用蛋白rSip作为生产单抗的免疫原和ELISA检测中的抗原，rSip的氨基酸序列 (SEQ ID NO. 1)如下：
[0041] MEMNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAQETDTTWTARTVSEVKADLVKQDNKSSYTVKYGDTLSVISEAMS IDMNVLAKINNIADINLIYPETTLTVTYDQKSHTATSMKIETPATNAAGQTTATVDLKTNQVSVADQKVSLNTISEG MTPEAATTIVSPMKTYSSAPALKSKEVLAQGQAVSQAAANEQVSPAPVKSITSEVPAAKEEVKPTQTSVSQSTTVSP ASVAAETPAPVAKVAPVRTVAAPRVASVKVVTPKVETGASPEHVSAPAVPVTTTSTATDSKLQATEVKSVPVAQKAP TATPVAQPASTTNAVAAHPENARLQPHVAAYKEKVASTYGVNEFSTYRAGDP⑶HGKGLAVDFIVGKNQALGNEVAQ YSTQNMAANNISYVIWQQKFYSNTNSIYGPANTWNAMPDRGGVTANHYDHVHVSFNo
[0042] 1. 2免疫程序
[0043] 用经弗式完全佐剂（Sigma-Aldrich)乳化（乳化方法：将抗原和弗氏完全佐剂等 体积混合，吸入一支注射器内，取下注射器针头，用软管连接另一支注射器，扎带固定好软 管，轮流推动两支注射器，使混合液通过软管在注射器之间来回流动，从而达到乳化目的） 的25 μ g，50 μ g，100 μ g和150 μ g rSip蛋白分别腹腔注射雌性BALB/c小鼠（8周龄）。4 和8周后，用经弗式不完全佐剂（Sigma-Aldrich)乳化的相同抗原再次注射（乳化及注射 剂量同前）小鼠。第10周，最后单独腹腔注射rSip蛋白（注射剂量同前）一次。
[0044] 1. 3杂交瘤产生和针对Sip蛋白的单抗生产
[0045] 最后一次加强注射后三天，获取免疫小鼠脾细胞（分离方法：取高免BALB/c小鼠， 拉颈处死后，于75%酒精中浸泡3~5min，无菌操作打开腹腔，并小心取出脾脏至于平皿 中，加入少量DMEM基础培养基漂洗2~3次，并仔细去除脾脏周围的结缔组织。然后在另 一培养皿中倒入无血清将铜网盖于其上，取脾脏于铜网上，用研磨棒轻轻研磨，待细胞释放 完全后，收集脾细胞，lOOOrpm离心10min)。根据Situ和Wu描述的方法：用50% (w/v)聚 乙二醇4000 (Sigma-Aldrich)，将脾细胞和骨髓瘤细胞S/P20以5:1的比例进行融合（细 胞融合的步骤：S/P20细胞由成都中医药大学饶朝龙教授惠赠。融合步骤：取对数生长期 的S/P20细胞与脾细胞按比例充分混匀，lOOOrpm离心10min，弃上清液，用手掌轻击离心瓶 底，打散沉淀的细胞。将离心瓶置于40°C水浴中，在lmin内边旋转边加入lml PEG4000,再 加入15ml无血清RPMI-1640培养基终止融合，在90s内加完，由慢到快，前5s加lml。室 温静置10min，1000rpm离心10min，弃上清，将含HAT和15%胎牛血清的1?^1-1640培养基 加到细胞融合物中，悬浮细胞，分配到已有饲养细胞的96孔细胞培养板，置于37°C、5% C02 的温箱中培养），得到杂交瘤细胞。
[0046] 筛选步骤1 :
[0047] 将得到的杂交瘤细胞在次黄嘌呤-氨蝶呤-胸苷培养基中培养，以5μg/ml的 rSip作为包被抗原，用ELISA检测培养上清中的抗体，以筛选杂交瘤细胞，得到ELISA鉴定 为阳性的杂交瘤细胞。
[0048] 筛选步骤2:
[0049] 将ELISA鉴定为阳性的杂交瘤细胞于BALB/c小鼠腹水中增殖。收集腹水，使用 Protein G Sepharose 亲和层析柱（GE Healthcare Life Sciences)纯化（纯化方法：用 注射器穿刺吸取小鼠腹水，在4°C，12000g条件下离心15min除去较大的凝块。将处理好的 腹水用〇. 02M pH 7. 0的PBS缓冲液稀释10倍，0. 45 μ m滤膜过滤，然后上样流经0. 02M pH 7. 0的PBS缓冲液平衡好的蛋白G亲和层析柱。用0. 1M pH 2. 7的Gly-HCl为洗脱液进行 洗脱，收集洗脱峰，并用