专利名称:一种乳酸片球菌菌株和乳酸片球菌素的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种乳酸片球菌菌株和乳酸片球菌素的生产方法。
技术背景由于人们对食品安全性的认识和要求日益提高，化学防腐剂的应用受到严峻挑战，日本等国家已禁止使用苯甲酸(钠)，欧盟则禁止其用于儿童食品，我国也提出了限用要求。食品防腐剂的天然化已成为防腐剂技术的发展趋势，开发抗菌性强、安全无毒的天然食品防腐剂已成为各国科技工作者的研究热点；特别是利用现代生物技术生产天然食品添加剂，不仅可以大幅度的提高生产能力，克服自然界植物、动物的生产周期长、效率低的缺点，而且还可以生产一些新型的生物防腐剂，如乳酸链球菌素(Nisin)、聚赖氨酸、纳他霉素、曲酸、溶菌酶、枯草杆菌素(Subtilin)等。
乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)属于片球菌属，好氧性菌，最适温度30～37℃，能在pH4～8范围内生长。乳酸片球菌素(Pediocin)是由乳酸片球菌产生的一种短肽抗菌素。乳酸片球菌素(Pediocin)与乳酸链球菌素(Nisin)的物理化学性质和用途类似，耐高低温、耐酸、在人体中可降解，因此安全无毒，且方便使用。
目前，国外文献和专利中产乳酸片球菌素(Pediocin)的菌株来源主要是从人的粪便或猪的肠内壁中提取，如专利(EP1633378A2，US2006165661A1)公开的技术，对抑菌机理也给予了揭示(Marrugg et al，Appl.Environ.Microbiol.，1992；Henderson et al，Arch.Biochem.Biophys.，1992；Venema，et al，Mol.Microbiol.，1995；Chen et al，Appl.Environ.Microbiol.，1997；Beaulieu et al，Protein.Expres.Purif.，2005)。培养基方面，主要使用MRS培养基、TGE培养基和食品加工废水等(Leroy et al，Appl.Environ.Microbiol.，2001；Guerra et al，Process Biochem.，2005)。但与Pediocin发酵和代谢调控方面的研究以及片球菌素工业化的报道很少。在发酵策略方面，主要采用间歇发酵方式，而最近几年出现的少数流加发酵方式，其策略比较单一，主要采用单一的降低pH策略(Guerra et al，Lett.Appl.Microbiol.，2003)和单一的pH循环策略(Guerra et al，Process Biochem.，2005)等，使得菌体得不到大量增殖，而片菌素的产量也无法得到显著提高。
国内专利方面，目前只有美国罗狄亚公司申请的专利“用于控制食品应用中的革兰氏阳性菌的抗菌组合物”(公开号CN 1370055A)，该专利只是将几种细菌素组合起来，以期达到较强的抗菌效果，没有涉及到Pediocin的生产。国内论文方面，只有天津大学周志江报道过利用片球菌生产Pediocin(周志江，食品科学，2007，27(4))，但其菌种是从酸白菜中筛选得来的，而且对菌株的分类和发酵工艺也没有报道。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一株新的一种乳酸片球菌菌株和乳酸片球菌素(Pediocin)的生产方法，以满足有关方面的需要。
本发明所说的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)LH31是从自牛初乳中筛选得到(筛选方法可以采用美国专利US2006165661A1公开的方法)，该乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，已经在2007年2月3日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M207013。
本发明的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)LH31 CCTCC M207013的菌学特性如下菌体形态片球菌LH31为革兰氏染色阳性，在改良的MRS培养基中30℃培养6小时，经结晶紫染色后，在光学显微镜下(1000×40)下观察，细胞呈球形或不规则球形，单菌、四联或成片状排列，菌体直径约为0.5～2μm。
菌株特点
在改良的固体MRS培养基平板中制作LH31单菌落。30℃培养24小时后，其菌落特点表现为菌落较小，一般为1～4mm，园形隆起，表面光滑，边缘整齐光滑，呈乳白色或灰白色。在添加了CaCO3的改良MRS固体培养基上能产生溶解圈。
将LH31的单菌落接种至改良的MRS培养基中，28～38℃、200转/分培养6h，检测吸光度，菌体密度(OD600nm)可达1.5～5.0，发酵液呈白色或乳白色，且菌体易沉淀至发酵液底部。
16SrRNA同源性比较16SrRNA同源性比较鉴定菌株PCR采用通用引物27f(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)和1541R(5’AAGGAGGTGATCCAGCC3’)。PCR反应体系总体积100μl，含10μl10×PCR缓冲液，8μl dNTP(每种浓度为2.5mmol/L)，1.0μl TaqDNA聚合酶(5u/μl)，2μl模板，20pmol引物，用无菌水补体积至100μl。反应条件94℃变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸100s，30个循环，72℃延伸5min。PCR产物电泳纯化并测序，测序结果如序列SEQ1所示SEQ1<110>华东理工大学<120>一种乳酸片球菌菌株和乳酸片球菌素的生产方法<130>
<160>1<170>
<210>1<211>907bp<212>RNA
<213>乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)<220>
<221>16SrRNA<400>1tgcctaatac atgcaagtcg aacgaacttc cgttaattga ttatgacgtg cttgcactga 60atgagatttt aacacgaagt gagtggcgga cgggtgagta acacgtgggc aacctgccca 120gaagcagggg ataacacctg gaaacagatg ctaataccgt ataacagaga aaaccgcctg 180gttttctttt aaaagatggc tctgctatca cttctggatg gacccgcggc gcattagcta 240gttggtgagg taacggctca ccaaggcgat gatgcgtagc cgacctgaga gggtaatcgg 300ccacattggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg agaagggttt cggctcgtaa 420aagctctgtt gttaaagaag aacgtgggtg agagtaactg ttcacccagt gacggtattt 480aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtc ttttaagtct aatgtgaaag 600ccttcggctc aaccgaagaa gtgcattgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaca 660gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tacatatatg gaagaacacc tgtggcgaag 720gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgagtagcg aacaggatta 780gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gattactaag tgttggaggg tttccgccct 840tcagtgctgc agctaacgca tcaagtaatc ctcctggtcg agtacgaccg caaggttgaa 900actcaaa 907用BLAST软件将测定序列与GenBank中的16SrRNA序列进行同源性分析比较。结果显示LH31与所报道的片球菌Pediococcus acidilacticiKLB69-2的同源性最高(98.7％的同源性)。根据菌株LH31的菌体形态和菌落特点，以及16SrRNA序列的同源性分析，表明本发明的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)LH31(CCTCC)M207013为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)属，但是，与同源性最近的KLB69-2的16SrRNA序列相比，其明显差异是110位的t替换为c、541位的g替换为t、553位的t替换为a、693位的g替换为c、711位的a替换为t、764位的g替换为a、862位的t替换为c、872位的g替换为t，多出555位t、564位a和873位c。
本发明的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)LH31(CCTCC)M207013可以用于生产乳酸片球菌素，生产方法包括如下步骤先将所说的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)LH31(CCTCC)M207013的单菌落接种在改良的MRS液体培养基中，28～40℃培养2～8小时活化，然后采用如下的步骤，将活化好的乳酸片球菌LH31接种在发酵罐中进行发酵培养发酵罐初始培养基为改良的MRS液体培养基，pH值为5.0～7.5，以培养基的体积计，接种量1％～5％，培养4～8h后开始补料，补料培养基为浓缩的TG培养基，流加速度为0.5～2.0ml/min，培养发酵至12～24h，将pH值调整为4.0～6.5周期性的变化，培养至24～30h时，将pH值维持3.0～5.0不变，再发酵培养2～6h，然后从发酵产物中收集乳酸片球菌素。
整个过程溶氧保持在10％～50％，温度保持为28～40℃。
所说的pH值调整为4.0～6.5周期性的变化指的是将pH控制方式由恒定值控制改为自然变化，即随着TG培养基流加的进行，菌体在生长的过程中会产生乳酸等副产物，导致pH值的下降，当pH值下降至4.0～5.0时，用无菌NaOH将pH值调回至6.5，此为一个周期。
经上述发酵培养，最终菌体浓度OD600达到23以上，片球菌素效价可达到1.8×104AU/ml以上。
发明人发现，培养基的组分和pH对菌体生长具有十分重要的影响因素，为此，发明人经过大量试验，提出了所说的改良的MRS液体培养基，其组分和浓度为蛋白胨0.5～10.0g/L，酵母粉0.5～5.0g/L，葡萄糖10.0～20.0g/L，牛肉膏0.5～10.0g/L，氨基酸粉2.0～8.0g/L，玉米浆0.5～10.0g/L，柠檬酸铵0.5～2.0g/L，乙酸钠2.0～6.0g/L，无水硫酸镁0.05～0.1g/L，无水硫酸锰0.01～0.05g/L，磷酸氢二钾0.5～2.0g/L，pH值为5.0～7.5；pH值可用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调节；其中，葡萄糖浓度优选15.0g/L，氨基酸粉浓度优选5.0g/L，乙酸钠浓度优选5.0g/L；所说的TG浓缩培养基组分和浓度为蛋白胨5.0～100.0g/L，葡萄糖5.0～150.0g/L，牛肉膏5.0～60.0g/L，氨基酸粉5.0～50.0g/L，磷酸氢二钾5.0～20.0g/L，无水硫酸镁0.5～1.0g/L，无水硫酸锰0.5～1.0g/L，Tween80 1.0～10.0g/L，pH值5.0～7.5。用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调节。
由上述公开的技术方案可见，采用本发明的菌种和方法生产乳酸片球菌素，与已有的报道相比，具有的明显优点和创新点是(1)在发酵的第一个阶段(0～12h)，发酵条件为经过改良的MRS培养基，大大提高了菌体的生长速率，能够得到较高的菌体量；(2)在发酵的第二个阶段(12～24h)，第一和第二个pH值变化周期可以明显启动片菌素的表达，第三个和后面的pH值变化周期，可以实现片菌素的大量表达；(3)在发酵的第三个阶段(24～30h)，在较低的pH值(3.0～5.0)范围内，片菌素的表达会继续维持在较高的水平，因此，片菌素的产量继续得到大量增加。将这三个阶段整合在一个发酵策略中，既能得到大量菌体，又能保证单位菌体量的片菌素的高效表达水平，因此，可以实现片菌素的工业化生产。
图1为乳酸片球菌LH31的菌体形态(1000×40倍)电镜照片。
图2为乳酸片球菌LH31单菌落照片。
图3为乳酸片球菌三段式流加发酵曲线图。
具体实施方式
下面通过实例对本发酵优化策略作进一步的说明，所列举的实例并不限制本发明的保护范围。
图1为乳酸片球菌LH31的菌体形态(1000×40倍)的电镜照片，在改良的MRS培养基中30℃培养6小时，经结晶紫染色后，在光学显微镜下(1000×40)观察，细胞呈球形或不规则球形，单菌、四联或成片状排列，菌体直径约为0.5～2μm。
图2为乳酸片球菌LH31单菌落照片，在改良的固体MRS培养基平板中制作LH31单菌落。30℃培养24小时后，其菌落特点表现为菌落较小，一般为1～4mm，园形隆起，表面光滑，边缘整齐光滑，呈乳白色或灰白色，在添加了CaCO3的改良MRS固体培养基上能产生溶解圈。
实施例1将乳酸片球菌LH31单菌落接种在改良的MRS液体培养基中，30℃、200转/分培养条件下培养8h活化；改良的MRS液体培养基组分和浓度为蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，葡萄糖15.0g/L，牛肉膏10.0g/L，氨基酸粉5.0g/L，玉米浆10.0g/L，柠檬酸铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，无水硫酸镁0.1g/L，无水硫酸锰0.05g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，pH值为6.5，pH值用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调节；将上述活化好的片球菌LH31接种在3.7L发酵罐中，以培养基的体积计，接种量为5％，发酵罐初始培养基为改良的MRS液体培养基，pH值为6.5；培养8h后开始补料，补料培养基为浓缩的TG培养基，流加速度为1.5ml/min；培养至发酵中后期时，即16h，将pH值调整为4.0～6.5周期性的变化，24h时停止这种变化；所说的pH值调整为4.0～6.5周期性的变化是指在第16小时，将pH控制方式由恒定值控制改为自然变化，第17小时时pH值降为4.0，此时将pH值用1mol/L的NaOH调为6.5；以后每一个小时进行一次这样的循环，直至24小时时停止这种变化。
发酵后期，即24h，将pH值维持4.0不变，然后发酵6小时，结束，从发酵产物中收集乳酸片球菌素。
所说的TG浓缩培养基组分和浓度为蛋白胨100.0g/L，葡萄糖150.0g/L，牛肉膏60.0g/L，氨基酸粉50.0g/L，磷酸氢二钾20.0g/L，无水硫酸镁1.0g/L，无水硫酸锰0.5g/L，Tween8010.0g/L，pH值6.4，用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调节。
如图3所示，采用本发明的发酵优化策略，菌体密度OD600达到30，片球菌素效价为1.8×104AU/ml。图中，曲线1为片球菌素效价，曲线2为菌体密度，曲线3为pH值。
实施例2改良的MRS液体培养基和TG浓缩培养基如实施例1。
将片球菌LH31单菌落接种在改良的MRS液体培养基中，30℃、200转/分培养条件下培养8h，活化；将上述活化好的片球菌LH31接种在5L发酵罐中，接种量为5％，发酵罐初始培养基为改良的MRS培养基，pH值为6.3；间歇培养培养8h后，开始补料，补料培养基为浓缩的TG培养基，流加速度为1.2ml/min；培养至发酵后期时，即15h，将pH值调整为4.0，24h时发酵结束。
经上述发酵培养，最终菌体浓度OD600达到18，片球菌素效价为1.2×104AU/ml。
实施例3
改良的MRS液体培养基和TG浓缩培养基如实施例1。
将片球菌LH31单菌落接种在改良的MRS液体培养基中，30℃、200转/分培养条件下培养8h；将上述活化好的片球菌LH31接种在10L发酵罐中，接种量5％，发酵罐初始培养基为改良MRS液体培养基，pH值为6.5；间歇培养培养6h后，开始补料，补料培养基为浓缩的TG培养基，流加速度为1.5ml/min；培养至发酵后期时，即18h，将pH值调整为6.5-4.0周期性的变化，24h时发酵结束。所说的pH值调整为4.0～6.5周期性的变化是指在第18小时，将pH控制方式由恒定值控制改为自然变化，第20小时时pH值降为4.0，此时将pH值用1mol/L的NaOH调为6.5；以后每2个小时进行一次这样的循环，直至24小时时停止这种变化。
采用本发明的发酵优化策略，菌体密度OD600达到24.7，片球菌素效价达到1.4×104AU/ml。
序列表<110>华东理工大学<120>一种乳酸片球菌菌株和乳酸片球菌素的生产方法<130>
<160>1<170>
<210>1<211>907bp<212>RNA<213>乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)<220>
<221>16SrRNA<400>1tgcctaatac atgcaagtcg aacgaacttc cgttaattga ttatgacgtg cttgcactga 60atgagatttt aacacgaagt gagtggcgga cgggtgagta acacgtgggc aacctgccca 120gaagcagggg ataacacctg gaaacagatg ctaataccgt ataacagaga aaaccgcctg 180gttttctttt aaaagatggc tctgctatca cttctggatg gacccgcggc gcattagcta 240gttggtgagg taacggctca ccaaggcgat gatgcgtagc cgacctgaga gggtaatcgg 300ccacattggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg agaagggttt cggctcgtaa 420aagctctgtt gttaaagaag aacgtgggtg agagtaactg ttcacccagt gacggtattt 480aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtc ttttaagtct aatgtgaaag 600ccttcggctc aaccgaagaa gtgcattgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaca 660gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tacatatatg gaagaacacc tgtggcgaag 720gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgagtagcg aacaggatta 780gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gattactaag tgttggaggg tttccgccct 840
tcagtgctgc agctaacgca tcaagtaatc ctcctggtcg agtacgaccg caaggttgaa 900actcaaa 907
权利要求
1.乳酸片球菌菌(Pediococcus acidilactici)LH31 CCTCC M207013。
2.采用权利要求
1所述的乳酸片球菌菌(Pediococcus acidilactici)LH31CCTCC M207013生产乳酸片球菌素的方法，包括如下步骤先将所说的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)LH31 CCTCCM207013的单菌落接种在改良的MRS液体培养基中，培养活化，然后采用如下的步骤，将活化好的乳酸片球菌LH31接种在发酵罐中进行发酵培养发酵罐初始培养基为改良的MRS液体培养基，pH值为5.0～7.5，以培养基的体积计，培养4～8h后开始补料，补料培养基为浓缩的TG培养基，流加速度为0.5～2.0ml/min，培养发酵至12～24h，将pH值调整为4.0～6.5周期性的变化，培养至24～30h时，将pH值维持3.0～5.0不变，再发酵培养2～6小时，然后从发酵产物中收集乳酸片球菌素。所说的改良的MRS液体培养基，其组分和浓度为蛋白胨0.5～10.0g/L，酵母粉0.5～5.0g/L，葡萄糖10.0～20.0g/L，牛肉膏0.5～10.0g/L，氨基酸粉2.0～8.0g/L，玉米浆0.5～10.0g/L，柠檬酸铵0.5～2.0g/L，乙酸钠2.0～6.0g/L，无水硫酸镁0.05～0.1g/L，无水硫酸锰0.01～0.05g/L，磷酸氢二钾0.5～2.0g/L，pH值为5.0～7.5；所说的TG浓缩培养基组分和浓度为蛋白胨5.0～100.0g/L，葡萄糖5.0～150.0g/L，牛肉膏5.0～60.0g/L，氨基酸粉5.0～50.0g/L，磷酸氢二钾5.0～20.0g/L，无水硫酸镁0.5～1.0g/L，无水硫酸锰0.5～1.0g/L，Tween80 1.0～10.0g/L，pH值5.0～7.5。
3.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于，发酵培养过程溶氧保持在10％～50％，温度保持为28～40℃。
4.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于，所说的改良的MRS液体培养基中葡萄糖浓度为15.0g/L，氨基酸粉浓度优选5.0g/L，乙酸钠浓度优选5.0g/L。
专利摘要
本发明公开了一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)LH31 CCTCCM207013及其生产乳酸片球菌素的生产方法，该方法包括先将所说的乳酸片球菌的单菌落接种在改良的MRS液体培养基中培养活化，然后采用三段式流加发酵将活化好的乳酸片球菌LH31接种在发酵罐中进行发酵培养。采用本发明的菌种和方法生产乳酸片球菌素，在发酵的第一和第二阶段菌体能够得到最大限度的增殖，最高菌体密度(OD
文档编号C12P1/04GKCN101050437SQ200710038276
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月21日
发明者孙爱友, 魏东芝, 宋建民, 秦鲁敏 申请人:华东理工大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan