专利名称:霍乱弧菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。特别涉及对霍乱弧菌特定基因片段具有特异性 的引物及引物组；还涉及将所述引物及引物组用环介导等温扩增法检测霍乱弧菌的检测方 法和检测试剂盒。
背景技术：
食源性疾病发病率较高，由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱 弧菌，副溶血性弧菌以及E. coli 0157:H7，轮状病毒以及诺如病毒引起的食物中毒，其发病 率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例，是一个严重的公共卫生问题。
目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方 法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且 免疫学方法的特异性和敏感性均较低。
随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中 国专利公开号CN1526825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌Η 72Η序列的特异性， 通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法。虽然该方 法敏感、准确、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技 术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。
环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技术(国际 专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出一种核酸扩增新技术，即针对靶基因 的6个区域设计4条特异引物(如有需要还可以添加有环引物对)，利用一种链置换DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应， 扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也 可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色，通过肉眼进行判定。用于LAMP技术扩 增的2对引物乃针对基因6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循 环、其单位时间内扩增效率更高、且不需特殊仪器等优点。但是目前未有利用环介导等温扩 增法检测霍乱弧菌的检测方法和检测试剂盒，以及对霍乱弧菌ompW特定基因片段具有特 异性的LAMP引物组的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种对霍乱弧菌特定基因片段具有特异性的引物。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种霍乱弧菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述 靶基因为霍乱弧菌的ompW-—GenBank登陆号AF001009，所述引物与所述靶基因的14 位一220位的核酸序列的一部分或其互补链互补。
本发明的另一个目的在于，提供一种对霍乱弧菌特定基因片段具有特异性的引物组。[0010]上述目的是通过如下技术方案实现的
一种霍乱弧菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成
正向外引物F3-omp CGGGTACTAATAATGCATTGA
反向外引物B3-omp CGATCATAAATACCCAAGGATT
正向内引物FlP-omp
GGAACCAGCTATCATTGAGCATATAGTGATTTAAAACTGGACGACT
反向内引物BIP-omp
GCTTATGTGTGGTATGCCAATATTGGATTTCAACATCCGTGGATT
可以扩增霍乱弧菌的ompW(AF001009)基因序列的14位-—220位的核酸序列的 一部分或其互补链。
特别地，为了加快扩增反应速度，所述引物组还可以包括
正向环引物LF-omp GTTAGCAGCAAGTCCCCATG
反向环引物LB-omp TACAAAGCAGGTGCAGATGC
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增 法检测霍乱弧菌的检测方法。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种霍乱弧菌的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在霍乱弧菌，其特征在 于，以霍乱弧菌的ompW(AF001009)基因序列的14位一220位的核酸序列的一部分或其互 补链为靶，通过LAMP法用上述引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产物。
具体检测方法为
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品、粪便、呕吐物等标本；细菌待 检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm离心2分钟，弃 其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul 上清液做待检模板DNA。
2)霍乱弧菌的环介导等温扩增(LAMP)
取扩增反应液，先加酶，再加待检模板，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul IOOul的反应体系，混勻，点动离心后在约65°C条件下恒温保温约40-65分钟，然后置于 80°C的环境下2分钟灭活酶。
反应体系为(反应总体积20ul IOOul)
权利要求
一种霍乱弧菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成正向外引物F3 omp CGGGTACTA ATAATGCATTGA反向外引物B3 omp CGATCATAAATACCCAAGGATT正向内引物FIP ompGGAACCAGCTATCATTGAGCATATAGTGATTTAAAACTGGACGACT反向内引物BIP ompGCTTATGTGTGGTATGCCAATATTGGATTTCAACATCCGTGGATT可以扩增霍乱弧菌ompW基因的特异性核酸序列。
2.根据权利要求
1所述的霍乱弧菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组扩增霍乱 弧菌ompW基因14位-—220位的特异核酸序列部分。
3.根据权利要求
2所述的霍乱弧菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组还包括正向环引物 LF-omp GTTAGCAGCAAGTCCCCATG反向环引物 LB-omp TACAAAGCAGGTGCAGATGC。
4.根据权利要求
3所述的霍乱弧菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组以LAMP方 法能更快速地扩增霍乱弧菌ompW基因14位一220位的特异性核酸序列。
5.一种霍乱弧菌的检测方法，该方法用于检测食品样品中是否存在霍乱弧菌，其特征 在于，以霍乱弧菌GenBank登陆号为AF001009的ompW基因14位-—220位的核酸序列为 靶基因，通过LAMP法用权利要求
1-4任意一项所述的引物组选择性扩增所述靶基因，确认 是否存在有扩增产物。
6.根据权利要求
5所述的霍乱弧菌检测方法，其特征在于，具体检测方法为1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品标本；细菌待检标本用相应肠道增 菌液增菌培养8-12小时后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA 提取试剂盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul上清液做待检模板 DNA ；2)霍乱弧菌的环介导等温扩增取扩增反应液，先加酶，再加待检模板，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul IOOul的反应体系，混勻，点动离心后在约65°C条件下恒温保温约40-65分钟，然后置于 80°C的环境下2分钟灭活酶；反应总体积20ul IOOul的反应体系为
7.根据权利要求
6所述的霍乱弧菌检测方法，其特征在于，所述扩增反应液还包括 正向环引物LF-omp 0.6-1. OuM反向环引物 LB-omp 0.6-1. OuM。
8.根据权利要求
7所述的霍乱弧菌检测方法，其特征在于，当反应总体积为25ul时，所 述反应体系具体为
9. 一种霍乱弧菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有权利要求
1-4 中任意一项所述的引物组的扩增反应液、酶； 所述扩增反应液中包括如下试剂
10.根据权利要求
9所述的霍乱弧菌检测用试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液还包括正向环引物LF-omp 0.6-1. OuM 反向环引物 LB-omp 0.6-1. OuM。
11.根据权利要求
10所述的霍乱弧菌检测用试剂盒，其特征在于，扩增反应液包含 1/10预定反应体积IOXBst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液、3. 6mM硫酸镁、1. 6uM正向内引物FlP-omp、1. 6uM反向内引物BIP-omp、0. 2uM的正向外引物F3_omp、0. 2uM的反向 外引物B3-omp、0. 8uM正向环引物LF_omp、0. 8uM反向环引物LB_omp、l. 4mM dNTP和IM甜 菜碱；所述酶为每微升含8个活性单位、终浓度0. 32U/ul的Bst DNA聚合酶。
12.根据权利要求
11所述的霍乱弧菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括 阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为1 IOOnM霍乱弧 菌基因组DNA。
专利摘要
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。一种霍乱弧菌检测用引物，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为霍乱弧菌的ompW---GenBank登陆号AF001009，所述引物与所述靶基因的14位---220位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明通过提供一种对霍乱弧菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在霍乱弧菌特定基因片段，进而确定标本中是否存在霍乱弧菌。
文档编号C12Q1/68GKCN101153332 B发布类型授权 专利申请号CN 200710030446
公开日2011年3月23日 申请日期2007年9月21日
发明者张丽荣, 张彩虹, 谭爱军, 魏泉德 申请人:珠海市疾病预防控制中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (1),