专利名称:副溶血性弧菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。特别涉及对副溶血 性弧菌特定基因片段具有特异性的引物及引物组；还涉及将所述引物及引物组用环介导等 温扩增法检测副溶血性弧菌的检测方法和检测试剂盒。
背景技术：
食源性疾病发病率较高，由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱 弧菌，副溶血性弧菌以及E. coli 0157:H7，轮状病毒以及诺如病毒引起的食物中毒，其发病 率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例，是一个严重的公共卫生问题。
目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方 法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且 免疫学方法的特异性和敏感性均较低。
随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中 国专利公开号CN1M6825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌Η 72Η序列的特异性， 通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法。虽然该方 法敏感、准确、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技 术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。
环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技术(国际 专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出一种核酸扩增新技术，即针对靶基因 的6个区域设计4条特异引物(如有需要还可以添加有环引物对)，利用一种链置换DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应， 扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也 可用结合双链DNA的荧光染料STOR Green I染色，通过肉眼进行判定。用于LAMP技术扩 增的2对引物乃针对基因6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循 环、其单位时间内扩增效率更高、且不需特殊仪器等优点。但是目前未有利用环介导等温扩 增法检测副溶血性弧菌的检测试剂盒，以及对副溶血性弧菌tih特定基因片段具有特异性 的引物及引物组的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种对副溶血性弧菌特定基因片段具有特异性的引 物。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种副溶血性弧菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述 靶基因为副溶血性弧菌的tih-—GenBank登陆号AY578148，所述引物与所述靶基因的946 位一1140位的核酸序列的一部分或其互补链互补。[0009]本发明的另一个目的在于，提供一种对副溶血性弧菌特定基因片段具有特异性的 引物组。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种副溶血性弧菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成
正向外引物F3-tih GGCACAAGCGATGTACTACA
反向外引物B3-tih GACGCTGCACACTCAGAG
正向内引物FIP-tih
GCGCAGAAGTTAGCGTCTCGAAGCGCAAGGTTACAACATCAC
反向内引物BIP-tih GGTTTCGTGAACGCGAGCGACGCAATGCGTGGGTGTAC
可以扩增副溶血性弧菌的tih(AY578148)基因序列的946位-—1140位的核酸序 列的一部分或其互补链。
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物组基于环介导等温扩增法检测 副溶血性弧菌的检测方法。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种副溶血性弧菌的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在副溶血性弧菌， 其特征在于，以副溶血性弧菌的tih基因序列的946位一1140位的核酸序列的一部分或 其互补链为靶，通过LAMP法用上述引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产 物。
具体检测方法为
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品、粪便、呕吐物等标本；细菌待 检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm离心2分钟，弃 其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul 上清液做待检模板DNA;
2)副溶血性弧菌的环介导等温扩增(LAMP)
取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul IOOul的反应体系，混勻点离后在约60-65°C条件下恒温保温约60-90分钟，然后置于80°C 的环境下2分钟灭活酶。
反应体系为(反应总体积20ul IOOul)
权利要求
1.一种副溶血性弧菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成正向外引物 F3-tih GGCACAAGCGATGTACTACA反向外引物 B3-tih GACGCTGCACACTCAGAG正向内引物FIP-tihGCGCAGAAGTTAGCGTCTCGAAGCGCAAGGTTACAACATCAC反向内引物 BIP-tih GGTTTCGTGAACGCGAGCGACGCAATGCGTGGGTGTAC可以扩增副溶血性弧菌tih基因的特异性核酸序列。
2.根据权利要求
1所述的副溶血性弧菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组扩增 副溶血性弧菌tih基因946位一1140位的特异核酸序列部分。
3.一种副溶血性弧菌的检测方法，该方法用于检测食品样品中是否存在副溶血性弧 菌，其特征在于，以副溶血性弧菌GenBank登陆号为AY578148的tih基因946位-—1140 位的核酸序列为靶基因，通过LAMP法用权利要求
1-2任意一项所述的引物组选择性扩增所 述靶基因，确认是否存在有扩增产物。
4.根据权利要求
3所述的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，具体检测方法为1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品标本；细菌待检标本用相应肠道增 菌液增菌培养8-12小时后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA 提取试剂盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul上清液做待检模板 DNA ；2)副溶血性弧菌的环介导等温扩增取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul IOOul的反应体系，混勻点离后在约60-65°C条件下恒温保温约60-90分钟，然后置于80°C 的环境下2分钟灭活酶；反应总体积20ul IOOul的反应体系为成分终浓度或量待检模板核酸模板I-IOuI正向内引物FIP-tih1.0-2.0 uM扩反向内引物BIP-tih1.0-2.0 uM增正向外引物F3-tih0.15-0.3 uM反反向外引物B3-tih0.15-0.3 uM应甜菜碱betaine0.8-1.5 M液dNTP1.0-1.6mMMgs042-6 mM反应缓冲液 Bst DNAPolvmerase Buffer IOx1/10反应体积ul酶Bst DNA Polymerase0.16-0.64U/ul双蒸水ddH20加至预定反应体积ul其中IOXBst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8. 8的三羟基甲硫 氨酸甲烷-盐酸、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通X-100 ；所述酶为每微升含8-16个活性单位的Bst DNA酶； 3) LAMP反应产物的检测A)肉眼检测与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；或，B)加染料后检测每25ul体系的反应管加1000XSTORGreen I invitrogenl_2ul， 1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，C)电泳检测2-3%琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征性梯 状条带，最小片段在160bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。
5.根据权利要求
4所述的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，当反应总体积为25ul 时，所述反应体系具体为
6. 一种副溶血性弧菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有权利要求
1所述的引物组的扩增反应液、酶； 所述扩增反应液中包括如下试剂
7.根据权利要求
6所述的副溶血性弧菌检测用试剂盒，其特征在于，扩增反应液包含1/10预定反应体积IOXBst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液、 3. 6mM硫酸镁、1. 6uM正向内引物FIP-tih、l. 6uM反向内引物BIP_tih、0. 2uM的正向外引物 F3-tih、0. 2uM 的反向外引物 B3-tih、l. 4mM dNTP 和 IM 甜菜碱；所述酶为每微升含8个活性单位、终浓度0. 32U/ul的Bst DNA酶。
8.根据权利要求
6或7所述的副溶血性弧菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为1 IOOnM 副溶血性弧菌基因组DNA。
专利摘要
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。一种副溶血性弧菌检测用引物，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为副溶血性弧菌的tih---GenBank登陆号AY578148，所述引物与所述靶基因的946位---1140位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明通过提供一种对副溶血性弧菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在副溶血性弧菌特定基因片段，进而确定标本中是否存在副溶血性弧菌。
文档编号C12Q1/04GKCN101153330 B发布类型授权 专利申请号CN 200710030441
公开日2011年7月13日 申请日期2007年9月21日
发明者张丽荣, 张彩虹, 谭爱军, 魏泉德 申请人:珠海市疾病预防控制中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (1),