专利名称:变形杆菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。特别涉及对变形杆 菌特定基因片段具有特异性的引物及引物组；还涉及将所述引物及引物组用环介导等温扩 增法检测变形杆菌的检测方法和检测试剂盒。
背景技术：
食源性疾病发病率较高，由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱 弧菌，副溶血性弧菌以及E.coli 0157:H7，轮状病毒以及诺如病毒引起的食物中毒，其发病 率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例，是一个严重的公共卫生问题。
目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方 法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且 免疫学方法的特异性和敏感性均较低。
随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中 国专利公开号CN1526825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌TO72H序列的特异性， 通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法。虽然该方 法敏感、准确、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技 术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。
环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技术(国际 专利公开号W0 00/28082)是2000年Notomi等开发出一种核酸扩增新技术，即针对靶基因 的6个区域设计4条特异引物(如有需要还可以添加有环引物对)，利用一种链置换DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应， 扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也 可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色，通过肉眼进行判定。用于LAMP技术扩 增的2对引物乃针对基因6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循 环、其单位时间内扩增效率更高、且不需特殊仪器等优点。但是目前未有利用环介导等温扩 增法检测变形杆菌的检测方法和检测试剂盒，以及对变形杆菌特定基因片段具有特异性的 LAMP引物组的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种对变形杆菌特定基因片段具有特异性的引物。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种变形杆菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基 因为变形杆菌的ureR-—GenBank登陆号Z18752，所述引物与所述靶基因的586位-—810 位的核酸序列的一部分或其互补链互补。
本发明的另一个目的在于，提供一种对变形杆菌特定基因片段具有特异性的引物组。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种变形杆菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成
正向外引物F3-ure GGTGAGATTTGTATTAATGGGC
反向外引物B3-ure ATAATCTGGAAGATGACGAGTA
正向内引物FlP-ure
TGTCACATCACAAGAAACTTGACTAAAACTATCACAGTCACCACTA 反向内引物 BIP-ure
TTCCCGACCAAACCGATTGAATTATAATGGTTTGAGTAAAGAGAACAC 可以扩增变形杆菌的 ureR(Z18752)基因序列的586位-—810位的核酸序列的一部分或其互补链。
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物组的基于环介导等温扩增法检 测变形杆菌的检测方法。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种变形杆菌的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在变形杆菌，其特征在 于，以变形杆菌的ureR(Z18752)基因序列的586位一810位的核酸序列的一部分或其互 补链为靶，通过LAMP法用上述引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产物。
具体检测方法为
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品、粪便、呕吐物等标本；细菌待 检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm离心2分钟，弃 其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul 上清液做待检模板DNA;
2)变形杆菌的环介导等温扩增(LAMP)
取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul IOOul的反应体系，混勻点离后在约60-65°C条件下恒温保温约60-90分钟，然后置于80°C 的环境下2分钟灭活酶。
反应体系为(反应总体积20ul IOOul)
3) LAMP反应产物的检测
A)肉眼检测与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为 阴性；或，
B)加染料后检测每25ul体系的反应管加1000XSYBR Green I (invitrogen) l_2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，
C)电泳检测2_3%琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征 性梯状条带，最小片段在160bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物组基于环介导等温扩增法检测 变形杆菌的检测试剂盒。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种变形杆菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有上述引物组 的扩增反应液、酶。
所述扩增反应液中包括如下试剂
其中 lOXBst DNA Polymerase Buffer 反应缓冲液含有 200mM pH8. 8 的三羟基 甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl)、100mM氯化钾、lOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通 X-100 ；
所述酶为每微升含8个活性单位的Bst DNA酶。
所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为奇异变形杆菌基因组DNA (1 IOOnM)。
本发明通过提供一种对变形杆菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含 有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在变形杆菌特定基因片段，进而确定标本中是否 存在变形杆菌。本发明检测试剂和检测方法具有敏感性高、特异性强、方便快捷、不需特殊 仪器、适用范围广等优点，可解决食源性病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别 是现场检测及战时野外应用。同时，与现有的PCR方法相比具有特异性强、敏感性比PCR高 或相当、比PCR省时约2小时、不需特殊仪器(扩增反应在水浴锅中即可完成)等优点。
图1本发明所述引物组进行环介导等温扩增(LAMP)后可通过肉眼观察的结果；图 例1、阳性扩增结果；2、阴性扩增结果。
图2本发明所述引物组进行环介导等温扩增(LAMP)后加入染料观察的结果；图 例1、阴性扩增结果；2，3、阳性扩增结果。
图3本发明所述引物组进行环介导等温扩增(LAMP)结果的电泳图；
图中，1 =IOObp marker ；2 奇异变形杆菌；3_14分别为金黄色葡萄球菌、金黄色葡 萄球菌产肠毒素A菌株、金黄色葡萄球菌产肠毒素B菌株、金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌 株、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、痢疾志贺氏杆菌、大肠杆菌0157:H7、副 溶血弧菌、霍乱弧菌及阴性对照，上述细菌均为标准菌株。
具体实施方式
下面通过具体的变形杆菌检测过程来对本发明进行说明，但本发明并不局限于这 些实施例。
实施例一对已知菌株的ureR基因的扩增
一)引物组的设计
通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出变形杆菌特异性基因ure的 586-—810bp核酸序列，针对该片段的六个位点(这六个位点分别586-607bp、608-628bp、 654-678bp、685-708bp、745-768bp、789-810bp)设计出 LAMP 引物并合成，得到如下的引物； 引物设计通过LAMP专用引物设计软件结合分子生物学分析软件Advance Vector NTI完 成。
序列编号1
正向外引物F3-ure GGTGAGATTTGTATTAATGGGC
序列编号2
反向外引物B3-ure ATAATCTGGAAGATGACGAGTA
序列编号3
正向内引物FlP-ure
TGTCACATCACAAGAAACTTGACTAAAACTATCACAGTCACCACTA
序列编号4
反向内引物BIP-ure
TTCCCGACCAAACCGATTGAATTATAATGGTTTGAGTAAAGAGAACAC
8[0057]所述6个位点的序列分别为
586_607bp :ggtga gatttgtattaatgggc
608_628bp aaactatcacagtcaccacta
654-678bp tagtcaagtttcttgtgatgtgaca
685-708bp ttcccgaccaaaccgattgaatta
745-768bp gtgttctctttactcaaaccatta
789-810bp tactcgtcatcttccagattat
其中，
所述正向外引物F3 扩增始于 586_607bp(ggtgagatttgtattaatgggc)；
所述正向内引物FIP 扩增始于 654_678bp (tagtcaagtttcttgtgatgtgaca)的互补 序列和 608_628bp (aaactatcacagtcaccacta)；
所述反向外引物B3 扩增始于789_810bp (tactcgtcatcttccagattat)的互补序 列；
所述反向内弓丨物 BIP 扩增始于 685-708bp (ttcccgaccaaaccgattgaatta)，禾口 745-768bp(gtgttc tctttactcaaaccatta)的互补序歹丨J。
上述引物组中各引物的共性在于与变形杆菌特异性基因ureR的586—810bp核 酸序列互补。
二)本实施例实验的菌株与各菌株的扩增结果如下表一
表一(为了便于理解，本申请人将下列序号与图1中编号设置成一致)
上述供试菌株均为标准菌株，购自中国医学微生物菌种保藏管理中心。“阴，，表示 无扩增反应，“阳”表示有扩增反应。
三)上述各菌株基因DNA的提取
细菌待检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1. 0ml增菌液lOOOOrpm 离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒(如TIANampBacteria DNAKit)提取模板 DNA或加30ul三蒸水煮沸5分钟，直接取2ul上清液作模板DNA ；金黄色葡萄球菌标本需用 肠道增菌液增菌培养8-12小时后用基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit) 提取DNA。
四)基于LAMP法的基因扩增
取扩增反应液14. 6ul，加2. Oul待检模板，加lul酶，再加7. 4ul ddH20，形成如下 表总体积为25ul的反应体系，在温度为65°C的恒温水浴锅保温约60分钟，然后置于80°C、 2分钟灭活酶。
反应体系为(反应总体积为25ul)
10
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。
扩增反应液包含1/10预定反应体积的lOXBst DNA Polymerase Buffer反应缓 冲液、3. 6mM硫酸镁、1. 6uM正向内引物FIP_ure、l. 6uM反向内引物BIP_ure、0. 2uM的正向 外引物 F3-ure、0. 2uM 的反向外引物 B3-ure、1.4mM dNTP 禾口 1M 甜菜碱(betaine)；
其中lOXBst DNA Polymerase Buffer 反应缓冲液含有 200mM pH8. 8 的三羟基 甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl)、100mM氯化钾、lOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通 X-100 ；
酶Bst DNA聚合酶(每微升含8个活性单位)。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定 的反应体积。
五)扩增产物的检测
随着扩增反应的进行，从dNTP析出的焦磷酸根离子和反应液中存在的镁离子将 形成焦磷酸镁沉淀。因此，只有在发生核酸扩增的反应液中才会出现白色浑浊。这样可以 通过如下方式进行判断。
A)肉眼检测与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为 阴性；(参见图1)或，
B)加染料后检测每25ul体系的反应管加1000XSYBR Green I (invitrogen) l_2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；(参 见图2)或，
C)电泳检测2_3%琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征 性梯状条带，最小片段在160bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。(参见 图3)
经对扩增产物的检测，表明上述引物组对奇异变形杆菌出现LAMP扩增反应，对照菌未出现扩增反应，显示了良好的特异性。
6)灵敏度比较
以奇异变形杆菌作为检测菌，将IX 106CFU/mL的菌液做一系列稀释106、ΙΟ5、104、 IO3UO2UO1UOq,分别用LAMP方法和PCR方法(上下游引物分别为F3_ure、B3-ure)来检 测，检测结果表明LAMP反应敏感性达10°CFU/mL ；PCR反应敏感性达IO1CFUAIL ；结果显示 LAMP反应敏感性比PCR反应敏感10倍。
实施例二
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反 应体系为
反应体系为(反应总体积为25ul)
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。
扩增反应液包含1/10预定反应体积的IOXBst DNA Polymerase Buffer反应缓 冲液、2mM硫酸镁、1. OuM正向内引物FlP-ure、1. OuM反向内引物BIP-ure、0. 15uM的正向外 引物 F3-ure、0. 15uM 的反向外引物 B3-ure、1.0mM dNTP 和 0· 8M 甜菜碱(betaine)；
其中IOXBst DNA Polymerase Buffer 反应缓冲液含有 200mM pH8. 8 的三羟基 甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl) UOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通 X-100 ；
酶Bst DNA聚合酶(每微升含8个活性单位)。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定 的反应体积。
反应条件在温度为60°C的恒温水浴锅保温约60分钟，然后置于80°C、2分钟灭活酶。[0103]实施例三
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反 应体系为
反应体系为(反应总体积为25ul)
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。
扩增反应液A 包含1/10预定反应体积的IOXBst DNA PolymeraseBuffer反应 缓冲液、6mM硫酸镁、2. OuM正向内引物FIP_ure、2. OuM反向内引物BIP_ure、0. 3uM的正向 外引物 F3-ure、0. 3uM 的反向外引物 B3-ure、l. 6mM dNTP 禾口 1.5M 甜菜碱(betaine)；
其中IOXBst DNA Polymerase Buffer 反应缓冲液含有 200mM pH8. 8 的三羟基 甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl) UOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通 X-100 ；
酶Bst DNA聚合酶(每微升含16个活性单位)。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定 的反应体积。
反应条件在温度为65°C的恒温水浴锅保温约60分钟，然后置于80°C、2分钟灭活酶。
实施例四
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反 应体系为(反应总体积为IOOul)
实施例五
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反 应体系为(反应总体积为20ul)
实施例六从呕吐物中分离的菌株的检测
菌株基因DNA的提取及扩增、检测
取食物中毒者呕吐物25g，用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20 30ul 三蒸水煮沸5分钟，再取2ul上清液做待检模板DNA。另用前述肠道增菌培养液接种分离培 养平板，菌落用用生物_梅里埃GNI+卡及VITEC 32全自动微生物分析仪进行分离株的鉴定。
对上述提取的基因DNA与实施例一同样的通过LAMP法进行核酸的扩增和扩增产 物的检测。扩增结果与VITEC鉴定结果比对，如下表二。
基于VITEC 32全自动微生物分析仪的鉴定
如表二所示，鉴定结果表明分离的菌株有奇异变形杆菌及大肠杆菌，基于VITEC 32全自动微生物分析仪的鉴定结果与使用本引物组合LAMP检测的结果一致，只有在鉴定 为奇异变形杆菌的标本中观察到上述引物组产生的扩增。
序列表
<110>珠海市疾病预防控制中心
<120>变形杆菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒
<160>5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物
<400>1
GGTGAGATTTGTATTAATGGGC22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物
<400>2
ATAATCTGGAAGATGACGAGTA22
<210>30148]<211>38
0149]<212>DNA
0150]<213>人工序列
0151]<220>
0152]<223> 引物
0153]<400>3
0154]TGTCACATCACAAGAAACTTGACTAAAACTATCACAGTCACCACTA 46
0155]<210>4
0156]<211>48
0157]<212>DNA
0158]<213>人工序列
0159]<220>
0160]<223> 引物
0161]<400>4
0162]TTCCCGACCAAACCGATTGAATTATAATGGTTTGAGTAAAGAGAACAC 48
0163]<210>5
0164]<211>225
0165]<212>DNA
0166]<213>变形杆菌
0167]<400>5
0168]586 ggtga gatttgtatt
0169]601 aatgggcaaa ctatcacagt caccactaat ctcacgttga ttattcctaa atatagtcaa
0170]661 gtttcttgtg atgtgacaaa ttttttcccg accaaaccga ttgaattaca taccttagta
0171]721 ctgtctgaaa ctgaattaca atctgtgttc tctttactca aaccattaat aaaatcaggg
0172]781 gcgccgatta ctcgtcatct tccagattat
权利要求
一种变形杆菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成正向外引物F3-ure GGTGAGATTTGTATTAATGGGC反向外引物B3-ure ATAATCTGGAAGATGACGAGTA正向内引物FIP-ure TGTCACATCACAAGAAACTTGACTAAAACTATCACAGTCACCACTA反向内引物BIP-ure TTCCCGACCAAACCGATTGAATTATAATGGTTTGAGTAAAGAGAACAC可以扩增变形杆菌ureR基因---GenBank登录号Z18752，586位---810位的特异性核酸序列。
2.一种变形杆菌的检测方法，该方法用于检测食品中是否存在变形杆菌，其特征在于， 以变形杆菌的ureR基因-—GenBank登录号Z18752，586位-—810位的核酸序列的一部 分或其互补链为靶，通过LAMP法用权利要求
1所述引物组选择性扩增所述靶基因，确认是 否存在有扩增产物。
3.根据权利要求
2所述的一种变形杆菌的检测方法，其特征在于，具体检测方法为1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品标本；细菌待检标本用相应肠道增 菌液增菌培养8-12小时后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA 提取试剂盒提取模板DNA或加20 30 μ 1三蒸水煮沸5分钟，再取2 μ 1上清液做待检模 板 DNA ；2)变形杆菌的环介导等温扩增取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20μ 1 100 μ 1的反应体系，混勻点离后在约60-65°C条件下恒温保温约60-90分钟，然后置于80°C 的环境下2分钟灭活酶；反应总体积20 μ 1 100 μ 1的反应体系为 其中IOXBst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8. 8的三羟基甲硫 氨酸甲烷-盐酸、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通X-100 ；所述酶为每微升含8-16个活性单位的Bst DNA酶； 3) LAMP反应产物的检测A)肉眼检测与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；或，B)加染料后检测每25iil体系的反应管加1000XSYBRGreen Iinvitrogenl-2 u 1, 1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，C)电泳检测2-3%琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征性梯 状条带，最小片段在160bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。
4.根据权利要求
3所述的变形杆菌的检测方法，其特征在于，当反应总体积为25 yl 时，所述反应体系具体为
5. 一种变形杆菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有权利要求
1所 述的引物组的扩增反应液、酶；所述扩增反应液中包括如下试剂 其中lOXBst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8. 8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通X-100 ； 所述酶为每微升含8-16个活性单位，终浓度0. 16-0. 64U/ μ 1的Bst DNA酶。
6.根据权利要求
5所述的一种变形杆菌检测用试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液 包含1/10预定反应体积的IOXBst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液、3. 6mM硫酸镁、 1.6μΜ正向内引物FIP-ure、1.6yM反向内引物BIP-ure、0. 2μΜ的正向外引物F3-ure、 0. 2μΜ的反向外引物B3-ure、1.4mM dNTP禾口 IM甜菜碱；所述酶为每微升含8个活性单位，终浓度0. 32U/ μ 1的Bst DNA酶。
7.根据权利要求
5所述的一种变形杆菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包 括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为1 IOOnM奇异 变形杆菌基因组DNA。
专利摘要
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。一种变形杆菌检测用引物，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为变形杆菌的ureR---GenBank登陆号Z18752，所述引物与所述靶基因的586位---810位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明通过提供一种对变形杆菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在变形杆菌特定基因片段，进而确定标本中是否存在变形杆菌。
文档编号C12Q1/68GKCN101153328 B发布类型授权 专利申请号CN 200710030438
公开日2010年11月10日 申请日期2007年9月21日
发明者张丽荣, 张彩虹, 谭爱军, 魏泉德 申请人:珠海市疾病预防控制中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (3),