专利名称：一种累积生产乳酸片球菌素的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产乳酸片球菌素的方法，尤其是涉及一种累积生产乳酸片球菌 素的方法。
背景技术：
乳酸片球菌素(Pediocin)是由属于片球菌属的乳酸片球菌 (Pediococcusacidilactici)产生的一种抗菌短肽物质。研究表明乳酸片球菌素为一种初 级代谢产物，是具有较强抗菌活性的细菌素，与已经大规模生产、应用的乳酸链球菌素的物 理化学性质和用途很类似，耐高低温、耐酸、在人体中可降解，因此安全无毒，且方便使用。 Pediocin能抑制包括白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、沙门氏菌、绿脓杆 菌等在内的大量致病菌，因此可以用于食品保藏，也可以用于人类疾病治疗上，具有极高的 使用价值和应用前景。目前主要采用间歇发酵和少量的流加方法实现Pediocin的高效表达，发酵过程 中PH值是影响Pediocin表达的关键因素，下降速率和Pediocin的产生速率成一定的正比 关系。Poolman (Poolman et al, J Bacteriol.，1988)研究发现，当pH值处于碱性(大于 6. 5)时，乳酸乳球菌会大量积累谷氨酸(Glu)，而此时菌体利用谷氨酸的能力下降，因此抑 制菌体的生长；Biswas (Biswas et al,Appl. Environ. Microbiol.，1991)推测低的 pH值在 Pediocin前体转化成活性形式的过程中起关键作用；Schneider (Schneider et al, Food Control, 2006)发现pH值的降低能够增加Pediocin在水中的溶解度；Guerra(Guerra et al，Int. J Food Microbiol.，2001)建立了碱化周期培养(re-alkalized cultivation)模 型，发现Pediocin是一种pH依赖型的初级代谢物。但目前报道的发酵策略主要采用间歇 发酵方式，而最近几年出现的少数流加发酵方式，其策略比较单一，主要采用单一的降低PH 策略(Guerra et al，Lett. Appl. Microbiol.，2003)和单一的pH循环策略(Guerra et al, Process Biochem. , 2005)等，仅有的少数文献(如 Guerra et al, Enzyme and Microbial Technology, 2007)所采用的初始培养基一般是稀释过的乳清和酵母粉的混合物，流加培养 基为乳糖(或葡萄糖)和酵母粉混合物，最高效价为712AU/ml，其最大的缺陷是将残糖(发 酵液中残留葡萄糖)浓度控制的很低(基本为0)，使得菌体得不到大量增殖，而片菌素的产 量也无法得到显著提高，发酵周期过长(一般超过250小时)，操作过程复杂，因此很难实现 工业化生产。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种发酵周期短、操 作简单、效价高的累积生产乳酸片球菌素的方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种累积生产乳酸片球菌素的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤将乳酸片球菌素(Pediococcus acidilactici)接种在改良后的MRS液体培养基中，30°C条件下培养他，然后按接种量为将乳酸片球菌素接种到发酵罐中，控制发酵 温度为30°C，发酵罐内的培养基为改良后的MRS液体培养基，发酵培养16 30h得到效价 为1. 8万 2. 4万AU/ml的乳酸片球菌素。所述的改良后的MRS液体培养基包括以下组分葡萄糖15 20g/L，蛋白胨10 15g/L,牛肉膏 10 15g/L，酵母膏 4 6g/L，(NH4) 2HC6H5071 2g/L，吐温 800. 5 lg/L， H3COONa · 3H20 4 6g/L, K2HPO4 · 3H20 1 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 55 0. 6g/L, MnSO4 · H2O 0. 2 0. 3g/L，溶剂为蒸馏水，利用3mol/L盐酸溶液和3mol/L NaOH溶液调整至6. 5。所述的发酵培养的初期采用间歇发酵，中后期采用反馈流加发酵，向发酵罐中补 充培养基，使发酵罐中葡萄糖浓度维持在5 10g/L。所述的发酵培养的初期为MRS液体培养基中葡萄糖浓度从初始浓度下降至5 10g/L的时间段，发酵培养的中后期为向发酵罐中补充培养基至发酵完成的时间段。所述的补充培养基中葡萄糖浓度为300 400g/L，蛋白胨浓度为40 100g/L。与现有技术相比，本发明具有以下优点(1)发酵周期短，从接种算起30小时内发酵结束；(2)操作简单，从发酵第二阶段开始补料，恒速补入补料液即可控制残糖浓度在 5 10g/L ；(3) pH下降幅度较大，有利于快速产生乳酸片球菌素；(4)乳酸片球菌素效价高，最高可达2. 4万AU/ml，高于目前国际报道的最高值，为 实现乳酸片球菌素的商业化生产提供了 一种有效方法。
图1为实施例1中乳酸片球菌素在发酵罐中的发酵曲线。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。实施例1取-20°C冰箱保存的乳酸片球菌200 μ 1，接种到改良的MRS摇瓶培养基中，培养基 组成为(g/L)葡萄糖15. 0，蛋白胨10. 0，牛肉膏10. 0，酵母膏5.0，(NH4) 2HC6H5072. 0，吐温 801. 0，H3COONa · 3H20 5. 0，K2HPO4 · 3H20 2. 0，MgSO4 · 7H20 0. 58，MnSO4 · H2O 0. 25，蒸馏水 1000，pH值用3mol/L盐酸溶液和3mol/L NaOH溶液调整至6. 5。将上述培养好的片球菌LH31接种在3. 7L发酵罐中，以培养基的体积计，接种量为 ^t %，发酵罐初始培养基为改良的MRS液体培养基，pH值为6. 5 ；当发酵液pH值下降至4. 2时，开始补料，补料培养基组成为葡萄糖350g/L，蛋白胨 100g/L，补料采用恒速补料方式，使发酵罐中的残留葡萄糖浓度始终维持在5-10g/L之间。当发酵液pH值下降至4. 5时，用3mol/L NaOH溶液将发酵液pH值调整至6. 5。继 续采用恒速补料方式，使发酵罐中的残留葡萄糖浓度始终维持在5-10g/L之间。当发酵液pH值下降至4. 5时，重复上述步骤。控制补料的流加速度，使发酵罐中 的残留葡萄糖浓度始终维持在10g/L左右，pH值重复调整4次，发酵结束。发酵过程中，其他的发酵参数为温度30°C、溶氧20%以上，得到的Pediocin效价最高达到2. 4万AU/ml，乳酸片球菌素在发酵罐中的发酵曲线如图1所示。实施例2取-20°C冰箱保存的乳酸片球菌200 μ 1，接种到改良的MRS摇瓶培养基中，培养基 组成为(g/L)葡萄糖20. 0，蛋白胨10. 0，牛肉膏10. 0，酵母膏5.0，(NH4) 2HC6H5072. 0，吐温 801. 0，H3COONa · 3H20 5. 0，K2HPO4 · 3H20 2. 0，MgSO4 · 7H20 0. 58，MnSO4 · H2O 0. 25，蒸馏水 1000，pH值用3mol/L盐酸溶液和3mol/L NaOH溶液调整至6. 5。将上述培养好的片球菌LH31接种在3. 7L发酵罐中，以培养基的体积计，接种量为 4%，发酵罐初始培养基为改良的MRS液体培养基，pH值为6. 5 ；当发酵液pH值下降至4. 5时，开始补料，补料培养基组成为葡萄糖300g/L，蛋白胨 40g/L。补料采用恒速补料方式，使发酵罐中的残留葡萄糖浓度始终维持在8g/L左右。当发酵液pH值下降至4. 5时，用3mol/L NaOH溶液将发酵液pH值调整至6. 5。继 续采用恒速补料方式，使发酵罐中的残留葡萄糖浓度始终维持在8g/L左右。当发酵液pH值下降至4. 5时，重复上述步骤。控制补料的流加速度，使发酵罐中 的残留葡萄糖浓度始终维持在10g/L左右。pH值重复调整5次，发酵结束。发酵过程中，其他的发酵参数为温度30°C、溶氧20%以上，得到的Pediocin效价 最高达到2. 2万AU/ml。实施例3取-20°C冰箱保存的乳酸片球菌200 μ 1，接种到改良的MRS摇瓶培养基中，培养基 组成为(g/L)葡萄糖18. 0，蛋白胨10. 0，牛肉膏10. 0，酵母膏5.0，(NH4) 2HC6H5072. 0，吐温 801. 0，H3COONa · 3H20 5. 0，K2HPO4 · 3H20 2. 0，MgSO4 · 7H20 0. 58，MnSO4 · H2O 0. 25，蒸馏水 1000，pH值用3mol/L盐酸溶液和3mol/L NaOH溶液调整至6. 5。将上述培养好的片球菌LH31接种在3. 7L发酵罐中，以培养基的体积计，接种量为 4%，发酵罐初始培养基为改良的MRS液体培养基，pH值为6. 5 ；当发酵液pH值下降至4. 1时，开始补料，补料培养基组成为葡萄糖400g/L，蛋白胨 80g/L。补料采用恒速补料方式，使发酵罐中的残留葡萄糖浓度始终维持在5g/L左右。当发酵液pH值下降至4. 5时，用3mol/L NaOH溶液将发酵液pH值调整至6. 5。继 续采用恒速补料方式，使发酵罐中的残留葡萄糖浓度始终维持在5g/L左右。当发酵液pH值下降至4. 5时，重复上述步骤。控制补料的流加速度，使发酵罐中 的残留葡萄糖浓度始终维持在5g/L左右。pH值重复调整4次，发酵结束。发酵过程中，其他的发酵参数为温度30°C、溶氧20%以上，得到的Pediocin效价 最高达到1. 8万AU/ml。实施例4一种累积生产乳酸片球菌素的方法，该方法包括以下步骤将乳酸片球菌素(Pediococcus acidilactici)接种在改良后的MRS液体培养 基中，30°C条件下培养他，改良后的MRS液体培养基包括以下组分葡萄糖15g/L，蛋白胨 10g/L，牛肉膏 10g/L，酵母膏 4g/L，(NH4)2HC6H5O7Ig/L，吐温 80 为 0. 5g/L，H3COONa ·3Η20 4g/ L，K2HPO4 · 3H20 lg/L，MgSO4 · 7H20 0. 55g/L，MnSO4 · H2OO. 2g/L，溶剂为蒸馏水，利用 3mol/ L盐酸溶液和3mol/LNa0H溶液调整至6. 5。然后按接种量为^t %将乳酸片球菌素接种到 发酵罐中，发酵罐内的培养基也为改良后的MRS液体培养基，控制发酵温度为30°C，初期采用间歇发酵，当培养基中的葡萄糖浓度降至5g/L时，采用反馈流加发酵，向发酵罐中补充 培养基，使发酵罐中葡萄糖浓度维持在5g/L，补充的培养基中葡萄糖浓度为300g/L，蛋白 胨浓度为40g/L，乳酸片球菌素在发酵罐内发酵培养16h，得到效价为1.8万AU/ml的乳酸 片球菌素。实施例5一种累积生产乳酸片球菌素的方法，该方法包括以下步骤将乳酸片球菌素(Pediococcus acidilactici)接种在改良后的MRS液体培养 基中，30°C条件下培养他，改良后的MRS液体培养基包括以下组分葡萄糖20g/L，蛋白胨 15g/L，牛肉膏 15g/L，酵母膏 6g/L，(NH4) 2HC6H5072g/L，吐温 80 为 lg/L，H3COONa · 3H206g/L， K2HPO4 · 3H202g/L, MgSO4 · 7Η200· 6g/L，MnSO4 · H2O 0. 3g/L，其余为蒸馏水，利用 3mol/L 盐酸 溶液和3mol/L NaOH溶液调整至6. 5。然后按接种量为%将乳酸片球菌素接种到发酵 罐中，发酵罐内的培养基也为改良后的MRS液体培养基，控制发酵温度为30°C，初期采用间 歇发酵，当培养基中的葡萄糖浓度降至10g/L时，采用反馈流加发酵，向发酵罐中补充培养 基，使发酵罐中葡萄糖浓度维持在10g/L，补充的培养基中葡萄糖浓度为400g/L，蛋白胨浓 度为100g/L，乳酸片球菌素在发酵罐内发酵培养30h，得到效价为2. 1万AU/ml的乳酸片球 菌素。
权利要求
1.一种累积生产乳酸片球菌素的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤将乳酸片球菌素(Pediococcus acidilactici)接种在改良后的MRS液体培养基中， 30°C条件下培养他，然后按接种量为将乳酸片球菌素接种到发酵罐中，控制发酵温 度为30°C，发酵罐内的培养基为改良后的MRS液体培养基，发酵培养16 30h得到效价为 1. 8万 2. 4万AU/ml的乳酸片球菌素。
2.根据权利要求1所述的一种累积生产乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述的改 良后的MRS液体培养基包括以下组分葡萄糖15 20g/L，蛋白胨10 15g/L，牛肉膏10 15g/L,酵母膏 4 6g/L，(NH4)2HC6H5O7I 2g/L，吐温 800. 5 lg/L，H3COONa · 3H20 4 6g/L, K2HPO4 · 3H20 1 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 55 0. 6g/L, MnSO4 · H2O 0· 2 0. 3g/L，溶 剂为蒸馏水，利用3mol/L盐酸溶液和3mol/L NaOH溶液调整至6. 5。
3.根据权利要求1所述的一种累积生产乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述的发 酵培养的初期采用间歇发酵，中后期采用反馈流加发酵，向发酵罐中补充培养基，使发酵罐 中葡萄糖浓度维持在5 10g/L。
4.根据权利要求3所述的一种累积生产乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述的发 酵培养的初期为MRS液体培养基中葡萄糖浓度从初始浓度下降至5 10g/L的时间段，发 酵培养的中后期为向发酵罐中补充培养基至发酵完成的时间段。
5.根据权利要求3所述的一种累积生产乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述的补 充培养基中葡萄糖浓度为300 400g/L，蛋白胨浓度为40 100g/L。
全文摘要
本发明涉及一种累积生产乳酸片球菌素的方法，将乳酸片球菌素(Pediococcusacidilactici)接种在改良后的MRS液体培养基中，30℃条件下培养8h，然后按接种量为4wt％将乳酸片球菌素接种到发酵罐中，在发酵的第一阶段采用间歇发酵，待发酵液中的残糖(残留葡萄糖)浓度低于5～10g/L时开始进行第二阶段发酵，发酵16～30h得到效价1.8万～2.4万AU/ml的乳酸片球菌素。与现有技术相比，本发明发酵周期短，操作简单，有利于快速产生乳酸片球菌素，所得产品效价最高可达2.4万AU/ml。
文档编号C12P21/02GK102127578SQ201010593530
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者孙爱友, 张星, 徐瑞, 秦鲁敏, 董玉国, 魏东芝 申请人:华东理工大学