专利名称：从发酵液中吸附乳酸链球菌肽的新方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物产物的吸附方法，特指一种用菌体本身和吸附剂从乳酸链球菌的发酵液中吸附乳酸链球菌肽的新方法。
背景技术：
乳酸链球菌肽(Nisin)是由某些乳酸链球菌产生的一种小肽，分子量3510 Dalton。由于它对许多革兰氏阳性菌，尤其是对引起食品腐败的有害微生物，如梭菌、芽孢杆菌和利斯特氏菌等有强烈的抑制作用，而且被人们食用后在消化道内很快被蛋白酶分解成氨基酸，对人体安全无毒，已被全世界50多个国家和地区推广使用，可用于鲜乳和乳制品、植物蛋白食品、鱼贝类等海产制品、肉制品、蔬菜、沙拉酱和调味用酱汁、高水分或低脂的食品、罐装食品、酒精饮料等的防腐保鲜。
目前制约乳酸链球菌肽市场竞争力的主要因素是后提取成本太高。乳酸链球菌肽的分离提取传统上一般采用真空浓缩、溶剂沉淀、酸沉淀、离子交换层析及盐析的路线，由于采用该路线对乳酸链球菌肽的吸附效率较低，总收率只有40％左右，使得乳酸链球菌肽的后提取成本太高，在使用成本上难于同化学防腐剂进行竞争。
乳酸链球菌肽提取的传统方法由Muriana和Luchansky提出，其技术路线是从发酵液中将乳酸链球菌肽盐析，然后采用凝胶过滤、离子交换层析、反相高压液相色谱(RP-HPLC)等技术对乳酸链球菌肽进行分离，该方法由于不采用吸附技术，乳酸链球菌肽总收率仅为38％左右。
Daba等报道了一种简便的乳酸链球菌肽分离纯化方法，该方法先将发酵液pH调至5.5，在该pH下部分乳酸链球菌肽吸附到菌体细胞上，然后使乳酸链球菌肽从菌体细胞上解析，然而根据我们的实验结果仅仅使用菌体本身来进行吸附，吸附效率很难超过60％，因此采用该方法乳酸链球菌肽总收率只有10％。
Stoffels采用HIC和离子交换树脂法提取乳酸链球菌肽，乳酸链球菌肽的纯度提高了60倍，收率可达45％左右。
国内的乳酸链球菌肽后提取研究工作中，还连栋等将乳酸链球菌肽发酵液高温灭活菌体后用硅藻土等吸附剂进行吸附，但由于吸附剂和进一步的解吸剂用量都较大，不利于降低乳酸链球菌肽的后提取成本。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种从乳酸链球菌发酵液中吸附乳酸链球菌肽的方法。克服现有的技术弊端，达到利用发酵菌体本身和廉价的国产硅酸钙从乳酸链球菌发酵液中吸附乳酸链球菌肽，以降低乳酸链球菌肽后提取成本的目的。
本发明的目的是这样实现的一种从发酵液中吸附乳酸链球菌肽的新方法，其特征在于它是采用两步吸附法，即先调节发酵液pH、菌体吸附、离心后上清夜再用国产食品级多孔硅化合物硅酸钙吸附的技术手段，从乳酸链球菌的发酵液中吸附生物防腐剂乳酸链球菌肽，具体步骤如下1.发酵液pH调节及第一次菌体吸附首先将含有乳酸链球菌菌体的发酵液用碱液调节pH至5.0-6.5，用磁力搅拌器在20-50℃条件下搅拌20-60分钟。
2.第一次解吸上述菌体悬浮液15,000rpm离心15分钟，收集菌体，菌体用pH6.5的无机酸盐或有机酸盐缓冲液洗涤后再次离心收集菌体。该菌体用pH为2-3的磷酸溶液悬浮，20-50℃条件下搅拌30-90分钟以解吸。
3.第二次硅酸钙吸附第一次离心后收集的上清夜加入0.1％-0.8％的硅酸钙(最适量为0.3％-0.5％)20-50℃条件下搅拌0.5-2小时，制成吸附剂-乳酸链球菌肽复合物。
4.第二次解吸上述吸附剂-乳酸链球菌肽复合物离心后收集沉淀，用蒸馏水洗涤一次后用10％-30％发酵液体积的解吸剂进行解吸，使用的解吸剂为含有有机酸盐或无机酸盐的十二烷基磺酸纳水溶液，在20-50℃条件下搅拌25-60分钟进行解吸，十二烷基磺酸纳使用浓度为0.3％-1％。
本发明的主要优点在于结合乳酸链球菌菌体本身在特定pH条件下对乳酸链球菌肽的吸附能力以及廉价的国产食品级多孔硅化合物硅酸钙对乳酸链球菌肽良好的吸附能力的特点，并分别采用不同方法进行解吸，降低吸附剂和解吸剂的使用量，从而降低乳酸链球菌肽的后提取成本。
具体实施例方式
实施例1本发明提供了一种廉价简便的乳酸链球菌肽吸附新工艺，即采用即先调节发酵液pH、菌体吸附、离心后上清夜再用国产食品级多孔硅化合物硅酸钙吸附的技术手段，从乳酸链球菌的发酵液中获得生物防腐剂乳酸链球菌肽。具体步骤如下1)发酵液pH调节及第一次菌体吸附首先将含有乳酸链球菌菌体的发酵液用碱液调节pH至5.0-6.5，实验证明最佳pH值为6.0-6.5，用磁力搅拌器在20-50℃条件下搅拌20-60分钟，最佳搅拌时间为30-45分钟。
2)第一次解吸上述菌体悬浮液15,000rpm离心15分钟，收集菌体，菌体用pH6.5的无机酸盐或有机酸盐缓冲液洗涤后再次离心收集菌体，该无机酸盐或有机酸盐缓冲液包括磷酸钠、磷酸钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、碳酸钠、碳酸钾、醋酸钠、醋酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾中的任何一种。该菌体用pH为2-3的磷酸溶液(最适pH为2-2.5)悬浮，20-50℃条件下搅拌30-90分钟(最佳搅拌时间为40-50分钟)以解吸。
3)第二次硅酸钙吸附第一次离心后收集的上清夜加入0.1％-0.8％的硅酸钙(最适量为0.3％-0.5％)20-50℃条件下搅拌0.5-2小时(最佳搅拌时间为1-1.5小时)，制成吸附剂-乳酸链球菌肽复合物。
4)第二次解吸上述吸附剂-乳酸链球菌肽复合物离心后收集沉淀，用蒸馏水洗涤一次后用10％-30％体积的解吸剂进行解吸，使用的解吸剂为十二烷基磺酸纳，在20-50℃条件下搅拌25-60分钟(最佳搅拌时间为30-40分钟)进行解吸，十二烷基磺酸纳使用浓度为0.3％-1％(最适浓度为0.4％-0.6％)。有机酸盐或无机酸盐，包括氯化物、硫酸盐、碳酸盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、或酒石酸盐中的任何一种，浓度为1.5-4％，常用的如氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵、氯化铁、硫酸钾、碳酸钠、磷酸钾、磷酸钠、硝酸钠、醋酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠等。
本发明的方法中，整个流程乳酸链球菌肽的吸附率为97-100％，解吸剂对乳酸链球菌肽的解吸效率为90-95％。
本发明的创造性在于研制出乳酸链球菌肽的两步吸附法，即充分发挥菌体本身在特定pH条件下对乳酸链球菌肽的吸附能力和硅酸钙化合物对剩余乳酸链球菌肽的良好的吸附能力，并分别采取不同的措施进行解吸，即菌体吸附的乳酸链球菌肽采用低PH条件使之解吸，硅酸钙化合物吸附的乳酸链球菌肽采用表面活性剂解吸，不仅提高了乳酸链球菌肽的吸附和解吸效率，还大大降低了吸附剂和解吸剂的使用量，该创新技术为降低乳酸链球菌肽的后提取成本打下了良好基础。
实施例2本实施例中，从乳酸链球菌发酵液中提取乳酸链球菌肽的具体步骤如下1.发酵液pH调节及第一次菌体吸附取2000ml乳酸链球菌肽发酵液用碱液调节pH至6.0，用磁力搅拌器在20℃条件下搅拌30分钟。
2.第一次解吸上述菌体悬浮液15,000rpm离心15分钟，收集菌体，菌体用pH6.5的磷酸钠缓冲液洗涤后再次离心收集菌体。该菌体用pH为2的磷酸溶液悬浮，20℃下搅拌40分钟以解吸。
3.第二次硅酸钙吸附第一次离心后收集的上清夜加入0.4％的硅酸钙，20℃条件下搅拌1小时，制成吸附剂-乳酸链球菌肽复合物。
4.第二次解吸上述吸附剂-乳酸链球菌肽复合物离心后收集沉淀，用蒸馏水洗涤一次后用200ml解吸剂进行解吸，使用的解吸剂为十二烷基磺酸纳，在20℃条件下搅拌30分钟进行解吸，十二烷基磺酸纳使用浓度为0.5％，其中含有2％的氯化钠。
经过分析测试，整个流程中乳酸链球菌肽的总吸附率为97％，总解吸效率为91％。
权利要求
1.一种从发酵液中吸附乳酸链球菌肽的新方法，其特征在于它采用两步吸附法，即先调节发酵液pH、菌体吸附、离心后上清夜再用国产食品级多孔硅化合物硅酸钙吸附的技术手段，从乳酸链球菌的发酵液中获得生物防腐剂乳酸链球菌肽，具体步骤如下①发酵液pH调节及第一次菌体吸附首先将含有乳酸链球菌菌体的发酵液用碱液调节pH至6.0-6.5，用磁力搅拌器在20-50℃条件下搅拌30-45分钟；②第一次解吸上述菌体悬浮液15,000rpm离心15分钟，收集菌体，菌体用pH6.5的无机酸盐或有机酸盐缓冲液洗涤后再次离心收集菌体，菌体用pH为2-2.5的磷酸溶液悬浮，20-50℃条件下搅拌40-50分钟以解吸；③第二次硅酸钙吸附步骤①中收集的上清夜加入0.3％-0.5％的硅酸钙，20-50℃条件下搅拌1-1.5小时，制成吸附剂-乳酸链球菌肽复合物；④第二次解吸制成的吸附剂-乳酸链球菌肽复合物离心后收集沉淀，用蒸馏水洗涤一次后用10％-30％发酵液体积的解吸剂进行解吸，使用的解吸剂为十二烷基磺酸纳与有机酸盐或无机酸盐的混合物，在20-50℃条件下搅拌30-40分钟进行解吸。
2.在权利要求第1项步骤①所记载的方法中，所使用的碱液为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾中的至少一种。
3.在权利要求第1项步骤②所记载的方法中，该无机酸盐或有机酸盐缓冲液包括磷酸钠、磷酸钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、碳酸钠、碳酸钾、醋酸钠、醋酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾中的任何一种。
4.在权利要求第1项步骤④所记载的方法中，十二烷基磺酸纳使用浓度为0.4％-0.6％；有机酸盐或无机酸盐，包括氯化物、硫酸盐、碳酸盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、或酒石酸盐中的任何一种，浓度为1.5-4％。
全文摘要
一种从发酵液中吸附乳酸链球菌肽的新方法，它采用两步吸附法，即先调节发酵液pH、菌体吸附、离心后上清夜再用国产食品级多孔硅化合物硅酸钙吸附的技术手段，从乳酸链球菌的发酵液中获得生物防腐剂乳酸链球菌肽，首先采用菌体本身在特定pH条件下吸附乳酸链球菌肽，再用廉价的国产硅酸钙吸附剂吸附，以减少化学吸附剂的使用量，降低在食品防腐中广泛应用的乳酸链球菌肽产品的后提取成本。
文档编号C07K1/14GK1724562SQ20041006939
公开日2006年1月25日 申请日期2004年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者庄绪亮, 邱季杰, 谢慧君 申请人:中国科学院生态环境研究中心