专利名称：肽的酰化方法和新酰化剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及将一个或多个酰基引入肽或蛋白质中的方法。更具体地说，本发明涉及将天然存在的GLP-1或其类似物中含有的赖氨酸残基的ε-氨基酰化的改进方法。而且，本发明还涉及在所述方法中用作酰化剂的化合物。
背景技术：
肽广泛用在医学实践中，而且由于其可通过重组DNA技术制备，可以预计，在未来许多年肽的重要性仍会增加。当天然肽或其类似物用于治疗时，往往发现它们具有高廓清率(high clearance)。当期望长时间保持高廓清率治疗试剂的高血液浓度时，由于需要重复给药，因此，使用高廓清率治疗试剂是麻烦的。具有高廓清率的天然肽的实例是ACTH(促肾上腺皮质激素)、促肾上腺皮质激素释放因子、血管紧张肽、降钙素、exendin、exendin-3、exendin-4、胰岛素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽-2、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2、肠抑胃肽、生长激素释放因子、垂体腺苷酸环化酶活化肽、促胰液素、促肠胃液素(enterogastrin)、促生长素抑制素、生长激素、促生长因子、甲状旁腺激素、血小板生成素、红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳激素、甲状腺刺激激素、内啡肽类、脑啡肽类、后叶加压素、催产素、阿片样物质(opiods)和其类似物、超氧物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、核糖核酸酶。
相对于天然肽(或其未修饰的类似物)，将亲脂性酰基导入天然存在的肽或其类似物中可得到作用时间延长了的酰化肽。该现象已在本申请人的下述在先申请中作了充分的描述和证明WO98/08871尤其公开了GLP-1和其类似物的酰化、WO98/08872尤其公开了GLP-2和其类似物的酰化和WO99/43708尤其公开了exendin和其类似物的酰化。而且认为，在亲脂性基团的附近包含带负电基团，如包含羧酸基团是有利的。
欧洲专利申请92107035.5(Kuraray Co.)描述了用于将长链羧酸导入蛋白质的长链二羧酸的活性单酯。
尤其感兴趣的是，可以通过单或二肽间隔基(spacers)将亲脂性酰基引入GLP-1中，并已在WO98/08871中提出和例解。并提出了用天冬氨酸和谷氨酸作为合适间隔基。然而，上述单或二肽间隔基含有多余的羧酸基团，因此，保护和随后的脱保护步骤是必须的。在酸性条件下脱保护在一定程度上破坏了肽(GLP-1)。因此，期望有制备这些变体的替代方法。
所以，本发明目的是提供一种通过α-氨基-α，ω-二羧酸间接基将亲脂基团引入肽中的替代方法。本发明方法能在亲脂基团的附近引入可带电的羧酸基团并且不会直接影响亲脂基团，因而该方法方便了修饰肽的制备。
发明内容
本发明提供了酰化肽(或蛋白质)上的一个或多个氨基的方法，该方法包括(a)在碱性条件下，在非质子传递极性溶剂和水的混合物中，将具有至少一个游离氨基的肽(或蛋白质)与通式I的酰化试剂反应， 其中，n＝0-8；R1是COOR4；R2是亲脂部分，例如，选自C3-39烷基、C3-39链烯基、C3-39链二烯基和甾族残基；R3与和R3连接的羧基一起表示活性酯或活性N-羟基亚氨酸酯；和R4选自氢、C1-12烷基和苄基；和(b)如果R4不是氢，在碱性条件下，皂化酰化了的肽的酯基(COOR4)；以得到N-酰化的肽(或N-酰化的蛋白质)。
现已发现，可以在碱性条件下皂化酰化了的肽酯(其中R4是烷基或苄基)，并且肽和间隔基的各个α-氨基酸片段仅有少量外消旋化或没有外消旋化。本申请人已发现，就纯度和抑制副产物，如，抑制降解产物而言，碱性皂化无疑优于现有技术采用的酸性水解。
现已发现，在碱性条件下使用游离酸(R4是氢)作为酰化剂进行酰化反应，确实基本上直接生成所需产物酰化肽，同时没有副产物形成并且无需脱保护步骤。
本发明还提供了在上述方法中用作酰化剂的新化合物，所述新化合物具有通式I 其中，n＝0-8；R1是COOH；R2是亲脂部分，例如，选自C3-39烷基、C3-39链烯基、C3-39链二烯基和甾族残基；和R3与和R3相连的羧基一起表示活性酯或活性N-羟基亚氨酸酯。
发明详述肽和蛋白质一般认为本发明可用于将亲脂酰基导入任何肽(或蛋白质)中，以降低其在体内的廓清率。所述肽和蛋白质的实例是ACTH(促肾上腺皮质激素)、促肾上腺皮质激素释放因子、血管紧张肽、降钙素、exendin和其类似物、胰岛素和其类似物、胰高血糖素和其类似物、胰高血糖素样肽-1和其类似物、胰高血糖素样肽-2和其类似物、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2、肠抑胃肽、生长激素释放因子、垂体腺苷酸环化酶活化肽、促胰液素、促肠胃液素(enterogastrin)、促生长素抑制素、生长激素、促生长因子、甲状旁腺激素、血小板生成素、红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳激素、甲状腺刺激激素、内啡肽类、脑啡肽类、后叶加压素、催产素、阿片样物质(opiods)和其类似物、超氧物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶和核糖核酸酶。
当然，肽(或蛋白质)应当含有至少一个游离氨基，所述氨基是N-末端氨基或侧链氨基。特别值得考虑的是赖氨酸和鸟氨酸氨基酸残基的氨基。本发明方法尤其涉及赖氨酸残基的ε-氨基的N-酰化作用。应当说明的是，本发明所研究的肽或蛋白质可含有两个或多个可全部都被N-酰化的侧氨基。
目前认为，本发明尤其适用于修饰GLP-1和其类似物。根据本发明，可被N-酰化的GLP-1和其类似物的实例是GLP-1和其截短的类似物，例如，Arg26-GLP-1(7-37)；Arg34-GLP-1(7-37)；Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)；Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Arg34Lys35-GLP-1(7-37)；Arg26Lys39-GLP-1(7-39)；Arg34Lys40-GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34-GLP-1(7-37)；Gly8Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Gly6Arg Lys39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys36，40-GLP-1+(7-40)；Arg26，34Lys36GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(7-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(7-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(7-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(7-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(7-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(1-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(1-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(1-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(1-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(1-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(1-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(1-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(1-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(2-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(2-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(2-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(2-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(2-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(2-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(2-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(2-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(3-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(3-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(3-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(3-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(3-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(3-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(3-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(3-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(4-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(4-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(4-40)；Ar926，34Lys41GLP-1(4-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(4-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(4-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(4-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(4-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(5-38)；Arg36，34Lys39GLP-1(5-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(5-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(5-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(5-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(5-43)；Arg26，34Lys-GLP-1(5-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(5-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(6-38)；Arg36，34Lys39GLP-1(6-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(6-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(6-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(6-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(6-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(6-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(6-45)；Arg36Lys38GLP-1(1-38)；Arg34Lys38GLP-1(1-38)；Arg26，34Lys36，38GLP-1(1-38)；Arg26Lys38GLP-1(7-38)；Arg34Lys38GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys36，38GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)；Arg Lys39GLP-1(1-39)；Arg34Lys39GLP-1(1-39)；Arg26，34Lys36，39GLP-1(1-39)；Arg26Lys39GLP-1(7-39)；Arg34Lys39GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36，39GLP-1(7-39)；Arg26-GLP-1(7-37)，Arg34-GLP-1(7-37)，Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26Lys38-GLP-1(7-37)，Arg34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26-GLP-1(7-37)，Gly6Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys36，38-GLP-1(7-38)，Gly8Arg26Lys38-GLP-1(7-38)；Gly8Arg26，34Lys36，38-GLP-1(7-38)；Gly8，Arg26，34，Glu37，Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26Lys39-GLP-1(7-39)，Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)，Gly8Arg26Lys39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)；Arg34Lys40-GLP-1(7-40)，Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)，Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40)和Gly8Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)。上述每个GLP-1类似物和其截短的类似物构成了本发明可供选择的实施方案。
目前认为，本发明还特别适用于修饰GLP-2和其类似物。根据本发明，可被N-酰化的GLP-2和其类似物的实例是GLP-2类似物和其截短的类似物，例如，Lys20GLP-2(1-33)；Lys20Arg30GLP-2(1-33)；Arg30Lys34GLP-2(1-34)；Arg30Lys35GLP-2(1-35)；Arg30，35Lys20GLP-2(1-35)；和Arg35GLP-2(1-35)。上述每个GLP-2类似物和其截短的类似物构成了本发明可供选择的目前认为，本发明还特别适用于修饰exendin和其类似物。根据本发明，可被N-酰化的exendin和其类似物的实例是exendin类似物和其截短的类似物，例如，exendin-3和exendin-4。上述每个exendin类似物和其截短的类似物构成了本发明可供选择的实施方案。
在本发明的其它实施方案中，N-酰化反应发生在赖氨酸残基的ε-氨基上。
在WO98/08871中充分公开了GLP-1和其类似物的效果。
在WO98/08872中充分公开了GLP-2和其类似物的效果。
在WO99/43708中充分公开了exendin和其类似物的效果。
酰化试剂在本发明方法中，将具有至少一个游离氨基的肽(或蛋白质)与通式I的酰化试剂反应， 在通式I中，整数n优选0-8，例如，对于天冬氨酸和谷氨酸等，n特别优选0-6。优选n是0-4，例如，n＝0-2，例如，n是0(天冬氨酸)或1(谷氨酸)。上述各整数或整数范围构成了本发明的备择实施方案。
通式I中的R1表示游离酸基(COOH)或酯基(COOR4)。当R1是酯基时，R4选自可在碱性条件下通过水解(以相应的醇的形式)除去的基团。所述基团的实例是C1-12烷基，例如，甲基、乙基、丙-1-基、丙-2-基、丁-1-基、丁-2-基、2-甲基丙-1-基、2-甲基-丙-2-基(叔丁基)和己-1-基等，和苄基。上述各基团构成了本发明的备选实施方案。
通式I中的R2表示被引入到肽或蛋白质中的亲脂部分。所述亲脂部分-般选自C3-39烷基、C3-39链烯基、C3-39链二烯基和甾族残基。C3-39烷基的具体实例是庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基和十九烷基。上述各亲脂基团构成了本发明的备选实施方案。
亲脂取代基或亲脂部分的特征在于，在20℃水中的溶解度为约0.1mg/100ml水-250mg/100ml水，优选为约0.3mg/100ml水-75mg/100ml水。例如，辛酸(C8)在20℃水中的溶解度为68mg/100ml水，癸酸(C10)在20℃水中的溶解度为15mg/100ml水，和十八烷酸(C18)在20℃水中的溶解度为0.3mg/100ml水。上述各亲脂取代基构成了本发明的备选实施方案。
术语“C3-39烷基”、“C3-39链烯基”和“C3-39链二烯基”分别包括C3-39直链和支链烃基，优选为直链饱和、单不饱和二不饱和的C3-39烃基。C3-39烷基的具体实例是庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基和十九烷基。
术语“甾族残基”是指亲脂基团，其与和R2相连的羰基一起衍生于甾族羧酸，即，衍生于三-、四-和五环全饱和或部分不饱和C16-36烃，所述基团R2-C(＝O)-的实例是石胆酸酰基(lithocholoyl)、脱氧胆酸酰基(deoxycholoyl)和胆酸酰基(choloyl)。
在上述亲脂基团中，特别合适的是C7-25烷基、C7-25链烯基、C7-25链二烯基和甾族残基。特别值得考虑的实例是庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、石胆酸酰基(lithocholoyl)、脱氧胆酸酰基(deoxycholoyl)和胆酸酰基(choloyl)。上述各亲脂基构成了本发明的备选实施方案。
通式I中的R3与和R3相连的羧基一起形成活性酯或活性的N-羟基亚氨酸酯。上述每种酯都构成了本发明的备选实施方案。活性酯或活性N-羟基亚氨酸酯是在有机化学(特别是肽化学)领域中已知的用于氨基、硫基和羟基的酰化作用的官能团。在本发明中，术语“活性酯或活性N-羟基亚氨酸酯”是指适用于将胺，优选将伯胺进行酰化的酯官能化形式的羧酸基团。不用说，活性酯或活性N-羟基亚氨酸酯对伯胺酰化反应的选择优于对羟基和硫基酰化反应的选择。特别优选活性N-羟基亚氨酸酯。
活性酯的实例是1-羟基苯并三唑酯和其衍生物。许多用于形成上述羧酸活性酯的高效试剂是已知的，例如，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐。上述活性酯通常在碱存在下，例如，在诸如三烷基胺的有机碱存在下就地形成。
活性N-羟基亚氨酸酯的酰亚胺部分的实例是那些在欧洲专利申请92107035.5第13页第3行-第17页第10行中具体公开的酰亚胺(在本发明中引作参考)。其中，特别值得考虑的酰亚胺部分的实例是琥珀酰亚胺和邻苯二甲酰亚胺等等。上述各种酰亚胺部分构成了本发明的备择实施方案。
通过相应的酸(即，N-酰化的α-羧基保护的二酸(R4不是氢))与等摩尔量(例如，0.95-1.05摩尔，优选1.0摩尔)相应酰亚胺的N-羟基酰亚胺缩合，可制得通式I的活性N-羟基亚氨酸酯。(另一方面，N-酰化的α-羧基保护的二酸通常可由相应的α-羧基保护的α-氨基二酸和亲脂部分的苯并三唑酯制备。按WO98/02460所描述的DCC偶合(实施例1-3)，例如，由酰氯和苯并三唑或由游离酸和苯并三唑可制得上述苯并三唑酯)。通常在脱水条件下，例如，在诸如碳化二亚胺偶联剂(例如，二环已基碳化二亚胺(DCC))的偶联剂存在下进行缩合。当存在偶联剂时，相对于酸，优选加入等摩尔量的偶联剂。反应通常在诸如无水四氢呋喃(THF)、无水二甲基甲酰胺(DMF)、无水丙酮、无水二氯甲烷、无水二氧六环、无水二甲基乙酰胺或无水N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的极性非质子传递溶剂中进行。通常在0-50℃，例如，在诸如室温的5-30℃下进行反应1-96小时，例如，进行反应4-36小时。一组可能的反应试剂和反应条件如下将上述的N-羟基酰亚胺(例如，琥珀酰亚胺或邻苯二甲酰亚胺)和酸以约1∶1的摩尔比溶解在无水THF或无水DMF(或其混合物)中，并向溶液中加入等摩尔量的DCC。在N-羟基酰亚胺和酸反应完成后，通过诸如过滤(如果使用DCC偶联剂，则过滤出二环己基脲(DCU)沉淀)、结晶、重结晶和色谱等常规方法分离和提纯产物。一种可能的提纯途径包括通过过滤除去用过的沉淀偶联剂，减压蒸发溶剂，将产物再悬浮在，例如，丙酮中，过滤，加入非极性溶剂，例如，加入已烷进行结晶，并任选进行重结晶和/或洗涤。产物可直接在本发明方法中用作式I的酰化试剂。
当以游离α-羧酸的形式(R4是氢)使用通式I的酰化试剂时，将其中R4为可被选择性除去的基团的通式I的化合物转化成相应的R4是氢的化合物。羧酸保护基团可以是能通过催化氢化除去的苄基或是能选择性除去的烯丙基。室温下，在极性非质子传递溶剂，例如，丙酮中，使用钯碳和氢，通过催化氢化可除去苄基保护基。反应可以在密闭容器中和氢气气氛(一般为0.1-10atm)下剧烈搅拌进行。根据钯催化剂的重量，通常在0.5-12小时内完成反应。使用常规处理方法。
相信R4是氢的通式I的化合物是新化合物，这些化合物构成了本发明的特征。因此，本发明还提供了通式I的新化合物 其中，n＝0-8；R1是COOH；R2是亲脂基团，例如，选自C3-39烷基、C3-39链烯基、C3-39链二烯基和甾族残基；和R3与和R3相连的羧基一起表示活性酯或活性N-羟基亚氨酸酯。
反应条件在碱性条件下，在极性非质子传递溶剂与水的混合物中，进行通式I的酰化试剂与肽或蛋白质的反应。
相对于待酰化的肽的氨基数量，通常使用稍稍过量的通式I的酰化试剂。考虑到肽中的氨基数量，上述比例通常为1∶1-1∶20，优选为1∶1.2-1∶5，并且酰化试剂过量。
应当理解的是，根据使用的酰化试剂的量和反应条件，可以将肽完全或部分N-酰化。优选N-酰化反应基本上按化学计量进行。
通常，极性非质子传递溶剂选自无水四氢呋喃(THF)、无水二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、二氯甲烷、二甲亚砜(DMSO)、二氧六环、二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮和其混合物。其中，优选二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮，特别优选N-甲基-2-吡咯烷酮。通常，极性非质子传递溶剂与水(例如，N-甲基-2-吡咯烷酮与水)的比例为1∶10-10∶1，优选为1∶5-5∶1，特别优选为1∶1-3∶1。
反应温度一般保持在-10-50℃，优选0-25℃。
为使反应平稳进行，溶剂混合物的pH值为7-14，例如，9-13，优选为9.5-12.5是重要的。当溶剂混合物的pH值为10-12时，通常收率和纯度最佳。通过加入诸如氢氧化钠和氢氧化钾的碱金属氢氧化物和/或诸如三烷基胺(例如，三乙基胺、N，N-二异丙基乙基胺等)的有机碱，得到所需pH值。
进行步骤(a)反应的典型实例是使用1∶1-1∶5摩尔比的蛋白质和通式I的酰化试剂。通常在-10-30℃，例如，在0-25℃，预先将肽溶解在水中，用碱金属氢氧化物(例如，氢氧化钠或氢氧化钾)调节溶液的pH值至所需值。使用酸，例如，乙酸和碱，例如，三烷基胺可进一步调节pH值，但优选将温度保持在上述范围内。然后加入极性非质子传递溶剂(或溶剂混合物)。随后加入酰化试剂。在加入水和酸，例如，乙酸调节pH值至6.5-9.0之前，通常要使反应完全进行(用HPLC监控)，反应完全进行所需时间通常为0.2-4小时，例如，0.2-1小时。产物通常用HPLC分离和提纯，或通过等电pH值沉淀，或在提纯之前进行水解(步骤(b))。
当使用R4是氢的酰化试剂时，直接得到带有亲脂部分和游离羧基的N-酰化的肽或蛋白质。因此，R4是氢的各种酰化试剂代表了本发明方法的另外，即，当R4是C1-12烷基或苄基时，在碱性条件下将N-酰化的肽酯(或蛋白质酯)皂化，以得到N-酰化的肽或N-酰化的蛋白质。皂化反应通常在0.01-4.0M的诸如氢氧化钠或氢氧化钾的碱金属氢氧化物溶液中进行。溶液pH一般为10-14。反应通常在0-40℃，例如，在室温下，进行0.1-12小时，优选进行0.5-4小时。反应完成后，通过例如在等电pH值下沉淀和/或通过制备HPLC可提纯产物。因此，R4是C1-12烷基或苄基的各种酰化试剂是本发明方法的优选实施方案。
本发明还涉及下述方面1.一种酰化肽或蛋白质的氨基的方法，该方法包括(a)在碱性条件下，在非质子传递极性溶剂和水的混合物中，将具有至少一个游离氨基的肽与通式I的酰化试剂反应， 其中，n＝0-8；R1是COOR4；R2是亲脂部分；R3与和R3相连的羧基一起表示活性酯或活性N-羟基亚氨酸酯；和R4选自氢、C1-12烷基和苄基；和(b)如果R4不是氢，在碱性条件下皂化酰化了的肽的酯基(COOR4)；以得到N-酰化的肽。
2.根据1的方法，其中R4是氢。
3.根据1的方法，其中R4选自C1-8的烷基和苄基。
4.根据1-3的任一方法，其中R3与和R3相连的羧基一起表示活性N-羟基亚氨酸酯。
5.根据1-4的任一方法，其中非质子传递极性溶剂和水的混合物是1∶5-5∶1的N-甲基-2-吡咯烷酮和水的混合物。
6.根据1-5的任一方法，其中步骤(a)中反应混合物的pH值为9-13。
7.根据1-6的任一方法，其中步骤(a)的反应温度为0-50℃。
8.根据3-7的任一方法，其中在pH值为10-14的条件下皂化酰化的肽酯。
9.根据上述任一方法，其中R2选自C3-39烷基、C3-39C链烯基、C3-39链二烯基和甾族残基。
10.通式I的化合物 其中，n＝0-8；R1是COOH；R2是亲脂部分；R3与和R3相连的羧基一起表示活性酯或活性N-羟基亚氨酸酯。
11.根据10的化合物，其中n为0或1，R3与和R3相连的羧基一起形成活性N-羟基亚氨酸酯。
12.根据10-11的任一化合物，其中R2选自C3-39烷基、C3-39链烯基、C3-39链二烯基和甾族残基。
实施例原料的制备实施例1N-十六烷酰基谷氨酸α-苄酯的制备在20-25℃下，将谷氨酸α-苄酯(4.75g，20.0mmol)悬浮于N-甲基-2-吡咯烷酮(100ml)中。加入三乙胺(2.53g，25.0mmol)，然后加入1-十六烷酰基苯并三唑(7.15g，20.0mmol)。在20-25℃下，搅拌反应混合物22小时。向所得溶液中加入0.2M(250ml)盐酸。将所得悬浮液冷却至0℃下3小时。过滤分离产物，用水(50ml×4)洗涤，并在40℃下减压干燥至恒重。
收率9.15g(96％)白色物质，用示差扫描量热法(DSC)测定熔点为90.0℃(峰值)。
实施例2
N-十六烷酰基谷氨酸α-甲酯的制备在类似于实施例1的反应条件下，用8.06g(50.0mmol)谷氨酸α-甲酯制备N-十六烷酰基谷氨酸α-甲酯。
收率17.70g(88％)白色物质，用DSC测定熔点为95.4℃(峰值)。
实施例3N-十六烷酰基谷氨酸α-苄酯γ-N-羟基琥珀酰亚氨酸酯的制备在20-25℃下，将N-十六烷酰基谷氨酸α-苄酯(23.78g，50.0mmol)溶解于四氢呋喃(200ml)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(5.75g，50.0mmol)，然后加入二环己基碳化二亚胺(10.32g，50.0mmol)。在20-25℃下搅拌反应混合物20小时。过滤所得悬浮液，并减压蒸发滤液至干。在40℃，将结晶残余物溶解在丙酮(100ml)中，并通过过滤使其澄清。向所得滤液中加入正庚烷(300ml)。在20-25℃下搅拌所得悬浮液4小时，然后冷却至0℃并保温0.5小时。过滤分离产物，用正庚烷(50ml×3)洗涤，并在40℃减压干燥至恒重。
收率23.75g(83％)白色物质，用DSC测定熔点为98.6℃(峰值)。
实施例4N-十六烷酰基谷氨酸α-甲酯γ-N-羟基琥珀酰亚氨酸酯的制备在类似于实施例3的反应条件下，用8.00g(20.0mmol)N-十六烷酰基谷氨酸α-甲酯制备N-十六烷酰基谷氨酸α-甲酯γ-N-羟基琥珀酰亚氨酸酯。
收率6.45g(65％)白色物质，用DSC测定熔点为106.0℃(峰值)。
实施例5N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基琥珀酰亚氨酸酯的制备在20-25℃下，将N-十六烷酰基谷氨酸α-苄酯γ-N-羟基琥珀酰亚氨酸酯(5.73g，10.0mmol)溶解于丙酮(100ml)中。加入10％膏状钯碳(约0.25g干燥物)。在氢气气氛下搅拌悬浮液直至不再消耗氢气(290ml氢气，45分钟)。滤除催化剂，在20-25℃下减压蒸发滤液至干。在20-25℃下，将残余物溶解于丙酮(25ml)中，并通过过滤使其澄清。向滤液中加入正庚烷(200ml)。在20-25℃下搅拌所得悬浮液1小时。过滤分离产物，用正庚烷(50ml×2)洗涤，并在40℃减压干燥至恒重。
收率4.20g(87％)白色物质，用DSC测定熔点为100.8℃(峰值)。
酰化的GLP-1类似物的制备实施例6Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37的制备在0-5℃，将Arg34-GLP-17-37(同种沉淀的冷冻肽物料5.0g，约0.15mmol)溶解于水(25ml)中。加入1.0M氢氧化钠溶液(2.25ml)将溶液的pH值调节至12.5。2分钟后，加入N-甲基-2-吡咯烷酮(50ml)和1.0M乙酸(1.25ml)，并保持温度为15℃。加入三乙胺(0.2ml)，然后加入N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基琥珀酰亚氨酸酯(97.0mg，0.20mmol)。在15℃下放置30分钟后，加入水(50ml)，并加入1.0M乙酸(1.70ml)将溶液的pH值调节至8.0。
收率通过分析RP-HPLC，表明反应混合物含有77％(峰面积)Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
通过柱色谱得到最终提纯的产物。
实施例7Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu-OMe(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37的制备在类似于实施例6的反应条件下，使用N-十六烷酰基谷氨酸α-甲酯γ-N-羟基琥珀酰亚氨酸酯酰化Arg34-GLP-17-37。
收率通过分析RP-HPLC，表明反应混合物含有64％(峰面积)Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu-OMe(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。使用1M乙酸调节反应混合物的pH值至6.0，从而分离出作为沉淀的产物。或者，反应混合物可直接用于下述实施例8。
实施例8Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37的制备用1M氢氧化钠调节实施例7得到的含有产物的反应混合物的pH值至12-13，进行碱性水解。将反应混合物的温度保持在8-18℃。2小时后完成反应，加入1M乙酸调节反应混合物的pH值至7.45。
收率通过分析RP-HPLC，表明反应混合物含有65％(峰面积)Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
通过柱色谱得到最终提纯的产物。
实施例9
类似于实施例6的化合物制备下述化合物，并通过柱色谱得到最终提纯的产物。
Arg26，34，Lys36-(N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基)))-GLP-17-36，Arg26，Lys34-(N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基)))-GLP-17-37，和Gly8，Arg26，34，Glu37，Lys38-(N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基)))-GLP-17-38。
权利要求
1.一种酰化肽或蛋白质的氨基的方法，该方法包括(a)在碱性条件下，在非质子传递极性溶剂和水的混合物中，将具有至少一个游离氨基的肽与通式I的酰化试剂反应， 其中，n＝0-8；R1是COOR4；R2是亲脂部分；R3与和R3相连的羧基一起表示活性酯或活性N-羟基亚氨酸酯；和R4选自氢、C1-12烷基和苄基；和(b)如果R4不是氢，在碱性条件下皂化酰化了的肽酯基(COOR4)；以得到N-酰化的肽。
2.根据权利要求1的方法，其中R4是氢。
3.根据权利要求1的方法，其中R4选自C1-8烷基和苄基。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中R3与和R3相连的羧基一起表示活性N-羟基亚氨酸酯。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中非质子传递溶剂和水的混合物是1∶5-5∶1的N-甲基-2-吡咯烷酮和水的混合物。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤(a)中反应混合物的pH值为9-13。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中步骤(a)中反应混合物的温度为0-50℃。
8.根据权利要求3-7中任一项的方法，其中在pH值为10-14的条件下皂化酰化的肽酯。
9.根据上述任一权利要求的方法，其中R2选自C3-39烷基、C3-39链烯基、C3-39链二烯基和甾族残基。
10.根据上述任一权利要求的方法，其中R2选自C7-25烷基。
11.根据上述任一权利要求的方法，其中所述肽选自GLP-1(1-37)和其类似物、exendin和其类似物和GLP-2(1-34)和其类似物。
12.根据上述任一权利要求的方法，其中所述肽选自exendin-3、exendin-4、Arg26-GLP-1(7-37)、Arg34-GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-37)、Thr8GLP-1(7-37)、Met8GLP-1(7-37)、Gly8GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-36)酰胺、Thr8GLP-1(7-36)酰胺、Met8GLP-1(7-36)酰胺和Gly8GLP-1(7-36)酰胺。
13.通式I的化合物 其中，n＝0-8；R1是COOH；R2是亲脂部分；R3与和R3相连的羧基一起表示活性酯或活性N-羟基亚氨酸酯。
14.根据权利要求13的化合物，其中n为0或1，R3与和R3相连的羧基一起表示活性N-羟基亚酸酯。
15.根据权利要求13-14中任一项的化合物，其中R2选自C3-39烷基、C3-39链烯基、C3-39链二烯基和甾族残基。
全文摘要
本发明提供了一种酰化肽(或蛋白质),例如,GLP－1的一个或多个氨基(通常为赖氨酸的氨基)的方法,该方法包括(a)在碱性条件下,在非质子传递极性溶剂和水(例如,N－甲基－2－吡咯烷酮和水)的混合物中,将具有至少一个游离氨基的肽(或蛋白质)与通式I的酰化试剂反应,其中,n=0－8;R
文档编号C07K1/08GK1344248SQ00805003
公开日2002年4月10日 申请日期2000年3月16日 优先权日1999年3月17日
发明者路易斯·B·汉森 申请人:诺沃挪第克公司