专利名称：利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物发酵生产凝乳酶的方法。
背景技术：
凝乳酶属于酸性蛋白酶，又称天冬氨酸蛋白酶，是生产干酪不可缺少的制剂。凝乳 酶的传统来源是哺乳期期小牛的皱胃，动物凝乳酶及其凝乳活力与蛋白水解能力的高比值 成为制作奶酪的首选酶，但是动物生长缓慢且价格昂贵，容易增加企业成本，并且从动物中 提取酶液程序和工艺较复杂。木瓜、无花果、菠萝、南瓜、合欢树、银杏等植物中都含有能使 乳凝固的蛋白酶，植物来源的凝乳酶因有太高的蛋白水解活力或本身有毒，因此很多植物 性凝乳酶没有得到大规模商业化应用。微生物凝乳酶来源广泛，目前发现有40余种微生物可发酵生产凝乳酶，这些微生 物主要是放线菌、细菌和真菌等，由于微生物发酵的方法控制容易，成本低，且安全无毒，而 被广泛使用。目前微生物发酵生产凝乳酶的氮源主要来自大豆组织蛋白和玉米粉，生产成 本较高。乳酸链球菌素生产中所产生的废物菌体直接排放对环境造成污染，做成菌体蛋白 饲料成本高，附加值低，而废物菌体经水解后则含有丰富的有机氮源，可作为凝乳酶发酵的 原料，另一方面降低发酵生产凝乳酶中的生产成本。
发明内容
本发明是为了解决目前微生物发酵生产凝乳酶的成本高，乳酸链球菌素生产中所 产生的废物菌体直接排放造成环境污染、做成菌体蛋白饲料成本高、附加值低的问题，而提 供一种利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳酶的方法。本发明利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳酶的方法，可以按以 下步骤实现一、利用酶水解或酸水解的方法水解乳酸链球菌，得到乳酸链球菌水解液； 二、利用步骤一得到的乳酸链球菌水解液配制培养基将NaH2PCV Na2HPO4、葡萄糖、高温淀 粉酶、吐温80、玉米粉、乳酸链球菌水解液和大豆组织蛋白溶解于水中配制培养基，其中 NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高温淀粉酶:20g/L，吐温 80 0. 13g/ L，玉米粉70g/L，乳酸链球菌水解液60 160g/L，大豆组织蛋白0 20g/L，用质量浓度 为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，装入250mL三角瓶中，在0. 14Mpa压力下灭菌 30min ；三、接种将米黑根毛霉接入种子液培养基中，然后在摇床的转速为260 280rpm， 温度为37 38°C条件下培养20 24h，再将接种培养后的种子液培养基按体积比1 40 的量接种到步骤二中的三角瓶中；四、培养将三角瓶于37 38°C条件下放在摇床上培养， 摇床的转速为260 280rpm，培养96h，即得到凝乳酶；其中步骤二中乳酸链球菌水解液的 总含氮量为0.922% (质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8% (质量)；步骤二中培养基的装 入量为三角瓶体积的20% ；步骤三中种子液培养基按照下列浓度配制=NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高温淀粉酶:20g/L，吐温 80 0. 13g/L，玉米粉:70g/L， 大豆组织蛋白18g/L，将它们溶解在水中，250mL三角瓶培养基装量为20%，用质量浓度为 5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa压力下灭菌30min，最终得到种子液中 米黑根毛霉浓度为2 6X 106cfu/mL。本发明利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳酶，减少了乳酸链球菌 素生产中所产生的废物菌体直接排放对环境造成的污染，作为凝乳酶发酵的原料，降低了 发酵生产凝乳酶的成本。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳 酶的方法，按以下步骤实现一、利用酶水解或酸水解的方法水解乳酸链球菌，得到乳酸链 球菌水解液；二、利用步骤一得到的乳酸链球菌水解液配制培养基将NaH2PCV Na2HPO4、葡 萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、乳酸链球菌水解液和大豆组织蛋白溶解于水中配制培 养基，其中 NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高温淀粉酶:20g/L，吐温 80 0. 13g/L，玉米粉:70g/L，乳酸链球菌水解液60 160g/L，大豆组织蛋白0 20g/L, 用质量浓度为5 6 %的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，装入250mL三角瓶中，在0. 14Mpa压 力下灭菌30min ；三、接种将米黑根毛霉接入种子液培养基中，然后在摇床的转速为260 280rpm，温度为37 38°C条件下培养20 24h，再将接种培养后的种子液培养基按体积比 1 40的量接种到步骤二中的三角瓶中；四、培养将三角瓶于37 38°C条件下放在摇床上 培养，摇床的转速为260 280rpm，培养96h，即得到凝乳酶；其中步骤二中乳酸链球菌水 解液的总含氮量为0.922% (质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8% (质量)；步骤二中培 养基的装入量为三角瓶体积的20% ；步骤三中种子液培养基按照下列浓度配制=NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L,葡萄糖2. 14g/L，高温淀粉酶:20g/L,吐温 80 0. 13g/L，玉米 粉70g/L，大豆组织蛋白18g/L，将它们溶解在水中，250mL三角瓶培养基装量为20%，用 质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa压力下灭菌30min，最终得 到种子液中米黑根毛霉浓度为2 6X 106cfu/mL。本实施方式中米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)保藏于中国普通微生物菌种保藏 管理中心，菌种保藏编号为AS 3. 4960。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中酶水解的方法 是按下述操作进行的用动物蛋白酶水解乳酸链球菌，动物蛋白酶的添加重量是乳酸链球 菌菌体湿重的0. 45%，在PH为6. 75、温度为55°C水浴条件下水解8h，然后再升温至85°C保 持lOmin，得到乳酸链球菌水解液。其他与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中酸水解的方法 是按下述操作进行的采用盐酸将乳酸链球菌的PH值调至1.0，然后在121°C的条件下水解 12h，得到乳酸链球菌水解液。其他与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一、二或三不同的是步骤二中加入 的乳酸链球菌水解液浓度为70 150g/L。其他与具体实施方式
一、二或三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
四不同的是步骤二中加入的乳酸链 球菌水解液浓度为75 140g/L。其他与具体实施方式
四相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
五不同的是步骤二中加入的乳酸链 球菌水解液浓度为78g/L。其他与具体实施方式
五相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
六不同的是步骤二中加入的大豆组 织蛋白浓度为3. 6 9. Og/L。其他与具体实施方式
六相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
七不同的是步骤二中加入的大豆组 织蛋白浓度为5.4g/L。其他与具体实施方式
七相同。
具体实施方式
九本实施方式利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳 酶的方法，按以下步骤实现一、用动物蛋白酶水解乳酸链球菌，动物蛋白酶的添加重量是 乳酸链球菌菌体湿重的0. 45%，在PH为6. 75、温度为55°C水浴条件下水解8h，然后再升 温至85°C保持lOmin，得到乳酸链球菌水解液；二、利用步骤一得到的乳酸链球菌水解液配 制培养基将NaH2P04、Na2HPO4、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉和乳酸链球菌水解液 溶解于水中配制培养基，其中NaH2PO4 3. 25g/L, Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高温淀 粉酶20g/L，吐温80 0. 13g/L，玉米粉70g/L，乳酸链球菌水解液156g/L，用质量浓度为 5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6.8，在0. 14Mpa压力下灭菌30min ；三、接种将米黑根 毛霉接入种子液培养基中，然后在摇床的转速为260 280rpm，温度为37 38°C条件下 培养20 24h，再将接种培养后的种子液培养基按体积比1 :40的量接种到步骤二中的三 角瓶中；四、培养将三角瓶于37 38°C条件下放在摇床上培养，摇床的转速为260rpm，培 养96h，即得到凝乳酶；其中步骤二中乳酸链球菌水解液的总含氮量为0.922% (质量)；步 骤二中培养基的装入量为三角瓶体积的20% ；步骤三中种子液培养基按照下列浓度配制 NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L,葡萄糖2. 14g/L，高温淀粉酶:20g/L，吐温 80 0. 13g/ L，玉米粉70g/L，大豆组织蛋白18g/L，将它们溶解在水中，250mL三角瓶培养基装量为 20%,用质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa压力下灭菌30min， 最终得到种子液中米黑根毛霉浓度为2 6X 106cfu/mL。本实施方式生产的凝乳酶经检测活力为47. 5IMCU/ml。
具体实施方式
十本实施方式利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳 酶的方法，按以下步骤实现一、用动物蛋白酶水解乳酸链球菌，动物蛋白酶的添加重量是 乳酸链球菌菌体湿重的0. 45%，在pH为6. 75、温度为55°C水浴条件下水解8h，然后再升 温至85°C保持lOmin，得到乳酸链球菌水解液；二、利用步骤一得到的乳酸链球菌水解液配 制培养基将NaH2P04、Na2HPO4、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、乳酸链球菌水解液和 大豆组织蛋白溶解于水中配制培养基，其中NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖 2. 14g/L，高温淀粉酶:20g/L,吐温80 0. 13g/L，玉米粉:70g/L，乳酸链球菌水解液:140g/ L，大豆组织蛋白1. 8g/L，用质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa 压力下灭菌30min;三、接种将米黑根毛霉接入种子液培养基中，然后在摇床的转速为 260 280rpm，温度为37 38°C条件下培养20 24h，再将接种培养后的种子液培养基按 体积比1 40的量接种到步骤二中的三角瓶中；四、培养将三角瓶于37 38°C条件下放 在摇床上培养，摇床的转速为260rpm，培养96h，即得到凝乳酶；其中步骤二中乳酸链球菌 水解液的总含氮量为0.922% (质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8% (质量)；步骤二中培养基的装入量为三角瓶体积的20%;步骤三中种子液培养基按照下列浓度配制=NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高温淀粉酶:20g/L,吐温 80 0. 13g/L，玉米 粉70g/L，大豆组织蛋白18g/L，将它们溶解在水中，250mL三角瓶培养基装量为20%，用 质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa压力下灭菌30min，最终得 到种子液中米黑根毛霉浓度为2 6X 106cfu/mL。本实施方式生产的凝乳酶经检测活力为55. 2IMCU/ml。
具体实施方式
十一本实施方式利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝 乳酶的方法，按以下步骤实现一、用动物蛋白酶水解乳酸链球菌，动物蛋白酶的添加重量 是乳酸链球菌菌体湿重的0. 45%，在pH为6. 75、温度为55°C水浴条件下水解8h，然后再 升温至85°C保持lOmin，得到乳酸链球菌水解液；二、利用步骤一得到的乳酸链球菌水解液 配制培养基将NaH2PCV Na2HPO4、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、乳酸链球菌水解液 和大豆组织蛋白溶解于水中配制培养基，其中NaH2PO4 3. 25g/L, Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖
2.14g/L，高温淀粉酶:20g/L,吐温80 0. 13g/L，玉米粉:70g/L，乳酸链球菌水解液:125g/ L，大豆组织蛋白3. 6g/L，用质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa 压力下灭菌30min;三、接种将米黑根毛霉接入种子液培养基中，然后在摇床的转速为 260 280rpm，温度为37 38°C条件下培养20 24h，再将接种培养后的种子液培养基按 体积比1 40的量接种到步骤二中的三角瓶中；四、培养将三角瓶于37 38°C条件下放 在摇床上培养，摇床的转速为260rpm，培养96h，即得到凝乳酶；其中步骤二中乳酸链球菌 水解液的总含氮量为0.922% (质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8% (质量)；步骤二中 培养基的装入量为三角瓶体积的20%;步骤三中种子液培养基按照下列浓度配制=NaH2PO4
3.25g/L，Na2HPO4 3. llg/L,葡萄糖2. 14g/L，高温淀粉酶:20g/L,吐温 80 0. 13g/L，玉米 粉70g/L，大豆组织蛋白18g/L，将它们溶解在水中，250mL三角瓶培养基装量为20%，用 质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa压力下灭菌30min，最终得 到种子液中米黑根毛霉浓度为2 6X 106cfu/mL。本实施方式生产的凝乳酶经检测活力为75. lIMCU/ml。
具体实施方式
十二 本实施方式利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝 乳酶的方法，按以下步骤实现一、用动物蛋白酶水解乳酸链球菌，动物蛋白酶的添加重量 是乳酸链球菌菌体湿重的0. 45%，在pH为6. 75、温度为55°C水浴条件下水解8h，然后再 升温至85°C保持lOmin，得到乳酸链球菌水解液；二、利用步骤一得到的乳酸链球菌水解液 配制培养基将NaH2PCV Na2HPO4、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、乳酸链球菌水解液 和大豆组织蛋白溶解于水中配制培养基，其中NaH2PO4 3. 25g/L, Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖 2. 14g/L，高温淀粉酶:20g/L,吐温80 0. 13g/L，玉米粉:70g/L，乳酸链球菌水解液:109g/ L，大豆组织蛋白5. 4g/L，用质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa 压力下灭菌30min;三、接种将米黑根毛霉接入种子液培养基中，然后在摇床的转速为 260 280rpm，温度为37 38°C条件下培养20 24h，再将接种培养后的种子液培养基按 体积比1 40的量接种到步骤二中的三角瓶中；四、培养将三角瓶于37 38°C条件下放 在摇床上培养，摇床的转速为260rpm，培养96h，即得到凝乳酶；其中步骤二中乳酸链球菌 水解液的总含氮量为0.922% (质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8% (质量)；步骤二中 培养基的装入量为三角瓶体积的20%;步骤三中种子液培养基按照下列浓度配制=NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高温淀粉酶:20g/L,吐温 80 0. 13g/L，玉米 粉70g/L，大豆组织蛋白18g/L，将它们溶解在水中，250mL三角瓶培养基装量为20%，用 质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa压力下灭菌30min，最终得 到种子液中米黑根毛霉浓度为2 6X 106cfu/mL。本实施方式生产的凝乳酶经检测活力为91. 8IMCU/ml。
具体实施方式
十三本实施方式利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产 凝乳酶的方法，按以下步骤实现一、用动物蛋白酶水解乳酸链球菌，动物蛋白酶的添加重 量是乳酸链球菌菌体湿重的0. 45%，在pH为6. 75、温度为55°C水浴条件下水解8h，然后 再升温至85°C保持lOmin，得到乳酸链球菌水解液；二、利用步骤一得到的乳酸链球菌水 解液配制培养基将NaH2PCV Na2HPO4、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、乳酸链球菌水 解液和大豆组织蛋白溶解于水中配制培养基，其中NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡 萄糖2. 14g/L，高温淀粉酶:20g/L,吐温80 0. 13g/L，玉米粉:70g/L，乳酸链球菌水解液 93. 6g/L，大豆组织蛋白7. 2g/L，用质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在 0. 14Mpa压力下灭菌30min ；三、接种将米黑根毛霉接入种子液培养基中，然后在摇床的转 速为260 280rpm，温度为37 38°C条件下培养20 24h，再将接种培养后的种子液培养 基按体积比1 :40的量接种到步骤二中的三角瓶中；四、培养将三角瓶于37 38°C条件下 放在摇床上培养，摇床的转速为260rpm，培养96h，即得到凝乳酶；其中步骤二中乳酸链球 菌水解液的总含氮量为0.922% (质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8% (质量)；步骤二中 培养基的装入量为三角瓶体积的20%;步骤三中种子液培养基按照下列浓度配制=NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L,葡萄糖2. 14g/L，高温淀粉酶:20g/L,吐温 80 0. 13g/L，玉米 粉70g/L，大豆组织蛋白18g/L，将它们溶解在水中，250mL三角瓶培养基装量为20%，用 质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa压力下灭菌30min，最终得 到种子液中米黑根毛霉浓度为2 6X 106cfu/mL。本实施方式生产的凝乳酶经检测活力为115.3IMCU/ml。
具体实施方式
十四本实施方式利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝 乳酶的方法，按以下步骤实现一、用动物蛋白酶水解乳酸链球菌，动物蛋白酶的添加重量 是乳酸链球菌菌体湿重的0. 45%，在pH为6. 75、温度为55°C水浴条件下水解8h，然后再 升温至85°C保持lOmin，得到乳酸链球菌水解液；二、利用步骤一得到的乳酸链球菌水解液 配制培养基将NaH2PCV Na2HPO4、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、乳酸链球菌水解液 和大豆组织蛋白溶解于水中配制培养基，其中NaH2PO4 3. 25g/L, Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖 2. 14g/L，高温淀粉酶20g/L，吐温80 0. 13g/L，玉米粉70g/L，乳酸链球菌水解液78g/L， 大豆组织蛋白9g/L，用质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa压 力下灭菌30min ；三、接种将米黑根毛霉接入种子液培养基中，然后在摇床的转速为260 280rpm，温度为37 38°C条件下培养20 24h，再将接种培养后的种子液培养基按体积比 1 40的量接种到步骤二中的三角瓶中；四、培养将三角瓶于37 38°C条件下放在摇床 上培养，摇床的转速为260rpm，培养96h，即得到凝乳酶；其中步骤二中乳酸链球菌水解液 的总含氮量为0.922% (质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8% (质量)；步骤二中培养基的 装入量为三角瓶体积的20% ；步骤三中种子液培养基按照下列浓度配制=NaH2PO4 3. 25g/ L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖:2· 14g/L，高温淀粉酶:20g/L，吐温 80 :0· 13g/L，玉米粉:70g/L，大豆组织蛋白18g/L，将它们溶解在水中，250mL三角瓶培养基装量为20%，用质量浓度 为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa压力下灭菌30min，最终得到种子液 中米黑根毛霉浓度为2 6X 106cfu/mL。本实施方式生产的凝乳酶经检测活力为134.0IMCU/ml。
具体实施方式
十五本实施方式利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝 乳酶的方法，按以下步骤实现一、采用盐酸将乳酸链球菌的PH值调至1.0，然后在121°C的 条件下水解12h，得到乳酸链球菌水解液；二、利用步骤一得到的乳酸链球菌水解液配制培 养基将NaH2P04、Na2HP04、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉和乳酸链球菌水解液溶解于 水中配制培养基，其中NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高温淀粉酶 20g/L，吐温80 0. 13g/L，玉米粉70g/L，乳酸链球菌水解液160g/L，将它们溶解于水中， 用质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa压力下灭菌30min ；三、接 种将米黑根毛霉接入种子液培养基中，然后在摇床的转速为260 280rpm，温度为37 38°C条件下培养20 24h，再将接种培养后的种子液培养基按体积比1 40的量接种到步 骤二中的三角瓶中；四、培养将三角瓶于37 38°C条件下放在摇床上培养，摇床的转速为 260rpm，培养96h，即得到凝乳酶；其中步骤二中乳酸链球菌水解液的总含氮量为0. 922% (质量)；步骤二中培养基的装入量为三角瓶体积的20%;步骤三中种子液培养基按照下列 浓度配制=NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高温淀粉酶:20g/L，吐温 80 0. 13g/L，玉米粉70g/L，大豆组织蛋白18g/L，将它们溶解在水中，250mL三角瓶培养 基装量为20%，用质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa压力下灭 菌30min，最终得到种子液中米黑根毛霉浓度为2 6 X 106cfu/mL。本实施方式生产的凝乳酶经检测活力为84. 0IMCU/ml。
具体实施方式
十六本实施方式利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝 乳酶的方法，按以下步骤实现一、采用盐酸将乳酸链球菌的PH值调至1.0，然后在121°C的 条件下水解12h，得到乳酸链球菌水解液；二、利用步骤一得到的乳酸链球菌水解液配制培 养基将NaH2PCV Na2HPO4、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、乳酸链球菌水解液和大豆 组织蛋白溶解于水中配制培养基，其中NaH2PO4 3. 25g/L, Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/ L,高温淀粉酶20g/L，吐温80 0. 13g/L，玉米粉70g/L，乳酸链球菌水解液80g/L，大豆组 织蛋白9g/L，然后用质量浓度为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa压力 下灭菌30min ；三、接种将米黑根毛霉接入种子液培养基中，然后在摇床的转速为260 280rpm，温度为37 38°C条件下培养20 24h，再将接种培养后的种子液培养基按体积比 1 40的量接种到步骤二中的三角瓶中；四、培养将三角瓶于37 38°C条件下放在摇床 上培养，摇床的转速为260rpm，培养96h，即得到凝乳酶；其中步骤二中乳酸链球菌水解液 的总含氮量为0.922% (质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8% (质量)；步骤二中培养基的 装入量为三角瓶体积的20% ；步骤三中种子液培养基按照下列浓度配制=NaH2PO4 3. 25g/ L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖:2· 14g/L，高温淀粉酶:20g/L，吐温 80 :0· 13g/L，玉米粉:70g/ L，大豆组织蛋白18g/L，将它们溶解在水中，250mL三角瓶培养基装量为20%，用质量浓度 为5 6%的氢氧化钠调pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa压力下灭菌30min，最终得到种子液 中米黑根毛霉浓度为2 6X 106cfu/mL。本实施方式生产的凝乳酶经检测活力为118.5IMCU/ml。
权利要求
利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳酶的方法，其特征在于它按以下步骤实现一、利用酶水解或酸水解的方法水解乳酸链球菌，得到乳酸链球菌水解液；二、利用步骤一得到的乳酸链球菌水解液配制培养基将NaH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、乳酸链球菌水解液和大豆组织蛋白溶解于水中配制培养基，其中NaH2PO43.25g/L，Na2HPO43.11g/L，葡萄糖2.14g/L，高温淀粉酶20g/L，吐温800.13g/L，玉米粉70g/L，乳酸链球菌水解液60～160g/L，大豆组织蛋白0～20g/L，用质量浓度为5～6％的氢氧化钠调pH至6.7～6.8，装入250mL三角瓶中，在0.14Mpa压力下灭菌30min；三、接种将米黑根毛霉接入种子液培养基中，然后在摇床的转速为260～280rpm，温度为37～38℃条件下培养20～24h，再将接种培养后的种子液按体积比140的量接种到步骤二中的三角瓶中；四、培养将三角瓶于37～38℃条件下放在摇床上培养，摇床的转速为260～280rpm，培养96h，即得到凝乳酶；其中步骤二中乳酸链球菌水解液的总含氮量为0.922％(质量)，大豆组织蛋白的含氮量为8％(质量)；步骤二中培养基的装入量为三角瓶体积的20％；步骤三中种子液培养基按照下列浓度配制NaH2PO43.25g/L，Na2HPO43.11g/L，葡萄糖2.14g/L，高温淀粉酶20g/L，吐温800.13g/L，玉米粉70g/L，大豆组织蛋白18g/L，将它们溶解在水中，250mL三角瓶培养基装量为20％，用质量浓度为5～6％的氢氧化钠调pH至6.7～6.8，在0.14Mpa压力下灭菌30min，最终得到种子液中米黑根毛霉浓度为2～6×106cfu/mL。
2.根据权利要求1所述的利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳酶的方 法，其特征在于步骤一中酶水解的方法是按下述操作进行的用动物蛋白酶水解乳酸链球 菌，动物蛋白酶的添加重量是乳酸链球菌菌体湿重的0. 45%，在pH为6. 75、温度为55°C水 浴条件下水解8h，然后再升温至85°C保持lOmin，得到乳酸链球菌水解液。
3.根据权利要求1所述的利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳酶的方 法，其特征在于步骤一中酸水解的方法是按下述操作进行的采用盐酸将乳酸链球菌的PH 值调至1. 0，然后在121°C的条件下水解12h，得到乳酸链球菌水解液。
4.根据权利要求1、2或3所述的利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳酶 的方法，其特征在于步骤二中加入的乳酸链球菌水解液浓度为70 150g/L。
5 根据权利要求4所述的利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳酶的方 法，其特征在于步骤二中加入的乳酸链球菌水解液浓度为75 140g/L。
6.根据权利要求5所述的利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳酶的方 法，其特征在于步骤二中加入的乳酸链球菌水解液浓度为78g/L。
7.根据权利要求6所述的利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳酶的方 法，其特征在于步骤二中加入的大豆组织蛋白浓度为3. 6 9. Og/L。
8.根据权利要求7所述的利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳酶的方 法，其特征在于步骤二中加入的大豆组织蛋白浓度为5. 4g/L。
全文摘要
利用乳酸链球菌水解液作为部分氮源发酵生产凝乳酶的方法，本发明涉及应用水解液生产凝乳酶的方法。本发明解决了现有微生物发酵生产凝乳酶的成本高，乳酸链球菌发酵废液直接排放造成环境污染的问题。本发明采用动物蛋白酶或盐酸水解乳酸链球菌。凝乳酶的生产方法如下将NaH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖、高温淀粉酶、吐温80、玉米粉、乳酸链球菌水解液和大豆组织蛋白加入到三角瓶中，培养96h，即得凝乳酶。本发明利用乳酸链球菌水解液作为氮源替代大豆组织蛋白生产凝乳酶，不但减少了污染物的排放，还降低了生产凝乳酶的成本，广泛应用于微生物发酵领域。
文档编号C12N9/58GK101914513SQ20101028195
公开日2010年12月15日 申请日期2010年9月15日 优先权日2010年9月15日
发明者张钦革, 王贵元, 郭坤, 马之霄, 马莉, 黄亦存 申请人:安泰生物工程股份有限公司