专利名称：连续发酵生产乳酸链球菌素的方法
技术领域：
本发明涉及乳酸链球菌素的生产方法，具体是一种连续发酵生产乳酸链球菌素的 方法。
背景技术：
乳酸链球菌素(Nisin)是从乳酸链球菌的一个亚种(Lactococcm hciis)发酵 产物中提制的一种多肽抗菌素类物质，是一种天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。早在1928 年，Rogers和Whittier就发现乳酸链球菌的代谢产物能够抑制部分革兰氏阳性菌的生长。 1944年Mattick和Hirch发现血清学N群中的一些乳酸链球菌能产生蛋白类抑菌物质，命 名为N-Inhibitory substance, ( N群抑菌物质，简称为Nisin)。1951年，Hirsh等人应 用Nisin到食品保藏中，成功的抑制了由产气梭状芽孢杆菌引起的奶酪腐败，极大改善了 奶酪的品质。1953年由英国的阿普林和巴雷特公司首次以商品的形式出售了这种新的防腐 剂一乳酸链球菌素。1969年，FA0/WH0食品添加剂联合专家委员会(JECFA)批准Nisin作 为一种生物型防腐剂应用于食品工业。1988年美国食品和药物管理局(FDA)也正式批准 将Nisin应用于食品中。我国在GB2760— 2007中批准Nisin可用于罐藏食品、植物蛋白食 品、乳制品、肉制品中。迄今为止，Nisin已在全世界约60多个国家和地区被用作防腐剂。乳酸链球菌素的产业化研究已经具有几十年的历史，在我国的工业化研究始于上 世纪九十年代末，至2004年之后形成比较成熟的工业化生产技术。乳酸链球菌素的生产菌 种是一种兼性厌氧菌，乳酸链球菌素是乳酸链球菌的一种初级代谢产物，常采用分批发酵 的方式进行工业化生产，发酵周期在20至32小时之间。发酵的前期，12小时之前主要是菌 种的增值期，在此阶段生物量大量增加，但合成乳酸链球菌素的量很少，一般在1000IU/ml 至3000IU/ml之间，12小时之后乳酸链球菌素的合成速度迅速增加，到20小时时达到高峰， 一般到20小时后碳源浓度下降到临界值以下，乳酸链球菌素的生物合成速度下降，应及时 终止发酵。因此，分批发酵的最大劣势就是大量的操作时间处于非最优经济阶段，造成生产 成本上升、设备利用率降低，频繁的灭菌、降温过程对能源的供应提出更多的挑战。
发明内容
正是针对上述缺陷，本发明人经过长期的研究和实验，创造出本发明的技术方案 一种连续发酵生产乳酸链球菌素的方法，该方法充分利用连续发酵的优点降低非最优经济 阶段的占有时间，提高设备利用率，优化工厂能源供应条件，从而达到提高产量，降低产品 生产成本之目的。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种连续发酵生产乳酸链球菌素的 方法，是将乳酸链球菌经一级种子、二级种子培养后转移到无菌发酵培养基中，控制发酵过 程中的温度、PH，当菌浓度达到一定量后乳酸链球菌素的生物合成被启动，然后不断地从发 酵罐中放出发酵液，同时不断的往发酵罐中补充配置好的无菌补料培养基，连续生产工艺 可进行7天至15天。
本发明的连续发酵生产乳酸链球菌素的具体步骤如下
(1)一级种子培养
首先将培养好的乳酸链球菌菌种液接种到灭过菌的种子培养基中，在28至33°C培养， 培养时间为16至32小时；
(2)二级种子培养
一级种子培养结束后转移至无菌的二级种子培养基中，在28至33°C培养，培养时间为 8至16小时；
(3)发酵培养基灭菌
一定配比的发酵培养基经120°C，30min灭菌后，pH为6. 5至7. 5，用循环水冷却至28 至 33 0C ；
(4)发酵
将二级种子转移至发酵罐中，控制发酵温度28至33°C，pH 6. 5至7. 5，同时每隔2至4 小时测定菌浓度、碳源含量；
(5)补料培养基灭菌
一定配比的补料培养基经120°C，30min灭菌后，pH 6. 5至7. 5，用循环水冷却至28至 33 0C ；
(6)放料、补料
发酵罐经16至20小时发酵后，测定菌浓度、碳源含量、乳酸链球菌素含量，当乳酸链球 菌素含量达到控制标准后，从发酵罐中放出发酵液，同时往发酵罐中补充经过灭菌的补料 培养基，并检测菌浓度、糖含量、乳酸链球菌素含量、PH，以便控制放料速度和补料速度。在本发明中，使用的菌种是乳酸链球菌的一个亚种，一级种子罐接种量0. 1%至 2%，菌种浓度为2X IO8至IOltlCFU/毫升。从一级种子到二级种子的接种量为2%至10%，二 级种子到发酵罐的接种量为5%至15%。所述的发酵培养基的碳源种类为葡萄糖和蔗糖的组合物，两种碳源比例为1 :0. 5 至1 :3 ；总碳源浓度为10克/升至30克/升。所述发酵培养基中氮源种类为酵母提取物、 牛肉提取物、鱼粉蛋白水解物、玉米提取蛋白质的水解物的一种或其两种以上的组合物，总 氮源浓度为5克/升至25克/升，所用磷酸盐为磷酸氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾的一种 或其组合物，总用量5克/升至40克/升，经120°C，30min灭菌后，pH为6. 5至7. 5，冷却 至 28 至 33°C。所述的补料培养基中含有镁、钙、钾等无机元素的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐，使用量 分别为0. 01克/升至20克/升，碳源种类为葡萄糖、蔗糖，总碳源浓度为10克/升至30 克/升；补料培养基中氮源种类为酵母提取物、牛肉提取物、鱼粉蛋白水解物、玉米提取蛋 白质的水解物的一种或其两种以上的组合物，总氮源浓度为1%至2%，补料培养基中添加B 组水溶性维生素的复合物，包括B2、B6, B12,使用量0. 05克/升至0. 5克/升；此培养基经 120°C，30min灭菌后，pH 6. 5至7. 5，用循环水冷却至28至33°C。所述的放料时乳酸链球菌素浓度标准为7000IU/ml至12000IU/ml，生物含量达到 0. 5至10克/升，生物含量的测定采用吸光度法间接测定。用5%至15%氢氧化钠或氢氧化 钾水溶液和1%至2%磷酸盐溶液的一种或两种组合物调节发酵pH为6. 5至7. 5，所述放料 和补料方式是连续同时进行或者间歇进行。
本发明的牛产过稈具体描沭如下
所用菌种为乳酸链球菌的一个亚种(Lactococcus lactis subsp. Iactis ATCC 11454)，菌种经冷冻管、斜面、摇瓶三个步骤获得菌种浓度为2X IO8至IOltlCFU/毫升的摇 瓶种液，采用压差接种法接种到事先经灭菌的的一级种子培养基中，总接种量占种液体积 的0. 1%至2%，摇瓶种液菌种浓度和接种量是关键方面，较低的菌种浓度反映菌种的活性较 低，较低的接种量会延长一级种子罐培养时间会降低发酵罐乳酸链球菌的产量。一级种子 罐在特定的培养条件下(培养温度28至33°C，pH=6. 5至7. 5)厌氧培养16至32小时，转移 至无菌的二级种子培养基中，接种量2%至10%，在特定的培养条件下(培养温度28至33°C， pH=6. 5至7. 5)厌氧培养8至16小时，然后转移至无菌的发酵培养基中，接种量5%至15%。 发酵培养基的碳源种类为葡萄糖和蔗糖的组合物，两种碳源比例为1 :0.5至1 :3。总碳源浓 度为10克/升至30克/升。氮源种类为酵母提取物、牛肉提取物、鱼粉蛋白水解物、玉米 提取蛋白质的水解物的一种或其两种以上的组合物，总氮源浓度为5克/升至25克/升， 采用氢氧化钠、氢氧化钾或磷酸盐调PH6. 5至7. 5。发酵培养基灭菌条件为120°C、30分钟。 种子转移至发酵培养基后，控制温度28至33°C，发酵的前8至16小时主要是菌种的生长 阶段，在此阶段的碳源(蔗糖、葡萄糖)依靠微生物复杂的生物代谢机制被氧化为乳酸，造成 PH的降低，需采用氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、磷酸盐等碱性溶液调整pH维持在6. 5至 7. 5，可采用在线pH测定和PID控制方法保持pH在较小的范围内波动。在此阶段每隔四小 时测定碳源含量、微生物量和乳酸链球菌素含量。当发酵进行到8至16小时时碳源含将降 低到5%至10%，此时发酵液中微生物的浓度达到最大值，生长速率趋于平稳，乳酸链球菌素 含量达到最大值。然后采用压力的方法或泵的方法从发酵罐中放出发酵液，放出发酵液的 量可采取连续的不断的放料方法或间歇少量多次的方法，同时向发酵罐中补充同样量的补 料培养基，在此阶段不断地测定发酵液中碳源的含量、微生物浓度和乳酸链球菌素的含量。 如此，发酵时间可进行7天至15天的时间。所用的补料培养基的配方是特定的，碳源种类 为葡萄糖和蔗糖的组合物或其中的一种，总碳源浓度为10升/克至30升/克，氮源种类为 酵母提取物、牛肉提取物、鱼粉蛋白水解物、玉米提取蛋白质的水解物的一种或其两种以上 的组合物，总氮源浓度为10克/升至20克/升。中含有镁、钙、钾等无机元素的盐酸盐、硫 酸盐、磷酸盐，使用量0. 01克/升至20克/升，添加B组水溶性维生素的复合物，包括B2、 B6、B12使用量0.5克/升至5克/升。培养基灭菌条件为120°C、30分钟。发酵过程中发 现菌含量和乳酸链球菌素的产率具有良好的相关性，当由于条件的波动造成乳酸链球菌素 的比生产速率降低时应及时降低放料速度和补料速度，以延长维持时间。当发酵进行到15 天以上时会发现菌种衰退，表现为菌体的形态变化，应及时终止补料，停止发酵。本发明相比现有技术最突出的优点在于可维持发酵周期7天至15天的时间，有 效减少发酵过程中的非最优经济阶段，进而达到提高发酵产量，提高设备利用率，降低产品 生产成本之目的。
图1为本发明的生产工艺流程图。
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图2为各成分含量随发酵时间的代谢曲线图。
具体实施例方式本发明以下结合实施例(附图)做进一步描述 实施例1
一、 一级种子制备
一级种子罐200升，装料量150升，按照如下配比制备种子培养基
葡萄糖10克/升，
蔗糖10克/升，
酵母抽提物7克/升，
磷酸氢二钾12克/升，
玉米浆5克/升，
硫酸镁0. 2克/升
5%氢氧化钠溶液调pH7. 2，
灭菌120°C、30分钟，降温至32°C，压差接种种液2升，无菌空气保持压力0. 2MPa,培 养16小时。二、 二级种子制备
二级种子罐2000升，装料量1500升，按照如下配比制备种子培养基
葡萄糖10克/升， 蔗糖10克/升， 酵母抽提物7克/升， 玉米浆5克/升， 磷酸氢二钾12克/升， 硫酸镁0. 2克/升
5%氢氧化钠溶液调pH7. 2，灭菌120°C、30分钟，降温至32°C，将一级种子无菌移入， 无菌空气保持压力0. 2MPa,培养10小时。三、 发酵培养基制备及发酵
发酵罐30000升，装料量22000升，按照如下配比制备培养基
葡萄糖10克/升
蔗糖20克/升，
酵母抽提物8克/升，
玉米浆5克/升，
磷酸氢二钾18克/升，
10%氢氧化钠溶液调pH7. 2，灭菌120°C、30分钟，降温至32°C，将二级种子无菌移入， 无菌空气保持压力0. 2MPa,开始发酵，每隔4小时取样测定pH、碳源含量、微生物含量(吸光 度法)、乳酸链球菌素含量(HPLC法)。四、 补料培养基制备 按照如下配比制备培养基葡萄糖10克/升，
蔗糖15克/升，
酵母抽提物8克/升，
磷酸氢二钾12克/升，
玉米浆5克/升，
硫酸镁，0.2克/升，
复合维生素B (B6、B12、B2) 1. 5克/升，
10%氢氧化钠溶液调pH7. 2，灭菌120°C、30分钟，降温至32°C备用。五、 放料和补料
发酵进行到20小时开始提高发酵罐压力，同时打开出料阀门控制800升/小时至1200 升/小时速度放料，同时提高补料罐压力，保持发酵罐的进出料平衡，同时启动发酵罐搅拌 电机，保证混合均勻，过程中每隔4小时取样测定pH、碳源含量、微生物含量(吸光度法)、乳 酸链球菌素含量(HPLC法)。共进行168小时，获得发酵液135000升，乳酸链球菌素平均产 量为8020IU/毫升。总产量比分批发酵提高提高产量53%。当然，还可以选择其他补料、放料方式进行，比如每次放料30%左右，然后补料 30%,由于工艺方法基本相同，故不重述。 实施例2
一、一级种子制备
一级种子罐200升，装料量150升，按照如下配比制备种子培养基
蔗糖10克/升，
葡萄糖5克/升
酵母抽提物5克/升，
玉米浆5克/升，
硫酸镁0. 2克/升
磷酸氢二钾15克/升
5%氢氧化钾溶液调pH7. 0，
灭菌120°C、30分钟，降温至32°C，压差接种种液2升，无菌空气保持压力0. 2MPa,培 养24小时。二、 二级种子制备
二级种子罐2000升，装料量1500升，按照如下配比制备种子培养基
蔗糖10克/升， 葡萄糖5克/升 酵母提取物5.0克/升， 玉米浆5.0克/升， 磷酸氢二钾15克/升 硫酸镁0. 2克/升
5%氢氧化钾溶液调pH7. 0,灭菌120°C、30分钟，降温至32°C，将一级种子无菌移入， 无菌空气保持压力0. 2MPa,培养12小时。
三、 发酵培养基制备及发酵
发酵罐30000升，装料量22000升，按照如下配比制备培养基
蔗糖25克/升，
牛肉提取物5克/升，
鱼粉蛋白水解物1克/升
玉米浆4.0克/升，
磷酸二氢钾20克/升，
2%磷酸盐溶液调pH7. 0,灭菌120°C、30分钟，降温至32°C，将二级种子无菌移入，无 菌空气保持压力0. 2MPa,开始发酵，每隔4小时取样测定pH、碳源含量、微生物含量(吸光度 法)、乳酸链球菌素含量(HPLC法)。四、 补料培养基制备 按照如下配比制备培养基 蔗糖20. 0克/升，
牛肉提取物3.0克/升
鱼粉蛋白水解物1克/升，
玉米浆3.0克/升，
磷酸镁，0.2克/升，
磷酸二氢钾15克/升，
复合维生素B (B1、B6、B12、B2) 1.0克/升，
2%磷酸盐溶液调pH7. 0，灭菌120°C、30分钟，降温至32°C备用。五、 放料和补料过程同实施例1.。共进行240小时，获得发酵液198000升，乳酸链球菌素平均产量为7500IU/毫升。 总产量比分批发酵提高提高产量54. 6%。
权利要求
一种连续发酵生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于乳酸链球菌经一级种子、二级种子培养后转移到无菌发酵培养基中，控制发酵过程中的温度、pH，当菌浓度达到一定量后乳酸链球菌素的生物合成被启动，然后不断地从发酵罐中放出发酵液，同时不断的往发酵罐中补充配置好的无菌补料培养基，连续生产工艺可进行7天至15天的时间。
2.根据权利要求1所述的连续发酵生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于连续发酵 生产乳酸链球菌素的具体步骤如下(1)一级种子培养首先将培养好的乳酸链球菌菌种液接种到灭过菌的种子培养基中，在28至33°C培养， 培养时间为16至32小时；(2)二级种子培养一级种子培养结束后转移至无菌的二级种子培养基中，在28至33°C培养，培养时间为 8至16小时；(3)发酵培养基灭菌一定配比的发酵培养基经120°C，30min灭菌后，pH为6. 5至7. 5，冷却至28至33°C ；(4)发酵将二级种子转移至发酵罐中，控制发酵温度28至33°C，pH 6. 5至7. 5，同时每隔2至4 小时测定菌浓度、碳源、PH含量；(5)补料培养基灭菌一定配比的补料培养基经120°C，30min灭菌后，pH 6. 5至7. 5，冷却至28至33°C ；(6)放料、补料发酵罐经16至20小时发酵后，测定菌浓度、碳源含量、乳酸链球菌素含量，当乳酸链球 菌素含量达到控制标准后，从发酵罐中放出发酵液，同时往发酵罐中补充经过灭菌的补料 培养基，并检测菌浓度、碳源含量、乳酸链球菌素含量、PH，以便控制放料速度和补料速度。
3.根据权利要求1所述的连续发酵生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于使用的菌 种是乳酸链球菌的一个亚种，一级种子罐接种量0. 1%至2%，菌种浓度为2 X IO8至IOltlCFU/ 毫升。
4.根据权利要求1所述的连续发酵生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于从一级种 子到二级种子的接种量为2%至10%，二级种子到发酵罐的接种量为5%至15%。
5.根据权利要求1所述的连续发酵生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于所述的发 酵培养基的碳源种类为葡萄糖和蔗糖的组合物，两种碳源比例为1 :0. 5至1 :3 ；总碳源浓 度为10克/升至30克/升；所述发酵培养基中氮源种类为酵母提取物、牛肉提取物、鱼粉 蛋白水解物、玉米提取蛋白质的水解物的一种或其两种以上的组合物，总氮源浓度为5克/ 升至25克/升，所用磷酸盐为磷酸氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾的一种或其组合物，总用 量5克/升至40克/升，经120°C，30min灭菌后，pH为6. 5至7. 5，冷却至28至33°C。
6.根据权利要求1所述的连续发酵生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于所述的补 料培养基中含有镁、钙、钾等无机元素的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐，使用量分别为0.01克/升 至20克/升，碳源种类为葡萄糖和蔗糖的组合物或其中的一种，总碳源浓度为10克/升至 30克/升；补料培养基中氮源种类为酵母提取物、牛肉提取物、鱼粉蛋白水解物、玉米提取 蛋白质的水解物的一种或其两种以上的组合物，总氮源浓度为10克/升至20克/升，补料培养基中添加B组水溶性维生素的复合物，包括B2、B6, B12,使用量0. 5克/升至5克/升； 此培养基经120°C，30min灭菌后，pH 6. 5至7. 5，冷却至28至33"C。
7.根据权利要求1所述的连续发酵生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于所述的放 料时乳酸链球菌素浓度标准为7000IU/ml— 12000IU/ml，生物含量达到5克/升至10克/ 升，用5%至15%氢氧化钠水溶液和1%至2%磷酸盐溶液的一种或两种组合物调节发酵pH 为6. 5至7. 5，所述放料和补料方式是连续同时进行或者间歇进行。
8.根据权利要求1、5、6所述的连续发酵生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于所述 的冷却方式为用循环水冷却。
9.根据权利要求7所述的连续发酵生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于生物含量 的测定采用吸光度法间接测定。
全文摘要
一种连续发酵生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于乳酸链球菌经一级种子、二级种子培养后转移到无菌发酵培养基中，控制发酵过程中的温度、pH，当菌浓度达到一定量后乳酸链球菌素的生物合成被启动，然后不断地从发酵罐中放出发酵液，同时不断的往发酵罐中补充配置好的无菌补料培养基，连续生产工艺可进行7天至15天时间。本发明采用乳酸链球菌的一个亚种(Lactococcuslactis)经两级种子培养，以特定的发酵培养基配方，通过控制向生物反应器中的补料速度、pH、菌浓度并连续或间歇的放出含有乳酸链球菌素的的发酵液生产乳酸链球菌素。该方法可有效减少发酵过程中的非最优经济阶段，达到了提高发酵产量，提高设备利用率，降低产品生产成本的目的。
文档编号C12P21/02GK101948893SQ201010292078
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月27日 优先权日2010年9月27日
发明者周树青, 孙远功, 林永刚, 高巧玲, 鲁来政 申请人:郑州奇泓生物科技有限公司