专利名称：乳酸片球菌菌株及其生产片球菌素的方法
技术领域：
本发明涉及片球菌属的乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)新菌株及通过培 养该菌株制备片球菌素的方法。
背景技术：
为了减少微生物引起的食品腐败和食源性疾病，人类采用诸如干燥、加热、盐腌、 发酵和化学防腐等方法进行食品防腐，由于担心长期摄入化学防腐剂的副作用，消费者更 加青睐不添加防腐剂的食品或仅添加天然防腐剂的食品，但不添加防腐剂的食品容易出现 微生物污染的状况，如冷藏食品中会有嗜冷性病原菌单核细胞增多症李氏杆菌，梭状芽胞 杆菌和腐败微生物假单胞菌、明串珠菌，它们引起食品安全问题或食品货架期的问题。由于使用化学防腐剂可能出现问题，寻找某些细菌产生的天然代谢产物抑制或杀 死有害微生物的研究成为研究的热点。这些天然的抑菌物质可以替代那些化学防腐剂如二 氧化硫、苯甲酸、山梨酸和亚硝酸盐。其中用食品级微生物乳酸菌产生的细菌素作为生物食 品防腐剂以保证食品安全性和货架期的研究受到极大的关注。细菌素相当稳定，可生物降 解、可被消化、在低浓度就可发挥作用。数种细菌素对许多食品腐败和致病菌有杀菌活性， 如蜡样芽胞杆菌，肉毒梭状芽胞杆菌，产气荚膜梭状芽胞杆菌，单核细胞增多症李氏杆菌， 金黄色葡萄球菌等。乳酸菌特别是乳球菌、乳杆菌、片球菌、明串珠菌、和链球菌传统上用作发酵食品 和蔬菜的出发菌，因为它们可以产生良好的风味和防腐作用。其抑菌活性的重要原因之一 就是乳酸菌产生的细菌素。已从乳球菌、乳杆菌和片球菌发现产生细菌素的菌株。从明串 珠菌、肉杆菌、链球菌、肠球菌和双岐杆菌也发现产生细菌素的菌株。由乳酸菌产生的细菌 素本质为具有生物活性的蛋白质或蛋白复合物，对种属相近的细菌有抑菌活性。乳酸菌产 生的细菌素有多种，其分子量、理化特性、抑菌谱、和作用方式都不尽相同。已报道有数株片球菌产生细菌素。最初，发现从发酵黄瓜分离的戊糖片球菌 FBB-61, FBB-63，和 L-7230 对植物乳杆菌有抑制作用(Etchells et al, Appl Microbiol, 1964)。进一步研究表明，戊糖片球菌菌株FBB-61和L-7230抑制革兰氏染色阳性菌片球菌、 乳杆菌、明串珠菌、肠球菌、微球菌、金黄色葡萄球菌和芽胞杆菌中的一些菌株(Fleming et al, Appl Microbiol，1975)。这些菌株的抑菌物质后来被证明是细菌素，命名为片球菌素 A(Daeschel et al,ApplEnviron Microbiol，1985)。后来发现戊糖片球菌FBB-61 也对单核 细胞增多症李氏杆菌有抑菌活性，然而，也发现该菌株并非对所有革兰氏染色阳性细菌有 抑制作用，对一些革兰氏染色阴性细菌和酵母完全无效(Hoover et al,Food Biotechnol, 1989)。另一个课题组从发酵香肠分离出一株产细菌素的乳酸片球菌(菌株H)，抑制其他 乳酸菌菌株的生长，产生的细菌素命名为片球菌素AcH(Mumia et al, J Ind Microbiol, 1987)。乳酸片球菌PAC1.0产生细菌素，命名为片球菌素PA-I (Gonzalez et al, Appl Environ Microbiol，1987)，对乳酸片球菌、戊糖片球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、双发酵 乳杆菌、肠膜明珠菌有抑菌活性，对单核细胞增多症李氏杆菌有抑菌活性。
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美国专利4，883，673 (Gonzalez, 1989)提供了一种用乳酸片球菌产生的细菌素抑 制色拉和色拉调味料中微生物腐败的方法。美国专利4，^9，445(Vandenbergh et al., 1990)提供了一种用乳酸片球菌产生的细菌素抑制单核细胞增多症李氏杆菌的方法。美国 专利5，219，603(BOudreauX et al. , 1993)提供了一种使用乳酸片球菌产生的片球菌素延 长生肉和加工肉制品货架期的方法。美国专利5，445，835 (Vedamuthu et al. , 1995)提供 了一种用产片球菌素的乳酸片球菌延长酸奶货架期的方法。上述美国专利都是将产生乳酸 片球菌素的乳酸片球菌用于某种食品以延长其货架期或抑制其中的微生物。国内专利公开 号为CN 101050437A (孙爱友等，2007)公开了一种乳酸片球菌菌株和乳酸片球菌素的生产 方法，该专利提供的菌株产生片球菌素效价为18，000AU/mL。许多研究表明培养基和培养条件对细菌素的产生有重要影响，细菌的培养条件 不但严重影响到它的生长情况，而且还与细菌素的产量密切相关，这些因素主要包括培养
基的PH值、培养温度、培养时间、供氧量、生物量等等(Bogovi6-Matija^6 et al, Process
Biochemist, 1998)。一般来讲，在菌体进入稳定期以前细菌素的含量随着时间的延长而增 加，稳定期后随着培养时间的不断延长细菌素的活性反而不断损失。但未见针对乳酸片球 菌产生片球菌素的培养条件的全面优化的报道。细菌素作为一种小分子蛋白质，具有蛋白质的一些基本特性，所以分离纯化蛋白 质的提取方法同样适用于细菌素的提取。片球菌素在PH值6时吸附于产生菌的表面，而 pH值2时则解吸附，因此，常用这种调整pH值的方法使片球菌素得到浓缩和纯化(Yang et al，Appl EnvironMicrobiol，1992)。这种方法成本低，易于操作，纯化时不加任何有害化学 物质，安全性高，可满足用于食品防腐剂的片球菌素的生产。如进行片球菌素性质研究，则 需进行高度的纯化。获得高纯度片球菌素的方法有硫酸盐沉淀、凝胶层析、离子交换层析、 高效液相色谱等。但目前的各种提取和纯化方法中只涉及从发酵液中提取分泌到细胞外的 细菌素，而仍然残留于细胞内的片球菌素的提取方法未见报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明通过对野生型乳酸片球菌 (Pediococcusacidilatici)菌株 PA003 用硫酸二乙酯(diethyl sulfate, DES)和氯化锂 (LiCl)复合诱变剂进行诱变，得到的一株片球菌素高产突变菌株P2，该菌株能够产生大量 片球菌素。本发明另一个目的是提供一种通过培养该乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)P2而生产片球菌素的方法并从培养基和细胞中回收片球菌素的方法，以克服 现有技术中野生型乳酸片球菌片球菌素产量低和提取方法得率低的问题。乳酸片球菌PA003菌株从国内发酵酸菜中分离，产生的抑菌物质为蛋白质性质的 片球菌素(周志江等，食品科学，2006)。本发明用基因工程手段克隆该片球菌素基因，根 据基因测序结果推断其含44个氨基酸，与乳酸片球菌PAC1. O片球菌素PA-I的结构基因 pedA(Accession number M83924)同源性为100%。pedA基因编码62个氨基酸的前体蛋 白，经翻译后修饰，去除18个氨基酸的前导肽，成熟的具有抑菌活性的片球菌素为含44个 氨基酸的多肽。根据GenBank发布的乳酸片球菌PAC1. O片球菌素PA-I的结构基因pedA (Accessionnumber M83924)的DNA序列设计一对引物，上游引物序列为5，-ATG AAA AAA ATT GAAAAA TTA ACT-3，(SEQ ID NO. 2)，下游引物为 5，-CTA GCA TTT ATG ATT ACC TTG-3，(SEQ ID NO. 3)。用碱裂解法提取乳酸片球菌PA003的全细胞DNA作为模板，用PCR 反应扩增PedA基因。PCR反应的条件为94°C预变性3min，然后94°C变性30s，44°C复性 20s，72°C延伸15s，经30个循环后再72°C延伸lOmin。PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳 后进行观察。将PCR产物克隆至pTA2 Vector载体，重组质粒转化大肠杆菌DH5 α，筛选含 有重组质粒的转化子，提取其重组质粒，测定重组质粒中乳酸片球菌ΡΑ003的pedA基因的 核苷酸序列(SEQ ID NO. 1)，测序结果为1 ATGAAAAAAATTGAAAAATTAACTGAAAAAGAAATGGCCAATATCATTGGTGGTAAATAC61 TACGGTAATGGGGTTACTTGTGGCAAACATTCCTGCTCTGTTGACTGGGGTAAGGCTACC121 ACTTGCATAATCAATAATGGAGCTATGGCATGGGCTACTGGTGGACATCAAGGTAATCAT181 AAATGCTAG序列中前讨个核苷酸序列编码18个氨基酸的前导肽，之后的132个核苷酸序列 编码44个氨基酸的成熟片球菌素，最后的三个核苷酸为终止密码。突变菌株P2通过化学诱变的方法得到。用正交试验确定DES诱变条件为片球菌 菌液浓度为106_108Cfu/mL，DES浓度为0. 6% -1. 0%，诱变时间为20min-30min，诱变温度为 370C -41°C，其中最佳诱变条件为片球菌菌液浓度为107cfu/mL，DES浓度为0. 8%，诱变时 间为30min，诱变温度为37°C，试验中共获得20个片球菌素产量提高的突变菌株。挑选产 量提高幅度最大的五株继续进行LiCl诱变育种试验，从中进一步筛选出5株产量提高的突 变菌株，其中突变菌株P2的片球菌素效价最高。本发明乳酸片球菌P2主要有以下特性为革兰氏染色球菌，通常以双球菌或四叠球菌形式出现，无运动性，不形成芽胞， 兼性厌氧。最适生长PH值为6.2，最适生长温度为25-401。生长依赖可发酵的碳水化合 物，以EMP途径发酵葡萄糖产生乳酸，不产气，为同型乳酸发酵菌。主要生理生化特性见表 1。表1乳酸片球菌P2的主要生理和生化特性
权利要求
1.乳酸片球菌(Pediococcusacidilatici)P2CGMCC No. 4213。
2.一种采用权利要求1所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)P2CGMCC No. 4213生产乳酸片球菌素的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)将保存的乳酸片球菌菌株P2CGMCCNo. 4213接种于MRS平板，37°C培养M_3Mi，挑 取典型的单个菌落，接种于MRS液体培养基，培养活化；(b)活化后接种至本发明提供的改良MRS培养基进行发酵培养，发酵培养方法如下 将活化的乳酸片球菌菌种P2CGMCC No. 4213接种至改良MRS发酵培养基中，发酵温度为 35-37°C，pH值5. 5-7. 55，培养时间15_22h，接种量0. 3-0. 6%，发酵液溶解氧保持20-25%， 发酵培养过程中流加葡萄糖；所述改良MRS培养基每升组成为酪蛋白胨7-10g，牛肉膏10-15g，酵母提取物5-9g，葡萄糖3-5g，乙酸钠3_5g，柠檬酸 胺l_5g，吐温801-2mL，磷酸氢二钾l_2g，硫酸镁0. 2_2g，硫酸锰0. 1-0. 5g，碳酸钙10_20g， ρΗ6· 2-6. 8 ；(c)培养15-22小时后从发酵产物中提取片球菌素。
3.根据权利要求2所述生产乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述步骤(b)发酵过程 中流加葡萄糖为发酵培养7小时后按0. 025g/L浓度流加葡萄糖，每5升发酵液体积按aiil/ min的流加速度进行间歇流加。
4.根据权利要求2所述生产乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述步骤(c)从发酵产 物中提取片球菌素包括细胞外细菌素和细胞内细菌素，所述细胞内细菌素的提取方法为首先将菌液PH值调到2. 0，4°C电磁搅拌12h，离心弃上清得菌体，加无菌水清洗沉淀菌 体，再离心弃上清得菌体；然后将菌体重悬于细胞壁裂解液I中，在37°C条件下保持15min，加入细胞壁裂解液 II，迅速混勻，常温保持7min，离心取上清液，在70°C条件下保持30min，灭酶；所述细胞壁裂解液I为25%蔗糖，30mg/ml溶菌酶；所述细胞壁裂解液II为3% SDS, 0. 2M NaOH。
全文摘要
本发明公开了一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)P2CGMCC No.4213以及采用所述乳酸片球菌P2生产乳酸片球菌素的方法，将乳酸片球菌菌株P2培养活化后接种至本发明提供的改良MRS培养基进行发酵培养，发酵培养方法如下将活化的乳酸片球菌菌种P2接种至改良MRS发酵培养基中，发酵温度为35-37℃，pH值5.5-7.5，培养时间15-22h，接种量0.3-0.6％，发酵液溶解氧保持20-25％，发酵培养过程中流加葡萄糖；培养1522小时后从发酵产物中提取片球菌素。用本发明提供的改良MRS培养基和经优化的培养发酵条件下进行发酵，片球菌素产量达到22,000AU/ml以上，结合使用本发明提供的从细胞内提取未分泌的片球菌素的方法，总片球菌素产量达27,500AU/ml以上，适用于大规模工业化生产。
文档编号C12P1/04GK102115720SQ201010566509
公开日2011年7月6日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者周志江, 李静, 韩烨 申请人:天津大学