专利名称：一种牡丹原生质体的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种牡丹原生质体的提取方法。
背景技术：
牡丹为芍药科芍药属多年生落叶亚灌木，是我国传统名花，富丽堂皇，国色天香， 自古就有富贵吉祥、繁荣昌盛的寓意，不仅是中国人民喜爱的花卉，而且也受到世界各国人 民的珍爱。而且牡丹不仅有观赏价值，还具有很高的药用价值。牡丹品种作为产业发展的基础，需要不断的推陈出新，培育出具有不同花色、花 型、花香、花期的新品种，在提高牡丹观赏性的基础上，延长花期、耐湿热、抗干燥寒冷等特 性，适合牡丹的园艺化栽培，适应现代化社会发展的需求。但是在牡丹新品种的培育过程 中，传统的育种方法繁殖率低，周期长，品种选育定向性差，育种有效性低。目前，从植物中 提取原生质体，以此为材料进行转基因和突变育种，是培育植物新品种的新方法，提取得到 的原生质体由于去掉了细胞壁，每个细胞都有可能发育成一个植株，大大提高了其繁殖系 数。但目前传统的原生质体提取方法应用在牡丹各类外植体上，提取困难或提取的原生质 体活力较差，一般不超过60%，给牡丹转基因和突变育种工作造成了阻碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种牡丹原生质体的提取方法，以提高牡丹原生质体的活 力。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是一种牡丹原生质体的提取方法， 其步骤如下
1)取胚已进入成熟期的牡丹种子，酒精浸泡、灭菌，接种在PH为4.8-6. 5的MS培养基 中，诱导牡丹成熟胚萌发；
2)取步骤1)萌发5-10天的子叶和/或下胚轴，切碎，接入pH为4.8-6. 5的MS培养基 中，变温培养连续继代两次以上，获得愈伤组织，所述变温培养即每天在0-10°C条件下暗培 养8-10小时，在15-30°C条件下光照培养14-16小时；
3)取步骤2)得到的愈伤组织，置于pH为4.8-6. 5的酶液中1848°C震荡12-16小时 游离原生质体，
4)将游离原生质体后的酶液用100-800目滤网过滤，滤液离心弃上清液，加入&(12洗 液混勻，然后从溶液底部注入蔗糖溶液，离心取得处于中间部分的牡丹原生质体。步骤1)所述MS培养基中含有6-苄基腺嘌呤(6-ΒΑ)0. Γ . 0 mg/L，萘乙酸(NAA) 0. 05 1. Omg/L,蔗糖 2-5% 和琼脂 0. 7-0. 8% ；
步骤2)所述MS培养基中含有6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0. Γ . 5 mg/L, 2,4- 二氯苯氧乙 酸(2，4-D) 0. 5 3 mg/L，蔗糖 2-5% 和琼脂 0. 6-0. 8% ；
步骤3)所述酶液为含有以下组分及含量的水溶液纤维素酶1% 3%，半纤维素酶 0. 5% 1%，果胶酶0. 5% 2%，甘露醇0. 3-0. 7 mol/L，2_(N_ 吗啡啉)乙磺酸(MES)O. 05-0. 3%，CaCl2O. 01-0. 2 mol/L ；
步骤4)所述蔗糖浓度为12-28%。本发明牡丹原生质体的提取方法，对牡丹愈伤组织的培养采用变温培养，培养的 时常变温使组织细胞在冷热交替的刺激下，变得疏松易分散，有利于原生质体在游离过程 中保持较高的活力，得到高活力的牡丹原生质体，最终提取得到的牡丹原生质体经染色法 鉴别其活力在85%以上，适合采用突变、转基因和细胞融合等遗传操作诱导新品种；另外配 合优选的酶液，在愈伤组织细胞质壁分离过程中，避免其活力损失。
具体实施例方式实施例1
本实施例的牡丹原生质体提取方法如下步骤
1)取胚已进入成熟期的牡丹种子，用70%的酒精浸泡30s，0.1%的氯化汞灭菌9分钟， 接种在PH为4. 8的MS培养基中，诱导牡丹成熟胚萌发，其中MS培养基中含有6-苄基腺嘌 呤(6-BA) 0. lmg/L，萘乙酸(NAA) 0. 05mg/L，蔗糖2%和琼脂0. 7% ；也可以采用常规的MS培
养液；
2)取步骤1)萌发5天幼嫩的子叶，切成0.5cm片段，接入pH为4. 8的MS培养基中， 连续继代两次，获得有利于原生质体游离的松软易分散的愈伤组织，其中MS培养基中含有 6-苄基腺嘌呤(6-BA)0. 1 mg/L, 2,4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)0. 5mg/L,蔗糖2%和琼脂0. 6% ； 也可以采用常规的MS培养液；其中愈伤组织的培养采用变温培养，即在1°C条件下暗培养8 小时，在15°C条件下光照培养16小时；
3)取步骤2)得到的愈伤组织，置于pH为4.8的酶液中采用恒温摇床28°C震荡12小时 游离原生质体，其中酶液为含有以下组分及含量的水溶液纤维素酶1%，半纤维素酶0. 5%， 果胶酶 0. 5%，甘露醇 0. 3 mol/L, 2- (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)O. 05%, CaCl2 0. 01 mol/L ；也 可以采用常规的酶液；
4)将游离原生质体后的酶液用100目滤网过滤去除未消化的组织，滤液SOOrpm离心 弃上清液，加入0. 16 mol/L CaCl2洗液，轻轻混勻后，从溶液底部注入12%的蔗糖溶液，500 rpm离心，牡丹原生质体处于上部CaCl2洗液与下部蔗糖溶液之间，弃去上下溶液得到牡丹 原生质体。将取得的原生质体用0. 1%酚藏花红溶液(在0. 4 mol/L甘露醇中)染色法鉴别原 生质体活力，获得牡丹原生质体活力达89%。实施例2
本实施例的牡丹原生质体提取方法如下步骤
1)取胚已进入成熟期的牡丹种子，用70%的酒精浸泡30s，0.1%的氯化汞灭菌9分钟， 接种在PH为5. 8的MS培养基中，诱导牡丹成熟胚萌发，其中MS培养基中含有6-苄基腺嘌 呤(6-BA)0. 5mg/L，萘乙酸(NAA)O. 2mg/L，蔗糖3%和琼脂0. 8%，也可以采用常规的MS培养 液；；
2)取步骤1)萌发8天幼嫩的子叶和下胚轴，切成0.5cm片段，接入pH为5. 8的MS培 养基中，连续继代三次，获得有利于原生质体游离的松软易分散的愈伤组织，其中MS培养 基中含有6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1.0 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 1.8 mg/L，蔗糖3%和琼脂0. 7%，也可以采用常规的MS培养液；其中愈伤组织的培养采用变温培养，即在5°C条 件下暗培养9小时，在23°C条件下光照培养14小时；
3)取步骤2)得到的愈伤组织，置于pH为5.8的酶液中采用恒温摇床22°C震荡14小时 游离原生质体，其中酶液为含有以下组分及含量的水溶液纤维素酶2%，半纤维素酶0. 7%， 果胶酶 1. 2%，甘露醇 0. 5 mol/L，2- (N-吗啡啉)乙磺酸(MES) 0. 2%, CaCl2 0. 1 mol/L ；也 可以采用常规的酶液；
4)将游离原生质体后的酶液用400目滤网过滤去除未消化的组织，滤液SOOrpm离心 弃上清液，加入0. 16 mol/L CaCl2洗液，轻轻混勻后，从溶液底部注入22%的蔗糖溶液，500 rpm离心，牡丹原生质体处于上部CaCl2洗液与下部蔗糖溶液之间，弃去上下溶液得到牡丹 原生质体。将取得的原生质体用0. 1%酚藏花红溶液(在0. 4 mol/L甘露醇中)染色法鉴别原 生质体活力，获得牡丹原生质体活力达87%。实施例3
本实施例的牡丹原生质体提取方法如下步骤
1)取胚已进入成熟期的牡丹种子，用70%的酒精浸泡30s，0.1%的氯化汞灭菌9分钟， 接种在PH为6. 5的MS培养基中，诱导牡丹成熟胚萌发，其中MS培养基中含有6-苄基腺嘌 呤(6-BA) 1. Omg/L，萘乙酸(NAA) 1. Omg/L，蔗糖5%和琼脂0. 75% ；也可以采用常规的MS培
养液；
2)取步骤1)萌发10天的下胚轴，切成0.5cm片段，接入pH为6. 5的MS培养基中， 连续继代两次，获得有利于原生质体游离的松软易分散的愈伤组织，其中MS培养基中含有 6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1. 5 mg/L, 2,4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) 3mg/L,蔗糖5%和琼脂0. 8% ； 也可以采用常规的MS培养液；其中愈伤组织的培养采用变温培养，即在10°C条件下暗培养 10小时，在30°C条件下光照培养15小时；
3)取步骤2)得到的愈伤组织，置于pH为6.5的酶液中采用恒温摇床18°C震荡16小时 游离原生质体，其中酶液为含有以下组分及含量的水溶液纤维素酶3%，半纤维素酶1. 0%， 果胶酶2%，甘露醇0. 7mol/L，2- (N-吗啡啉)乙磺酸(MES) 0. 3%, CaCl2 0. 2 mol/L ；也可以 采用常规的酶液；
4)将游离原生质体后的酶液用800目滤网过滤去除未消化的组织，滤液SOOrpm离心 弃上清液，加入0. 16 mol/L CaCl2洗液，轻轻混勻后，从溶液底部注入28%的蔗糖溶液，500 rpm离心，牡丹原生质体处于上部CaCl2洗液与下部蔗糖溶液之间，弃去上下溶液得到牡丹 原生质体。将取得的原生质体用0. 1%酚藏花红溶液(在0. 4 mol/L甘露醇中)染色法鉴别原 生质体活力，获得牡丹原生质体活力达90%。
权利要求
1.一种牡丹原生质体的提取方法，其特征在于其步骤如下1)取胚已进入成熟期的牡丹种子，酒精浸泡、灭菌，接种在PH为4.8-6. 5的MS培养基 中，诱导牡丹成熟胚萌发；2)取步骤1)萌发5-10天的子叶和/或下胚轴，切碎，接入pH为4.8-6. 5的MS培养基 中，变温培养连续继代两次以上，获得愈伤组织，所述变温培养即每天在0-10°C条件下暗培 养8-10小时，在15-30°C条件下光照培养14-16小时；3)取步骤2)得到的愈伤组织，置于pH为4.8-6. 5的酶液中1848°C震荡12-16小时 游离原生质体，4)将游离原生质体后的酶液用100-800目滤网过滤，滤液离心弃上清液，加入&(12洗 液混勻，然后从溶液底部注入蔗糖溶液，离心取得处于中间部分的牡丹原生质体。
2.根据权利要求1所述的牡丹原生质体的提取方法，其特征在于步骤1)所述MS培 养基中含有6-苄基腺嘌呤(6-ΒΑ)0. Γ . 0 mg/L，萘乙酸(ΝΑΑ)Ο. 05 1. Omg/L，蔗糖2-5%和 琼脂 0. 7-0. 8%ο
3.根据权利要求1所述的牡丹原生质体的提取方法，其特征在于步骤2)所述MS培 养基中含有6-苄基腺嘌呤(6-ΒΑ)0. Γ . 5 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0. 5 3 mg/L, 蔗糖2-5%和琼脂0. 6-0. 8%。
4.根据权利要求1所述的牡丹原生质体的提取方法，其特征在于步骤3)所述酶液 为含有以下组分及含量的水溶液纤维素酶1% 3%，半纤维素酶0.59Tl%，果胶酶0.5% 2%，甘露醇 0. 3-0. 7 mol/L，2- (N-吗啡啉)乙磺酸(MES) 0. 05-0. 3%, CaCl2O. 01-0. 2 mol/ L0
5.根据权利要求1所述的牡丹原生质体的提取方法，其特征在于步骤4)所述蔗糖浓 度为12-沘％。
全文摘要
本发明公开了一种牡丹原生质体的提取方法，首先诱导牡丹种子萌发，取5-10天的子叶和/或下胚轴，培养愈伤组织，培养过程中采用变温培养，即每天在0-10℃条件下暗培养8-10小时，在15-30℃条件下光照培养14-16小时；然后用酶液从愈伤组织中游离原生质体，再分离、提纯得到牡丹原生质体。本发明牡丹原生质体的提取方法，对牡丹种子的萌发及愈伤组织的培养采用变温培养，时常变温使组织细胞在冷热交替的刺激下，变得疏松易分散，有利于原生质体在游离过程中保持较高的活力，得到高活力的牡丹原生质体，最终提取得到的牡丹原生质体经染色法鉴别其活力在85%以上，适合采用突变、转基因和细胞融合等遗传操作诱导新品种。
文档编号C12N5/04GK102120981SQ201010566240
公开日2011年7月13日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者史国安, 孔祥生, 张改娜, 江志华 申请人:河南科技大学