一种利用廉价原料生产乳酸链球菌素的方法
【专利摘要】一种利用廉价原料生产乳酸链球菌素的方法，属于微生物发酵【技术领域】。本发明使用诱变选育的乳酸链球菌E-15，利用糖蜜做碳源、豆饼或豆粕做氮源在厌氧条件下发酵，维持pH5.0-7.0，进行分批或补料分批发酵15-30h，最终发酵液效价达到5000IU/mL。本发明突出的优点是利用廉价的糖蜜和豆饼粕为原料生产乳酸链球菌素，减少了蔗糖、酵母粉及蛋白胨等物料的用量，可以降低生产成本。
【专利说明】一种利用廉价原料生产乳酸链球菌素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以糖蜜、豆饼或豆柏为原料生产乳酸链球菌素的方法，属于微生物发酵【技术领域】。
【背景技术】
[0002]Nisin (group N inhibitory substance),亦称为乳酸链球菌素(肽),乳链菌肽，是由乳酸链球菌(StrepiococciAs Iactis)或乳酸乳球菌(Zaciococcus Iactis)部分菌株发酵产生的一类小分子多肽类化合物。它能有效地抑制引起食品腐败的革兰氏阳性细菌及其孢子的生长，延长食品货架期。同时，Nisin容易被人体消化道中的一些蛋白酶所降解，不会在人体内蓄积，是世界公认安全的天然防腐剂。
[0003]Nisin的生产是与菌株的生长密切相关的，有研究表明，Nisin的合成发生在菌株进入对数生长期，当菌株进入稳定期，Nisin的合成也停止了，表现为初级代谢动力学特征。
[0004]乳酸菌对发酵培养基的营养比较挑剔，Nisin生产常用的碳源主要有蔗糖和葡萄糖。在实际生产中，蔗糖被认为是最好的碳源。氮源是影响Nisin的发酵水平的重要因素，通常认为大豆蛋白胨、酵母粉、鱼粉、棉子粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨为生产Nisin的理想氮源。但上述原料价格昂贵，势必增加生产成本，选择廉价的碳、氮源很有必要。
[0005]糖蜜是制糖工业的副产物，又被称为废糖蜜，包括甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，它大约含有40-50%的总糖(主要成分为蔗糖、葡萄糖和果糖)，在发酵工业中作为较廉价的碳源原料。它与葡萄糖或蔗糖相 比，价格低廉，已经被应用于酵母、酒精、乳酸、柠檬酸、谷氨酸等产品的工业生产。到目前为止，工业上还没有利用糖蜜原料发酵生产乳酸链球菌素的报道。本申请发明人通过实验发现糖厂的废糖蜜可以用作生产乳酸链球菌素的碳源，可以大量减少糖的用量，使生产成本降低。
[0006]大豆饼柏是大豆提取油之后的剩余物。从油料中提取的常用方法有两种，即压榨法和有机溶剂浸提法。采取有机溶剂提取豆油之后剩余物为大豆柏；采用压榨法提取油之后的大豆剩余物，因大多数压制成饼状，所以被称做豆饼。其中蛋白含量在40%以上，可以作为微生物生长的氮源，减少酵母粉和蛋白胨的用量。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种利用廉价原料(糖蜜为碳源，豆饼或豆柏为氮源)发酵生产乳酸链球菌素的方法。
[0008]技术方案:利用糖蜜、豆饼或豆柏为原料发酵生产乳酸链球菌素的方法，是利用乳酸链球菌E-15在含有20-100g/L还原糖的糖蜜及5-30g/L的豆饼或豆柏，再添加无机盐等其它营养物质的培养基中发酵生产乳酸链球菌素。
[0009]以下是本发明方法的详细描述。
[0010]菌株:乳酸链球菌E-15。
[0011]种子培养基的组成为(每L):蔗糖5-20g，酵母粉5-10g，蛋白胨5-10g，K2HPO41-lOg, MgSO4 0.l-0.5，NaCl l_5g。
[0012]发酵培养基组成(每L):糖蜜(含总还原糖计)20_100g，豆饼或豆柏(含豆饼粉量计)5-30g, KH2PO41-1Og, MgSO40.1-0.5g, NaCl l_5g，吐温 80 0.1-1.0g。
[0013]种子在三角瓶中培养，装液量为30-100mL/250mL三角瓶或50-200mL/500mL三角瓶。发酵在三角瓶或发酵罐中培养。种子和发酵培养基灭菌温度为121°C下15-20min。
[0014]摇瓶培养条件为28 °C -37 °C下静止培养或30-100rpm摇床培养。
[0015]发酵罐培养条件为关闭进气或少量通气条件下培养，转速为40-100rpm，采用分批或补料分批发酵，用20-30%的NaOH控制pH5.0-7.0,发酵周期为20_30h。
[0016]本发明具有以下优点:
I利用廉价原料糖蜜、豆饼或豆柏发酵生产乳酸链球菌素，代替蔗糖、酵母粉、蛋白胨等原料，可以大幅度降低生产成本；
2本发明利用工业废料糖蜜、豆饼或豆柏作为发酵原料，可以达到变废为宝、综合利用资源的目的。
【具体实施方式】
[0017]以下是利用乳酸链球菌利用糖蜜、豆饼或豆柏为原料发酵生产乳酸链球菌素的实施例。但本发明并不限于所列出的几个实例。
[0018]实施例1
种子培养基(每U:鹿糖IOg,蛋白胨5g,酵母粉5g,氯化钠2g,;磷酸氢二钾IOg,硫酸镁0.2g/L;用三角瓶培养种子，装液量为200 mL /500mL。在30°C、50rpm条件下摇床培养6h ；
发酵培养基(每L):甘蔗糖蜜60g (以含还原糖计)，豆饼20g，氯化钠2g，磷酸氢二钾IOg,硫酸镁0.2g，吐温-80 Ig ；
在IOL发酵罐中进行分批发酵，接种量为8%，发酵过程中通过流加20%液碱控制pH6.5左右，关闭通气培养，搅拌转速80rpm，温度30°C ；
经过24h摇床培养，最终乳酸链球菌素效价5263IU/mL。
[0019]实施例2
按实施例1方法，先用摇瓶培养一级种子，再用IOL发酵罐培养二级种子,种子培养时间为5h左右。采用100L发酵罐培养，开始添加少量甘蔗糖蜜，控制初始还原糖浓度为15g/L，发酵过程中不断流加糖蜜，控制还原糖浓度为20-25g/L。豆饼添加量为15g/L，然后按实施例I加入其它营养成分。控制灭菌后体积75L，转入5L种子，搅拌转速50rpm，发酵温度300C，闭气培养。发酵过程中通过流加20%Na0H维持pH在6.5左右；
16h停止补加糖 蜜，经过20h发酵，残糖量为3.2g/L，发酵液中最终乳酸链球菌素效价5915IU/mL。
【权利要求】
1.一种利用廉价原料生产乳酸链球菌素的方法，以乳酸链球菌{Lactococcus Iactissubsp.7<3Cii5)E-15为出发菌株，其特征是利用糖蜜为碳源，以豆饼或豆柏为氮源，控制还原糖在30-100g/L，然后再添加无机盐等营养物质发酵生产乳酸链球菌素。
2.根据权利要求1所述的糖蜜做碳源、豆饼或豆柏为氮源生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于所述的糖蜜添加方法为一次性添加、分批流加或连续流加。
3.根据权利要求1所述的糖蜜做碳源、豆饼或豆柏为氮源生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于所述的发酵方法为:发酵培养基中各营养成分浓度为，糖蜜以含总还原糖计20-100g/L，豆饼或豆柏 5-30g/L，NaCl l_5g/L，KH2PO4 1-lOg/L，MgSO4 0.1-0.5g/L，吐温80 0.1-1.0g,培养温度28-37°C ;摇瓶培养条件为28 V _37°C下静止培养或30_100rpm摇床培养；发酵罐培养条件为关闭进气条件下培养，转速为40-100rpm，采用分批或补料分批发酵，用20-30%的NaOH控制pH5.0-7.0,发酵周期为20_30h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所用糖蜜为甜菜糖蜜或甘蔗糖蜜。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所用豆饼柏为黄豆饼柏或黑豆饼柏。
【文档编号】C12R1/46GK103805660SQ201210443722
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2012年11月9日
【发明者】康传利, 苏移山, 朱希强, 袁艳华, 张晓元, 凌沛学 申请人:山东福瑞达生物科技有限公司