一种无色素普鲁兰多糖的发酵生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种无色素普鲁兰多糖的发酵生产方法，其特点在于在发酵过程中添加微量复合氨基酸，氨基酸的添加量为0-0.5%，使发酵液色素含量低，发酵周期仅为50-55h，后续处理工艺简单，生产出的普鲁兰多糖无色素，品质好。本方法的实施步骤如下：1）制备种子培养基；2）制备发酵培养基；3）将液体种子接入到一级种子罐，接种量为3-5%，发酵培养24h，转入二级种子罐中培养12h，将种子培养基转入所述发酵培养基中培养，控制发酵温度为29℃±1℃，罐压为0.08MPa，初始pH为6.5-6.7，发酵培养50-55h；4）将上述发酵液经过滤，酒精沉淀，干燥得到无色素的普鲁兰多糖。
【专利说明】一种无色素普鲁兰多糖的发酵生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物发酵生产生物多糖的方法，更具体的说是普鲁兰多糖的发酵方法，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002]普鲁兰多糖(Pullulan)又称短梗霉多糖，是出芽短梗霉的发酵产物，是一种水溶性的细胞外中性大分子多糖。早在1936年人们就发现了普鲁兰多糖，1958年Bernier再次从发酵液中发现该多糖，次年Bender等人将之命名为短梗霉多糖。到二十世纪六十年代，人们开始对其发酵、提取和应用等方面进行研究，1978年日本林原公司实现了工业化生产普鲁兰多糖。普鲁兰多糖是一种以麦芽三糖为单元，以α-1，6键重复连接而成的线状高分子多糖，分子量一般在5.0X 104-5.0X 106dol.之间，它无色无味,无毒无害,对人体无任何副作用。并具有极佳的成膜性、氧气不渗透性、成纤维性、可塑性、粘结性和易自然降解等许多独特的物理化学和生物学特性，故可以被广泛的应用到医药制造业、食品工业、化妆品工业和农业等多个领域，是一种具有极大的应用价值和巨大开发潜力的多功能新型生物产品。目前，国内外用于普鲁兰生产的菌种均为出芽短梗霉，以蔗糖、葡萄糖等多种小分子糖类及可溶性淀粉做碳源，以酵母膏、玉米浆为有机氮源，进行发酵；下游处理时目前的普遍采用的方法为:发酵液稀释、离心、脱色、浓缩、酒精沉淀或者喷雾干燥。发酵时间一般在120-153小时，耗时比较长，得率低；发酵液为深褐色，含有的色素较多且难以除掉，使产品最终呈现不正常的颜色，影响产品品质；在下游处理时工序太多，耗费大量的酒精，且需要重复提纯、溶解、沉 降以除去杂质，相应地会延长生产周期，产品的损失量较大，使得生产成本大大增加。
[0003]因此，研究出一种节能高效的生产高品质无色素的普鲁兰多糖的发酵方法是该领域科研人员急待解决的问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种有效提高产品质量、工艺简单的无色素普鲁兰多糖的发酵方法以解决生产和应用的问题。
[0005]为实现上述目的，本发明通过下述步骤予以实现:
O制备种子培养基，其水溶液组成为(g/L):蔗糖40.0-60.0，氯化钠1.0-2.0，硫酸镁
0.1-0.4，磷酸氢二钾 5.0-8.0，硫酸铵 0.5-1.0，酵母膏 2.0-5.0，调 pH 为 6.5-6.7 之间，121°C 灭菌 20min ；
2)取一环出芽短梗霉菌种接入在上述种子培养基中，经一级种子、二级种子种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；
3)制备发酵初始培养基，其水溶液组成为(g/L):蔗糖100.0-150.0，氯化钠1.0-2.0，硫酸镁0.5-1.0，磷酸氢二钾5.0-8.0，硫酸铵1.0-2.0，复合氨基酸0_5.0，酵母膏
2.0-5.0，，消泡剂 0.3-0.5，调 pH 到 6.5-6.7 之间，121°C灭菌 20min ;4)将上述液体种子接入所述发酵培养基中，接种量为3%-5%，控制发酵温度为29 0C ±1°C，发酵培养 50-55h ;
5)将上述发酵液过滤，酒精沉淀，干燥得到白色的普鲁兰多糖。
[0006]本发明的有益效果是:在发酵培养基中添加了不同组成的复合氨基酸作为添加氮源，使得菌种在此条件下发酵的发酵液颜色浅，产量高，且发酵周期为50-55h，时间明显缩短，后期处理工序简单，使得生产更高效并节省了能源。在此条件下生产的普鲁兰多糖，颜色洁白，收率高。
【具体实施方式】
[0007]以下结合较佳实施例，【具体实施方式】详述如下。
[0008]对照例
1)制备种子培养基，其水溶液组成为(g/L):蔗糖40.0，氯化钠1.0，硫酸镁0.2，磷酸氢二钾6.0，硫酸铵1.0，酵母膏4.0，调Ph到6.5，121°C灭菌20min ；
2)取一环出芽短梗霉菌种接入在上述种子培养基中，经一级种子、二级种子种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；
3)制备发酵初始培养基，其水溶液组成为(g/L):蔗糖100.0，氯化钠1.0，硫酸镁0.2，磷酸氢二钾6.0，硫酸铵1.06，酵母膏2.0，调PH到6.5之间，121。。灭菌20min ；
4)将上述液体种子接入所述发酵培养基中，接种量为3%，控制发酵温度为29°C，发酵培养74h，发酵结束发酵液中多糖含量为64g/L ；
5)将上述发酵液过滤，酒精沉淀，干燥得到分子量为15万道尔顿的普鲁兰多糖，产品为浅黄色粉末，白度为58.9%，溶解后黄色透明。
[0009]比较例I
1)制备种子培养基，其水溶液组成为(g/L):蔗糖40.0，氯化钠1.0，硫酸镁0.2，磷酸氢二钾6.0，硫酸铵1.0，酵母膏4.0，调PH到6.5，121°C灭菌20min ；
2)取一环出芽短梗霉菌种接入在上述种子培养基中，经一级种子、二级种子种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；
3)制备发酵初始培养基，其水溶液组成为(g/L):蔗糖100.0，氯化钠1.0，硫酸镁0.2，磷酸氢二钾6.0,硫酸铵1.06,谷氨酸0.6，缬氨酸0.4，络氨酸0.3，丝氨酸0.4，酵母膏2.0，，调 PH 到 6.5 之间，121°C灭菌 20min ；
4)将上述液体种子接入所述发酵培养基中，接种量为3%，控制发酵温度为29°C，发酵培养51h，发酵结束发酵液中多糖含量为74g/L ；
5)将上述发酵液过滤，酒精沉淀，干燥得到分子量为18万道尔顿的普鲁兰多糖，产品为白色粉末，白度达98.9%，溶解后无色透明。
[0010]比较例2
1)制备种子培养基，其水溶液组成为(g/L):蔗糖50.0，氯化钠1.5，硫酸镁0.3，磷酸氢二钾7.0，硫酸铵0.8，酵母膏5.0，调PH到6.5之间，121。。灭菌20min ；
2)取一环出芽短梗霉菌种接入在上述种子培养基中，经一级种子、二级种子种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；
3)制备发酵初始培养基，其水溶液组成为(g/L):蔗糖120.0，氯化钠1.5，硫酸镁0.3，磷酸氢二钾7.0,硫酸铵0.8，谷氨酸0.1，蛋氨酸0.8，赖氨酸0.7，天冬氨酸0.8，酵母膏3.0，调 PH 到 6.5 之间，121°C灭菌 20min ；
4)将上述液体种子接入所述发酵培养基中，接种量为3%，控制发酵温度为29°C，发酵培养54h，发酵结束发酵液中多糖含量为82g/L ；
5)将上述发酵液过滤，酒精沉淀，干燥得到分子量为14万道尔顿的普鲁兰多糖，产品为白色粉末，白度达98.5%，溶解后无色透明。
[0011]比较例3
1）制备种子培养基，其水溶液组成为(g/L):蔗糖5.0，氯化钠1.5，硫酸镁0.3，磷酸氢二钾6.0，硫酸铵0.8，酵母膏3.0，调PH到6.7，121°C灭菌20min ；
2)取一环出芽短梗霉菌种接入在上述种子培养基中，经一级种子、二级种子种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；
3)制备发酵初始培养基，其水溶液组成为(g/L):蔗糖150.0，氯化钠2.0，硫酸镁0.3，磷酸氢二钾6.0，硫酸铵1.5，谷氨酸0.8，色氨酸0.5，丙氨酸0.5，胱氨酸0.5，酵母膏2.0,调 PH 到 6.5，121°C 灭菌 20min ；
4)将上述液体种子接入所述发酵培养基中，接种量为5%，控制发酵温度为29°C，发酵培养58h，发酵结束发酵液中多糖含量为112g/L ；
5)将上述发酵液过滤，酒精沉淀，干燥得到分子量为14万道尔顿之间的普鲁兰多糖，产品为白色粉末，白度达99.3%，溶解后无色透明。
【权利要求】
1.一种无色素普鲁兰多糖的发酵生产方法，包括出芽短梗霉的发酵培养和普鲁兰多糖的分离纯化，其特征在于在发酵培养基中添加微量复合氨基酸，发酵培养50-55h后,进行发酵液后处理提取纯化普鲁兰多糖。
2.根据权利要求1所述的一种无色素普鲁兰多糖的发酵生产方法，其特征在于:详细的步骤如下: (1)制备液体种子培养基，将出芽短梗霉菌种接到上述种子培养基，经一级、二级种子iil逐步扩大培养后，作为液体种子； (2)制备发酵培养基，调pH到6.5-6.7之间，121。。灭菌20min ； (3)将(I)所述液体种子接入到(2)所述发酵培养基中，接种量为3%-5%，控制发酵温度为 29°C ± 1°C，罐压为 0.08MPa,初始 pH 为 6.5-6.7，发酵培养 50_55h ； (4)将上述发酵液经过滤除菌，酒精沉淀，干燥得到无色素的普鲁兰多糖。
3.根据权利要求1、2所述的一种无色素普鲁兰多糖的发酵生产方法，其特征在于:种子培养基组成成分为(g/L):蔗糖40.0-60.0，氯化钠1.0-2.0，硫酸镁0.1-0.4，磷酸氢二钾5.0-8.0，硫酸铵 0.5-1.0，酵母膏 2.0-5.0, pH 为 6.5-6.7 之间。
4.根据权利要求1、2所述的一种无色素普鲁兰多糖的发酵生产方法，其特征在于:发酵培养基组成成分为(g/L):蔗糖100.0-150.0，氯化钠1.0-2.0，硫酸镁0.5-1.0，磷酸氢二钾5.0-8.0，硫酸铵1.0-2.0，复合氨基酸0-5.0，酵母膏2.0-5.0。
5.根据权利要求 1、4所述的一种无色素普鲁兰多糖的生产方法，其特征在于:发酵培养基中的复合氨基酸为蛋氨酸、络氨酸、丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸中的一种或几种，每种氨基酸的浓度为0-0.5%。
【文档编号】C12P19/04GK103805650SQ201210443725
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2012年11月9日
【发明者】王林, 朱希强, 苏移山, 朱云峰, 李伟, 凌沛学 申请人:山东福瑞达生物科技有限公司