一种快速检测小麦条锈菌新菌系v26的分子检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种小麦条锈病菌新毒性菌系V26的快速分子检测方法，通过大量筛选，得到小麦条锈菌新菌系V26的特异性标记，将其测序，根据测序结果，设计了一堆特异性引物V26SP1：5'?CTGTAAAGCGGATAAAGGAA?3'，V26SP2：5'?CATAAGAGCCACACTTGACC?3'。确立该引物对的优化PCR反应条件。用优化的PCR方法检测V26菌系的不同单孢系，分别以其他13个生理小种及超纯水为对照，获得V26的专化SCAR标记。主要用于对大田中V26菌系的早期快速检测，了解病菌的变异动态，为监测该均系及小麦条锈病的防治决策提供可靠的技术保障和理论依据。
【专利说明】一种快速检测小麦条锈菌新菌系V26的分子检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学中的PCR (Polymerase Chain Reaction)技术和RAPD(Random amplified polymorphic DNA)分子标记技术,通过涉及对条锈菌毒性菌系V26特异的分子标记，利用开发的SCAR标记快速检测该毒性菌系的一种新方法；
【背景技术】
[0002]小麦条镑病是由小麦条镑菌striiformis West f.sp.1riiici)引起的一种世界性小麦病害。具有发生范围广、流行速度快、危害损失大的特点。我国是小麦条锈病发生的重灾区，流行年份一般可造成20-30%的产量损失，历史上该病害在我国曾造成几次大的流行，1950年、1964年、1990年和2002年的几次大的流行，分别减产小麦60亿、32亿、25亿和14亿公斤，给我国小麦生产和粮食安全造成重大的损失和威胁。2002年以来，由于小麦条锈菌新小种的出现，导致我国小麦条锈病在我国部分地区连年成灾，年发生面积6000万亩左右，年损失小麦10亿公斤以上；
利用新的抗病基因进行抗病品种选育，种植和推广抗病品种是防治小麦条锈病最经济有效和对环境安全的方法。我国曾经由于新抗病品种的大面积的推广成功地控制了小麦条锈病多年。然而，由于小麦条锈菌属于专性寄生菌，病原菌小种极易受环境条件或基因突变发生变异形成新小种，造成生产上抗病品种的抗病性“丧失”，造成小麦条锈病的大面积流行成灾。自解放以来，我国就因为条锈菌新小种的产生并成为优势小种，造成7-9次的大面积种植品种更替。因此持续监测小麦条锈菌种群动态变异、及时发现新的小麦条锈菌毒性小种，是有效预测生产上抗病品种抗性“丧失”，小麦为抗病品种的合理利用、抗病育种和条锈病的持久控制提供重要的科学依据；
本世纪以来，由于小麦条锈菌新毒性小种的出现，致使我国90%以上的生产品种丧失抗病性。近年来，国内很多 育种单位均利用抗条锈病新基因1--选育出一批新的优良抗锈品种，并已在四川、甘肃等条锈病常发区大面积推广，对条锈病的控制起到了重要的作用，近几年，我国小麦条锈病发生和危害明显减轻，主要是因为新的抗病品种的大面积推广；2010年，我国小麦条锈病研究工作者已经发现了能够克服Yr26的新的条锈菌毒性小种V26，该小种能够克服含有1--的我国新培育出的一大批优良小麦品种，对小麦条锈病的防治再次带来了严重威胁。因此对该菌系的检测并对其变异动态进行实时检测具有重要的意义。然而，传统的利用鉴别寄主检测方法具有工作量大、周期长、难以进行大量标样鉴定、准确性也易受人员、鉴定条件等外界因素的影响等缺点。因此，开发一种快速、简便、高效的分子检测方法能够克服传统方法的弊端，对于该菌系的检测和病害控制具有重大意义；
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对传统鉴定技术存在的缺陷和不足，提供一种快速、准确、简便的检测条锈菌新毒性菌系V26的分子检测方法；实现上述发明的目的技术方案是一种快速检测小麦条锈菌新菌系V26的分子检测方法，包括下列步骤:
1.检测小麦条锈菌新毒性菌系V26的特异性引物设计
采用RAPD分子标记对新毒性菌系V26进行多态性扩增，筛选出该菌系的特异性条带；用DNA纯化回收试剂盒对特异性条带回收纯化；对纯化得到的条带进行蓝白斑筛选，克隆出特异性条带；对特异性条带测序；根据小麦条锈菌新毒性菌系V26 DNA的序列，设计了对该菌系具特异扩增作用的一对引物。
[0004] 2.小麦条锈菌新毒性菌系V26分子检测体系的建立
(1)提取条锈菌夏孢子基因组DNA。
(2)用RAPD分子标记进行多态性扩增
PCR扩增:15 μ L反应体系分别在PCR管中依次放入:10 X Buffer H 1.5yL、5U/yL的TaqDNA 聚合酶 0.08PL、25mmol/L 的 MgCl2 1.2PL、10mmol/L 的 dNTPs 0.3PL、50ng/y L 的弓丨物0.6PL、50ng/μ L的DNA 1ML,最后用无菌去离子水补齐至15μ?。离心IOsec,将PCR薄壁管放入PCR仪中扩增。反应在PTC-100热循环仪(MJ RESEARCH, Inc.)上进行，扩增程序为:扩增程序为:94°C 5min ；94°C 30s, 35°C 40s, 72°C 90s，44 个循环；72°C IOmin ;4°C终止。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶、IXTAE电泳缓冲液电泳分离，以ULTRA—URLET PRODUCTS凝胶成像系统记录分析RAPD谱型。
PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶、I X TAE电泳缓冲液电泳分析，电泳结束后用ULTRA—URLET PRODUCTS凝胶成像系统记录分析。
结果:用随机引物S1390 扩增后，大约在1300bp处出现了毒性菌系V26的特异性条带。
(3)采用DNA纯化回收试剂盒对特异性条带回收纯化。
(4)利用蓝白斑筛选法克隆出目的条带，然后对目的条带进行测序。
(5)SCAR标记的转化
依据得到的特异性条带的序列，设计一对能扩增出该菌系特异性的引物
V26SP1:5’ CTGTAAAGCGGATAAAGGAA 3’
V26SP2:5， CATAAGAGCCACACTTGACC 3，
用该引物PCR扩增:15yL反应体系分别在PCR中依次放入:10XBuffer H L 5 μ L、5υ/μ L 的 TaqDNA 聚合酶 0.15PL、25mmol/L 的 MgCl2 0.9PL、10mmol/L 的 dNTPs 0.3μ?,lOng/μ L的上游引物和下游引物各0.75PL、50ng/l.! L的DNA 1.5μ?，最后用无菌去离子水补齐至15μ?。离心lOsec，将PCR薄壁管放入PCR仪中扩增。反应在PTC-100热循环仪(MJRESEARCH, Inc.)上进行，扩增程序为:第一循环 94°C 5min、然后 94°C lmin、57°C lmin、72°C 90sec，共34个循环；最后一循环，72°C延伸lOmin，4°C终止，扩增完成。
(3)PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶、I XTAE电泳缓冲液电泳分析，电泳结束后用ULTRA—URLET PRODUCTS凝胶成像系统记录分析。
(4)大约在500bp处出现毒性菌系V26的特异性条带。
本发明多用探针(引物)对小麦条锈菌新毒性菌系V26均有很高的特异性，能够用于提前预测田间小麦条锈菌侵染是否是由毒性菌系V26侵染所致，可明显区别小麦条锈菌不同生理小种，如感染“中四”小麦新菌系T4、Sull-4、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33等【专利附图】
【附图说明】[0005]
图1是RAro分子标记随机引物扩增出的小麦条锈菌新毒性菌系V26的特异性条带图:泳道 2-8 分别为条锈菌 T4、Sul 1-4、V26、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33
图2是用设计的特异性引物通过SCAR标记扩增出小麦条锈菌新毒性菌系V26的特异性条带图:泳道 2-8 分别为条锈菌 T4、Sull-4、V26、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33
【具体实施方式】:
实施例1
1.样品米集
2012年10月5日，西北农林科技大学植病试验站，分别采集接种过条锈菌T4、Sull-4、V26、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33的小麦叶片样本，去离子水冲洗小麦叶片，_80°C保存备用。
2.小麦条锈菌新毒性菌系V26检测
(1)提取小麦叶片条锈菌夏孢子基因组DNA；
(2)PCR扩增:15μL反应体系分别在PCR管中依次放入:10XBuffer H 1.5μ L,5U/y L的 TaqDNA 聚合酶 0.15PL、25mmol/L 的 MgCl2 0.9μ?、10mmol/L 的 dNTPs 0.3μ?、IOng/μ L 的上游引物和下游引物各0.75PL、50ng/l.! L的DNA 1.5μ?，最后用无菌去离子水补齐至15μ?。离心lOsec，将PCR薄壁管放入PCR仪中扩增。反应在PTC-100热循环仪(MJ RESEARCH,Inc.)上进行，扩增程序为:第一循环 94°C 5min、然后 94°C lmin、57°C lmin、72°C 90sec,共34个循环；最后一循环， 72°C延伸10min，4°C终止，扩增完成。
(3)PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶、I XTAE电泳缓冲液电泳分析，电泳结束后用ULTRA—URLET PRODUCTS凝胶成像系统记录分析。
3.检测结果
共有2个接种有条锈菌新毒性菌系V26的样品在500bp左右出现了特异性条带；而其它条锈菌生理小种接种的小麦叶片、未接种叶片和清水对照等处理在该位置均没有出现条带，这表明该检测体系能够在早期检测小麦条锈菌V26的田间带菌是否是由毒性菌系V26侵染引起的。
实施例2
1.样品采集
2012年11月7日，陕西杨凌，随机采集200株无症状的小麦叶片；去离子水冲洗小麦叶片，-80°C保存备用。
2.小麦条锈菌新毒性菌系V26检测
(1)提取小麦叶片条锈菌夏孢子基因组DNA；
(2)PCR扩增:15μL反应体系分别在PCR管中依次放入:10XBuffer H 1.5μ L,5U/y L的 TaqDNA 聚合酶 0.15PL、25mmol/L 的 MgCl2 0.9μ?、10mmol/L 的 dNTPs 0.3μ?、IOng/μ L 的上游引物和下游引物各0.75PL、50ng/l.! L的DNA 1.5μ?，最后用无菌去离子水补齐至15μ?。离心lOsec，将PCR薄壁管放入PCR仪中扩增。反应在PTC-100热循环仪(MJ RESEARCH,Inc.)上进行，扩增程序为:第一循环 94°C 5min、然后 94°C lmin、57°C lmin、72°C 90sec,共34个循环；最后一循环，72°C延伸10min，4°C终止，扩增完成。
(3)PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶、I XTAE电泳缓冲液电泳分析，电泳结束后用ULTRA—URLET PRODUCTS凝胶成像系统记录分析。
3.检测结果
共有3个小麦叶片样品在500bp出现了一条特异性条带，该结果能明显的鉴别出样品所带的菌是由小麦条锈菌 新毒性菌系V26侵染所致。
【权利要求】
1.小麦条锈菌新毒性菌系V26的特异性RAro引物筛选和特异性引物的设计，其特征在于: 根据小麦条锈菌新菌系V26 DNA序列的特性，筛选到一个特异性的RAPD引物S1390(5’ -TGGTCGGGTG-3’)，利用该引物能稳定的扩增出条锈菌V26的特异性条带，经对该条带进行回收、纯化、克隆并测序，其长度约为1367bp:据此，设计了一对特异性引物，成功地将其转化为小麦条锈菌新菌系V26稳定的SCAR标记； 特异性引物碱基序列:
V26 SP-1:5’ CTGTAAAGCGGATAAAGGAA 3’ ；
V26 SP-2:5， CATAAGAGCCACACTTGACC 3，。
2.小麦条锈菌新毒性菌系V26快速检测体系建立，权利要求1所述必须遵循以下程序: S提取田间小麦叶片或采集的小麦条锈菌夏孢子基因组DNA ；t利用以下优化体系:15yL反应体系分别在PCR中依次放入=IOXBuffer H，1.5μ L、5U/y L 的 TaqDNA 聚合酶 0.15PL、25mmol/L 的 MgCl2 0.9PL、10mmol/L 的 dNTPs，0.3PL、10ng/y L的上游引物和下游引物各0.75PL、50ng/y L的DNA 1.5μ?，最后用无菌去离子水补齐至?5μ? ； 离心IOsecJf PCR薄壁管放入PCR仪中扩增； 反应在PTC-100热循环仪(MJ RESEARCH, Inc.)上进行，扩增程序为:第一循环，940C 5min、然后 94°C lm in、57°C lmin、72°C 90sec，共 34 个循环；最后一循环，72°C 延伸，10min，4°C终止，扩增完成； ;PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶、I X TAE电泳缓冲液电泳分析，电泳结束后用ULTRA—URLET PRODUCTS凝胶成像系统记录分析；大约在500bp处出现毒性菌系V26的特异性条带。
【文档编号】C12Q1/04GK103805598SQ201210442505
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月8日 优先权日:2012年11月8日
【发明者】王保通, 郭婧, 李强 申请人:王保通, 西北农林科技大学