专利名称：棉花fdh基因的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中棉花FDH基因的启动子及其应用。
背景技术：
我国是全球最大的棉花生产国，棉花作为首要的纤维作物和重要的油料作物在我 国国民经济中起着举足轻重的作用。由于人民对于生活水平要求的不断提高，纺织工业快 速发展，以至对棉纤维品质的要求越来越高。我国棉花纤维品质偏差，比强度也比较低，棉 纤维品质问题已成为制约我国棉花产业可持续发展的主要障碍。棉纤维发育可分成四个相互重叠的时期纤维细胞的起始(开花前1天至开花后 2-3天)、伸长(开花后2-3天至25天)、次生壁沉积(开花后16天至45天)及成熟期(开 花后45天至50天)。对于快速伸长时期的纤维，其伸长的峰值速率可达到2毫米/天。纤 维的长度与强度决定了纤维的品质，研究棉纤维发育的分子机理是棉花遗传改良的基础。启动子位于基因5’端上游(非翻译区)的一段DNA序列，作为调控基因表达的“开 关”，控制基因表达的起始时间和表达的程度，因此，启动子是决定基因特异性表达的DNA序 列，受其调控的基因表达呈现明显的组织特异性和发育的阶段性。在棉纤维遗传改良中，纤 维特异启动子是重要的基因工程元件，利用此类启动子可驱动对纤维品质改良有用的基因 在纤维中实现特异性的表达。因此，分离与克隆特异性强、活性高的启动子是棉纤维基因工 程改良的重要内容，是建立棉花高效遗传转化体系的基础。启动子不仅决定着基因的时空表达，也决定了基因的表达强度。目前，在植物基因 工程中，CaMV35S启动子被广泛应用。CaMV35S启动子是组成型表达启动子，驱动外源基因 在植物各组织的发育过程中表达。但是，在利用分子生物学手段对植物进行改良的过程中， 人们更希望插入的外源基因可以在特定的组织中特异表达，从而在获得优良性状的同时不 影响其他特性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA分子。本发明所提供的DNA分子，来源于棉花(Gossypium spp.)，为如下1)_3)中任一所 述的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)或2)的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。含有所述DNA分子的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发 明的保护范围。所述重组表达载体为用所述DNA分子替换pCAMBIA 1305载体上的35S启动子得 到的重组表达载体。本发明的另一个目的是提供所述DNA分子在使目的基因在棉纤维细胞中表达中的应用。本发明构建了 1个FDH基因启动子片段(807bp)驱动⑶S基因表达载体。⑶S组 织化学染色证实这个启动子片段能指导报告基因在棉花纤维中正常表达。因此，FDH启动 子可用于研究棉花纤维的发育、品质改良以及外源基因在棉花纤维中的特异表达。
图1为实时定量qRT-PCR检测FDH基因在棉花不同组织的表达。图2为陆地棉FDH基因启动子序列分析。图3为棉花胚珠瞬时表达体系分析FDH promoter-pCAMBIA1305载体启动⑶S基 因的表达。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、克隆陆地棉FDH基因启动子序列一、获得陆地棉FDH基因启动子序列1、用染色体步移法获得基因FDH编码区上游的启动子序列由于棉花基因组信息尚不完整，用染色体步移法(Genomic Walking)以获得基因 编码区上游的启动子序列。染色体步移法是基于PCR和平端内切酶的一项技术。基因组 DNA用平端内切酶消化后的片断与Adaptor相连，以此作为模板，用针对Adaptor设计的引 物和基因内部引物进行PCR，可以由一段已知的序列来寻找相近的未知基因组DNA序列。用染色体步移法得到的纤维表达特异性基因FDH编码区上游的启动子序列为 807bp，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。对此序列进行顺式调控元件分析，序列分析 网站为 http //bioinformatics, psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/。通过对 FDH 基因ATG上游807bp的序列顺式调控元件进行分析，确定了转录起始位点TATA box和CART box，初步确定该序列的基本结构，如图2所示。2、检测获得的基因FDH编码区上游的启动子序列在棉花不同部位的表达提取野生型陆地棉徐州-142(中国农业科学院棉花研究所国家棉花种质中期 库，ZM-01345)的根、茎、幼叶、成熟叶、花、10DPA纤维(10DPA纤维的棉纤维细胞处于伸长 期)和10DPA胚珠组织(本实验中所用的10DPA胚珠组织为去掉10DPA纤维的10DPA胚 珠组织)，以及无纤维突变体fl (该突变体不产生棉纤维)(中国农业科学院棉花研究所 国家棉花种质中期库，ZM-30188)的10DPA的无毛胚珠RNA，反转cDNA第一链后作为实时 定量 qRT-PCR 模板，引物为 FDH_RT_SP(SP-sense primer)和 FDH_RT_AP (AP-antisense primer)，引物序列如下FDH_RT_SP :5，-ATGCTCCGCTGTGCTTTTGTC-3，禾口FDH_RT_AP :5，-CATATGCTGCTGCTCGATGTGT-3，。以无纤维突变体fl为对照，检测该基因在棉花不同部位的表达情况。检测结果 如图1所示，从左至右依次为根、茎、幼叶、成熟叶、花、10DPA纤维和10DPA胚珠组织，以及 无纤维突变体fl的10DPA的无毛胚珠。以无纤维突变体fl的10DPA的无毛胚珠为对照，FDH基因的表达量以棉花中已知看家基因GhUBQ7相对表达量表示。由图1可见，FDH基因 在10DPA纤维中特异表达。实施例2、陆地棉FDH基因启动子功能鉴定一、构建表达载体 FDH promoter-pCAMBIA 1305根据实施例1中获得的FDH基因启动子序列，设计了引物5’ -FDH pt-Kpnl和 3，-FDH pt-Ncol,以野生型陆地棉徐州-142的10DPA纤维的基因组DNA为模板，进行PCR 扩增。在引物5’端加上了 Kpnl、NcoI酶切位点及保护碱基。引物序列如下5' -FDH pt-Kpnl :GGggtaccCTTGCTCGGCTGTCATTTTC，小写字母为 KpnI 酶切位点，3，-FDH pt-NcoI =CATGccatggATTAAAAGACCTGGTGTAACGGTGA,小写字母为 NcoI 酶 切位点。载体pCAMBIA 1305 (购自澳大利亚CAMBIA公司)由KpnI和NcoI酶进行酶切鉴 定，去掉35S启动子序列，回收大片段。扩增产物经KpnI和NcoI酶切后与载体相连接，取 代35S启动子，构建成驱动GUS基因表达载体FDH promoter_pCAMBIA1305，该载体中，在GUS 基因上游没有其它任何启动子，只有插入的DNA片段。将表达载体FDH promoter-pCAMBIA 1305转入大肠杆菌DH5a菌株，抗性 筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取质粒，进行测序检测表达载体 FDHpromoter-pCAMBIA 1305中的FDH基因启动子序列，测序结果表明，在载体pCAMBIA1305 的KpnI和NcoI酶切位点间插入的基因序列与序列表中序列1 一致。二、基因枪法转化胚珠1、实验材料野生型陆地棉徐州-142在温室中培养，开花一天后收取棉花整花。2、实验试剂金粉直径为l.OymCaCl2 2. 5M/L亚精胺0·1M/L基因枪所用试剂均购于Bio-Rad公司。3、实验仪器超声破碎仪基因枪，购于Bio-Rad 公司，型号 PDS_1000/H2Biolistic4、实验用品IlOOp压力膜，承载膜，铜网，全套设备均购于Bio-Rad公司。5、固体培养基固体培养基在棉花组培液液体培养基的基础上，另加0. 6%琼脂粉，灭菌后倒平 板。棉花组培液液体培养基的组成为表1所示。表1棉花组培液液体培养基的组成
权利要求
一种DNA分子，为如下1) 3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)或2)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。
2.含有权利要求1所述的DNA分子的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为用权利要 求1所述的DNA分子替换pCAMBIA 1305载体上的35S启动子得到的重组表达载体。
4.权利要求1所述的DNA分子在使目的基因在棉纤维细胞中表达中的应用。
全文摘要
本发明公开了棉花FDH基因的启动子及其应用。本发明所提供的棉花FDH基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)或2)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。本发明构建了1个FDH基因启动子片段(807bp)驱动GUS基因表达载体。GUS组织化学染色证实这个启动子片段能指导报告基因在棉花纤维中正常表达。因此，FDH启动子可用于研究棉花纤维的发育、品质改良以及外源基因在棉花纤维中的特异表达。
文档编号C12N15/63GK101967483SQ201010291850
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者朱玉贤, 柳皋隽, 秦咏梅 申请人:北京大学