专利名称：应用酵母控制乳酸乳球菌发酵酸度生产乳酸链球菌素的方法
应用酵母控制乳酸乳球菌发酵酸度生产乳酸链球菌素的方法技术领域：
本发明涉及一种生产乳酸链球菌素(Nisin)的方法，具体说是利用酵母和乳 酸乳球菌混菌发酵来达到控制发酵体系的pH值，避免使用碱液中和调节pH值生产 乳酸链球菌素的方法。
背景技术：
乳酸链球菌素是某些乳酸乳球菌乳酸亚种(Zac/ococc"s /flcto subsp丄actis)产 生的一种细菌素，首次发现于1928年。随着食品天然化的发展趋势，天然防腐剂 倍受青睐。目前，乳酸链球菌素作为一种天然的抗菌物质，已被50多个国家和地 区批准使用于食品防腐并表现出良好的应用前景。现已广泛应用在乳制品、肉制 品、罐头制品、果汁和酒精饮料等多种食品中。随着应用研究的深入己经扩展到 医药、造纸、活性食品包装、农业饲料等领域。
由于乳酸链球菌素的产生菌是乳酸菌，发酵过程中产生乳酸，导致pH降低， 抑制了菌体生长，同时抑制了乳酸链球菌素的合成，工业生产中需要向发酵液中 加入碱液或加入CaC03的方法来控制发酵液的pH值，但生成的乳酸盐对乳酸菌的 生长也有抑制作用。而加入CaC03的办法不利于后续的分离提取。所以如何消除 发酵液中的乳酸对乳酸菌发酵生产乳酸链球菌素来说至关重要。
发明内容
为解决上述问题本发明设计了一种通过酵母控制乳酸乳球菌发酵过程中发酵液 的酸度，高效率生产乳酸链球菌素的方法。该方法利用酵母和乳酸乳球菌的混菌培养 来控制发酵液pH值，克服了工业上用补加碱来控制发酵液的pH值，从而引起的乳酸盐 对乳酸菌的生长抑制作用或加入CaC03的方法引起的分离提取困难的问题。
为实现发明目的，本发明公开了一种应用酵母控制乳酸乳球菌发酵酸度生产 乳酸链球菌素的方法，其特征在于分别制备酵母和乳酸乳球菌种子液，两种种子 液各按照体积百分数1-5%的接种量接种于发酵培养基中混菌发酵，得到乳酸链球 菌素。
所述的酵母为酿酒酵母Sacc/2"rw^c^ cerev"ffle，是公认安全的菌株；所述乳 酸链球菌素产生菌为乳酸乳球菌乳酸亚种丄fl"ococc";y /ac"s subsp.lactis。
3在传统的乳酸链球菌素发酵生产过程中，由于乳酸链球菌素产生菌乳酸乳球 菌是同源乳酸产生菌，会将部分底物转化为乳酸，从而导致发酵体系的pH值降低。 因此，在发酵过程中需要补给碱(如CaC03等)的方法来控制发酵体系的pH值， 此时生成的乳酸盐对乳酸菌的生长也有抑制作用，并且加入CaC03后，不利于后 续乳酸链球菌素的分离纯化。
本发明使用乳清粉作为发酵培养基，同时，选择一株不利用乳糖，但利用乳 酸的酵母，以便不与乳酸菌竞争利用发酵培养基中的乳糖，而酵母利用乳酸菌在 发酵生产过程中产生的乳酸为碳源，达到了不用外加碱方法来控制发酵体系pH的 目的，不仅促进了乳酸菌的生长，同时也达到了促进乳酸链球菌素产生的目的， 并且有利于环境。
与现有技术相比，酵母与乳酸菌混菌发酵的有益之处在于酵母菌利用乳酸 菌产生的乳酸，解除了乳酸的积累对乳酸菌生长和对乳酸链球菌素生产造成的抑 制作用。发酵过程中两株菌互利共生，达到高效率生产乳酸链球菌素的效果。在 我们的实验中产率提高2倍多。乳清培养基成本比原有发酵培养基成本降低20%。
以下结合本发明的实施例进行详细叙述。
具体实施方式
本发明生产乳酸链球菌素方法可以是如下具体步骤
1) 种子液制备
酵母种子培养基采用YEPD培养基或麦芽汁培养基，乳酸乳球菌种子培养基 采用CM培养基或脱脂乳培养基，两种种子培养基经灭菌冷却后，将两种菌种分别 接入种子培养基，培养至对数期；
2) 混菌发酵-
按步骤l)制得的种子液按照比例同时接入到发酵培养基中，进行混菌发酵， 发酵时间18-28小时。
本发明生产乳酸链球菌素方法还可以是如下具体步骤
1)种子液制备
酵母种子培养基采用YEPD培养基或麦芽汁培养基，乳酸乳球菌种子培养基 采用CM培养基或脱脂乳培养基，两种种子培养基经灭菌冷却后，将两种菌种分别 接入种子培养基，培养至对数期；2)混菌发酵
按步骤l)制得的种子液按照比例先后接入到发酵培养基中，首先在发酵培养
基中接入酵母菌种子液，在其后〉0-5小时再接入乳酸乳球菌种子液，进行混菌发 酵，发酵时间18-28小时。
在所述制备方法中，所述YEPD培养基蛋白胨2%、酵母膏1%和葡萄糖2%， pH为6.0，在12rC灭菌20min制得。
所述麦芽汁培养基大麦芽加4倍水,在65'C糖化4小时，过滤后稀释，自然 pH，在12rC灭菌20min制得。
所述CM培养基蔗糖1%、蛋白胨1%、酵母粉1%、 K2HP041%、 NaC10.2% 和MgSO4 0.02%， pH为6.8，在12rC灭菌20min制得。
所述脱脂乳培养基脱脂乳10%，自然pH，在115t:灭菌15min制得。
本发明提供用酵母和乳酸乳球菌混菌发酵生产乳酸链球菌素的方法，按照常 规方法制备酵母菌和乳酸菌种子液，按照一定比例接种混菌发酵。混菌发酵使用 的酵母可以利用乳酸乳球菌在发酵时产生的乳酸作为碳源，而又不利用发酵培养 基中的乳糖，既避开了与乳酸菌竞争碳源，还可以达到消除发酵液中乳酸的目的， 从而达到控制发酵液pH值的目的，两菌互利共生，促进了乳酸链球菌素的生产。
实施例l、
1) 将酵母菌CICC 1.383在下述种子培养基中3(TC，培养8小时； 酵母培养基蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%， pH6.0， 12rC灭菌20min ;
2) 将乳酸菌TCCC 12001在下述种子培养基中3(TC，培养6小时；
乳酸菌培养基蔗糖1%、蛋白胨1%、酵母粉1%、 K2HP041%、 NaC10.2%、 MgSO4 0.02%， pH6.8， 121。C灭菌20min;
3) 制备下述发酵培养基
发酵培养基6%乳清粉+1%酵母膏。初始pH值6.5。 110'C灭菌20min;
4) 混合菌种发酵首先取培养至对数生长期的酵母菌的种子液，离心弃去上 清液，按照5%的接种量将菌体接入发酵培养基中，然后再接入3%的对数期乳酸菌 种子液继续培养，混合菌种发酵到16小时结束。
实施例2、1) 将酵母菌CICC 1.346在下述种子培养基中3(TC，培养8小时； 酵母培养基蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%， pH6.0， 12rC灭菌20min 。
2) 将乳酸菌CGMCC 1.2829在下述种子培养基中30'C，培养6小时；
乳酸菌培养基蔗糖1%、蛋白胨1%、酵母粉1%、 K2HP041%、 NaC10.2%、 MgSO4 0.02%， pH6.8, 121 。C灭菌20min;
3) 制备下述发酵培养基
发酵培养基6%乳清粉+1%酵母膏。初始pH值6.5。 110'C灭菌20min;
4) 混合菌种发酵首先取培养至对数生长期的酵母菌的种子液，按照3%的 接种量将菌体接入发酵培养基中，培养3小时，然后再接入3%的对数期乳酸菌种 子液继续培养，混合菌种发酵到18小时结束。
实施例3、
1) 将酵母菌CGMCC2.407在下述种子培养基中30'C，培养10小时；
麦芽汁培养基大麦芽加4倍水。65。C糖化4小时，过滤后稀释，自然pH， 121 r灭菌20min;
2) 将乳酸菌CGMCC 1.2030。在下述种子培养基中30。C ，培养5小时； 脱脂乳培养基脱脂乳10%，自然pH， 115'C灭菌15min;
3) 制备下述发酵培养基
发酵培养基7%乳清粉+1%酵母膏。初始pH值6.5。 11(TC灭菌20min;
4) 混合菌种发酵首先取培养至对数生长期的酵母菌的种子液，按照5%的 接种量将菌体接入发酵培养基中，培养2小时，然后再接入3%的对数期乳酸菌种 子液继续培养，混合菌种发酵到20小时结束。
实施例4、
1) 将酵母菌CGMCC2.407在下述种子培养基中3(TC,培养10小时； 酵母培养基蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%， pH6.0， 12rC灭菌20min ;
2) 将乳酸菌CGMCC 1.2829在下述种子培养基中30'C，培养6小时；
乳酸菌培养基蔗糖1%、蛋白胨1%、酵母粉1%、 K2HP041%、 NaC10.2%、 MgSO4 0.02%， pH6.8， 12rC灭菌20min;
63) 制备下述发酵培养基
发酵培养基6%乳清粉+1%酵母膏。初始pH值6.5。 110'C灭菌20min;
4) 混合菌种发酵首先取培养至对数生长期的酵母菌的种子液，按照3%的 接种量将菌体接入发酵培养基中，然后再接入2%的对数期乳酸菌种子液继续培 养，混合菌种发酵到22小时结束。
实施例5、
1) 将酵母菌CICC 1.346在下述种子培养基中30'C，培养8小时； 酵母培养基蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%， pH6.0, 12rC灭菌20min ;
2) 将乳酸菌TCCC 12001在下述种子培养基中30'C，培养6小时；
乳酸菌培养基蔗糖1%、蛋白胨1%、酵母粉1%、 K2HP041%、 NaC10.2%、 MgSO4 0.02%， pH6.8， 12rC灭菌20min;
3) 制备下述发酵培养基
发酵培养基7%乳清粉+1%酵母膏。初始pH值6.5。 11(TC灭菌20min;
4) 混合菌种发酵首先取培养至对数生长期的酵母菌的种子液，按照5%的 接种量将菌体接入发酵培养基中，培养2小时，然后再接入4%的对数期乳酸菌种 子液继续培养，混合菌种发酵到18小时结束。
权利要求
1、一种应用酵母控制乳酸乳球菌发酵酸度生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于分别制备酵母和乳酸乳球菌种子液，两种种子液各按照的体积百分数1-5％的接种量接种于发酵培养基中混菌发酵，得到乳酸链球菌素。
2、 根据政利要求l所述的应用酵母控制乳酸乳球菌发酵酸度生产乳酸链球菌 素的方法，其特征在于所述酵母为酿酒酵母Sacc/wro/nyc"cerev/w》e;所述乳酸链 球菌素产生菌为乳酸乳球菌乳酸亚种丄a"ococc^ subsp.lactis。
3、 根据权利要求2所述的应用酵母控制乳酸乳球菌发酵酸度生产乳酸链球菌 素的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下1) 种子液制备酵母种子培养基采用YEPD培养基或麦芽汁培养基，乳酸乳球菌种子培养基 采用CM培养基或脱脂乳培养基，两种种子培养基经灭菌冷却后，将两种菌种分别 接入种子培养基，培养至对数期；2) 混菌发酵按步骤l)制得的种子液按照比例同时接入到发酵培养基中，进行混菌发酵， 发酵时间18-28小时。
4、 根据权利要求2所述的应用酵母控制乳酸乳球菌发酵酸度生产乳酸链球菌 素的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下1) 种子液制备酵母种子培养基采用YEPD培养基或麦芽汁培养基，乳酸乳球菌种子培养基 采用CM培养基或脱脂乳培养基，两种种子培养基经灭菌冷却后，将两种菌种分别 接入种子培养基，培养至对数期；2) 混菌发酵按步骤l)制得的种子液按照比例先后接入到发酵培养基中，首先在发酵培养 基中接入酵母菌种子液，在其后〉0-5小时再接入乳酸乳球菌种子液，进行混菌发 酵，发酵时间18-28小时。
全文摘要
本发明是一种应用酵母控制乳酸乳球菌发酵酸度生产乳酸链球菌素的方法。是利用酵母和乳酸菌的混合发酵来达到控制发酵体系的pH值，避免使用碱液中和调节pH值，以高效率生产乳酸链球菌素。本发明混合发酵使用的酵母可以利用乳酸菌产生的乳酸作为碳源，而不利用发酵培养基中的乳糖，避开了与乳酸菌竞争碳源，可以达到消除发酵液中乳酸的目的，从而控制住发酵液的pH值。通过两菌互利共生，达到有效促进乳酸链球菌素生产的目的。该方法利用酵母和乳酸菌的混合培养来控制pH值，避免使用碱液中和调节，对保护环境有重要意义。
文档编号C12P39/00GK101649343SQ20091007040
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月11日 优先权日2009年9月11日 公开号200910070406.发明者贾士儒, 赵树欣, 郭淑文 申请人:天津科技大学