专利名称：一种抗农药敌百虫的特异性抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及选择一种具有-C00H的、又最大可能包含敌百虫原有结构的化合物作 为敌百虫半抗原，并将半抗原制成抗原、进而产生抗体；以及此类半抗原、抗原的合成与抗 体制备方法。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
随着现代农业的发展，农药一方面在农业生产中发挥着越来越重要的作用，另一 方面，农药的不合理使用也导致了严重的农药残留超标问题，严重影响人们的身体健康和 农产品出口贸易。敌百虫是一种水溶性的杀虫剂，纯品为白色结晶粉末，对高等动物和昆虫 间表现了突出的选择毒性。而且，敌百虫还是敌敌畏的前体物质，在碱性介质中，易脱去氯 化氢分子重排变为毒力较大的敌敌畏。我国对于敌百虫在农产品中的残留量，有较为严格 的标准。按照GB2763-2005的规定稻谷彡0. lmg/mL，小麦彡0. lmg/mL，水果彡0. lmg/mL, 蔬菜彡0. lmg/mL。然而，目前敌百虫农药及其代谢产物，由于其分子量为257. 5，小于 1000dolton(道尔顿)，一般传统上采用气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)或质谱等物化方法 对其残留进行检测。虽然这些传统的理化分析方法灵敏度较高，而且较为准确，但由于它们 普遍操作繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，所以难于满足实际分析的需要，因此迫切需要 发展一种简单、快速、灵敏的分析技术。而免疫分析技术正是一种快速、灵敏、操作简单、费用低的检测技术。其基本原理 认为抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德华引力作用等诸多 因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可体内进行，也可体外进行，这些 特点使其能被利用建立免疫分析方法，可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏 度。所以，免疫分析为敌百虫残留研究提供了一条新的分析检测途径。
发明内容
本发明设计合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人 工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和 易被检测识别的标记物的放大作用，从而定性定量的检测样本中超微量小分子目标物，可 用于样本测定。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和全抗原及抗体的制备。本发明为达到以上目的所设计的技术方案是合成分子结构式如下图所示的敌百 虫半抗原，
权利要求
1.农药敌百虫的人工抗原和抗体其特征在于使用分子式为
2.权利要求1所述的农药敌百虫人工抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得(1)半抗原2，2，2-三氯_1-(二甲氧基磷酰基)_乙基单酯琥珀酸的合成敌百虫原料[(2，2，2-三氯-1-羟基乙基)磷酸二甲基酯]300mg加入到20mL含70mg 丁二酸酐的无水吡啶溶液中，在隔离空气条件下室温搅拌反应10 22h，待反应停止后在 30°C搅拌条件下进行减压抽干，除去吡啶；然后用浓盐酸与水之比1 6 10的溶液酸洗 涤后用乙酸乙酯进行萃取，合并有机相无水硫酸钠除水，减压条件下旋蒸除去乙酸乙酯即 可合成敌百虫半抗原[2，2，2-三氯-1-( 二甲氧基磷酰基)-乙基单酯琥珀酸]；(2)半抗原活化酯的合成在100mL圆底烧瓶中，敌百虫半抗原[2，2，2-三氯-1- ( 二甲氧基磷酰基)-乙基单酯 琥珀酸]300mg加入到10mL溶有167mgN_羟基琥珀酰亚胺的无水二氯甲烷中，冰浴下搅拌 反应30-60min后，在氮气保护下逐滴滴加3. 5mL溶有207mgDCC的无水四氢呋喃，继续在冰 浴下搅拌反应1 4h，然后自然升至室温搅拌过夜，终止反应后，过滤除去白色沉淀，得到 敌百虫半抗原活化酯{[2，2，2-三氯-1-( 二甲氧基磷酰基)乙羰基]琥珀酸(2，5-二氧代 环戊基)酯}；(3)人工抗原的合成取半抗原活化酯[2，2，2-三氯-1-( 二甲氧基磷酰基)乙羰基]琥珀酸(2，5-二氧代 环戊基)5mg酯溶于适量250ul DMF中配置成A液，将15mg血兰蛋白溶于3mL磷酸氢二钾 溶液中配置成B液，将A液在冰浴下滴加入B液中，滴加完毕后3 5°C下搅拌反应过夜，然 后将反应液装入透析袋，用O.Olmol/L PBS溶液充分透析，得到人工抗原。
3.权利要求1所述的农药敌百虫酶标抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得取权利要求2中所合成的半抗原活化酯1.67mg溶于2ml 二甲基甲酰胺配成溶液A， 0. 51mg辣根过氧化物酶溶于2ml pH 7. 4的0. 2mol/L磷酸缓冲液配成溶液B，然后在冰浴 下将溶液A缓慢的加入溶液B中，经搅拌后在4°C下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中， 在4°C下用pH7. 4的0. 2mol/L磷酸缓冲液透析三天即可得到酶标抗原，用于显色反应。
4.权利要求1所述的农药敌百虫抗体的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得免疫动物选用雌性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次 加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后间隔一个月进行第五次免疫，免疫后9天由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是初次免疫取lmg按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和 弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；加强免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所 配制的溶液，进行动物免疫；抗体纯化定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血 液，并离心获得抗血清，使用G-S印harose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗农药 速灭威的特异性抗体。
全文摘要
农药敌百虫人工抗原和抗体的制备方法，涉及一种最大程度保留农药敌百虫结构的人工半抗原、抗原和抗体的制备方法，通过化学合成方法制得的敌百虫半抗原的活化酯与载体蛋白钥孔血兰蛋白相连接合成人工抗原，抗体是人工抗原经动物免疫、取血，分出抗血清，纯化制得。本发明是通过设计合成具有敌百虫结构的半抗原和人工抗原，突出了此农药分子特异性抗原决定簇又克服了化学合成的困难，并采用免疫动物诱导产生亲和性很高的抗体；与其他同类方法相比，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点，所设计、合成的半抗原为制备特异性良好的抗体奠定了基础。
文档编号C12N9/96GK102002103SQ20091007034
公开日2011年4月6日 申请日期2009年9月3日 优先权日2009年9月3日
发明者张燕, 王俊平, 王硕, 葛玉 申请人:天津科技大学