乳球菌启动子和其用途的制作方法

专利名称：乳球菌启动子和其用途的制作方法
专利说明乳球菌启动子和其用途 发明领域 本发明在分子生物学领域内，并且涉及重组基因工程及蛋白质表达。更具体地，本发明涉及用于蛋白质的重组表达的核酸，其包含来源于乳球菌(Lactococcus)并且用作启动子的序列。本发明还涉及包含所述核酸的载体和用其转化的宿主细胞。本发明也包括包含所述核酸或载体的宿主细胞用于表达异源或同源蛋白质的用途；以及用于所述蛋白质至受试者的递送，特别地治疗性递送的用途。

背景技术：
乳酸菌(lactic acid bacteria)作为用于异源多肽的体外重组表达(例如，US 5,559,007)和用于抗原和/或治疗相关多肽的体内或原位表达以及递送(例如，WO 97/14806)的宿主正日益变得重要。
乳酸菌，特别地乳球菌被认为是GRAS微生物(即，公认为安全的)，从而可相对容易地施用至人和动物。
然而，在乳酸菌中实现高水平的异源表达通常需要导入对于这些细菌是外源的启动子或其他序列(例如，参见Wells等人，1993A)，从而可削弱其GRAS概念(perception)。
因此，存在对提供来源于乳酸菌，更优选来自乳球菌的另外的启动子的需要，所述启动子可有利地用于在其中表达蛋白质，优选表达异源蛋白质。
还需要这样的启动子，所述启动子可实现高表达水平以在工业和/或治疗环境中获得充足量的如是表达的蛋白质。
发明概述 本发明的方面致力于至少一些，例如，一个或多个本领域的上述需要。
特别地，本发明者认识到，来源于乳球菌的核酸和核酸序列可有利地用作用于在宿主细胞优选细菌，更优选乳球菌中的重组表达，例如优选多肽的表达的另外的启动子。
更具体地，本发明者展示和成功地鉴定了来自乳球菌的核酸和核酸序列，其可用作用于在宿主细胞，优选细菌，更优选乳球菌中的重组表达，例如优选多肽的表达的强启动子，即实现高水平表达的启动子。强表达可有利地增加由宿主细胞重组产生的表达产物例如多肽的量，使得所述表达产物可用于进一步的应用，例如从宿主细胞的纯化或通过宿主细胞进行的治疗性递送。
更令人惊讶地，本发明者认识到本发明的核酸和核酸序列可用作启动子，特别地当所述启动子用于乳球菌中时，其甚至比之前的来源于乳球菌的启动子更强。更特别地，本发明的核酸和序列可这样用作甚至比乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的胸苷酸合酶基因(thyA)的启动子(就本发明者所知，其是迄今为止最强的乳球菌来源的启动子，更明确地最强的组成型乳球菌来源的启动子)更强的启动子，例如甚至更强的组成型启动子。乳酸乳球菌的thyA启动子，就本发明者所知，也是目前已知的用于乳球菌，优选乳酸乳球菌中的重组例如异源基因表达的最强启动子。
令人惊讶地，实施例中概述的组合转录组(transcriptome)分析和复杂的蛋白质组学数据不擅长于揭示候选启动子的强度或活性。特别地，当检测时，一些已鉴定的启动子只有微弱的活性。此外，一些潜在的启动子序列在处于天然环境或天然构型之外即当用异源基因检测时不具有活性。
作为额外的有利方面，使用本发明的启动子尤其对于作为优选靶的人IL-10、人肽YY(PYY)、人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、人GLP-2(GLP-2)和人三叶因子(TTF)观察到特别高的表达。
还应当认识到，由本发明者鉴定的核酸和核酸序列来源于乳球菌，其已被确定为GRAS微生物(即，“公认为安全的”)。因此，可对人和动物施用包含此类启动子的组合物例如宿主细胞，而与当导入来源于例如非GRAS微生物或其他来源的序列时相比，较少考虑生物安全性。
因此，本发明提供了有利的乳球菌来源的(即同样安全的)核酸和序列，其构成用于众多应用(包括宿主细胞中，优选细菌中，更优选乳球菌中的重组表达，例如多肽的重组表达)的另外的启动子，更优选另外的强启动子，更优选比thyA启动子更强的启动子。
本发明将上述相关认识整合于其不同方面中。
因此，在一个方面，本发明提供了包含与一个或多个对于启动子(P)是异源的开放阅读框有效连接的启动子(P)的重组核酸，所述启动子是来自乳球菌属物种的天然启动子或其功能变体或功能片段，所述核酸特征在于启动子(P)在乳球菌中比乳酸乳球菌的胸苷酸合酶基因(thyA)的启动子更强。
与之相关的，因而本发明还提供了重组核酸，其包含与一个或多个对于启动子(P)是异源的开放阅读框有效连接的启动子(P)，其中启动子(P)选自乳球菌的基因1)DNA-指导的RNA聚合酶、β′亚基/160kD亚基(rpoC)、2)DNA-指导的RNA聚合酶、β亚基/140kD亚基(rpb2)、3)结合DNA的铁蛋白样蛋白(氧化损伤的保护剂)(dps)、4)丙酮酸激酶(pyk)、5)谷氨酰-和谷氨酰胺酰-tRNA合成酶(glns)、6)烯醇化酶(eno)、7)谷氨酰胺合成酶(glnA)、8)HTH-型转录调节剂(transcriptional regulator)(glnR)、9)Xaa-His二肽酶(argE或pepV)、10)F0F1-型ATP合酶β亚基(ATP合酶F1β亚基)(atpD)、11)3-磷酸甘油酸酯激酶(pgk)、12)甘油醛-3-磷酸脱氢酶/赤藓糖-4-磷酸脱氢酶(gapA)、13)乙酸激酶(ackA)、14)3-氧酰基(酰基载体蛋白)合酶(fabB)、15)3-氧酰基(酰基载体蛋白)还原酶(fabG)、16)DNA-指导的RNA聚合酶、α亚基/40kD亚基(rpoA)、17)Xaa-Pro氨基肽酶(pepP)、18)果糖/塔格糖二磷酸醛缩酶(tbp)、19)核糖体蛋白S4(rpsD)、20)超氧化物歧化酶(sodA)、21)核糖体蛋白S12(rpsL)和核糖体蛋白S7(rpsG)、22)核糖体蛋白L18(rplR)和核糖体蛋白S5(rpsE)和核糖体蛋白L30/L7E(rpmD)、23)S-核糖基高半胱氨酸裂解酶(luxS)、24)核糖体蛋白L19(rplS)、25)核糖体蛋白S11(rpsK)、26)核糖体蛋白L10(rplJ)、27)核糖体蛋白L7/L12(rplL)、28)细菌类核DNA结合蛋白/DNA结合蛋白HU(hup)、29)50S核糖体蛋白L28(rpmB)、30)磷酸转移酶系统纤维二糖特异性组分IIB(lacE)、31)F0F1-型ATP合酶α亚基(atpA)、32)ABC型糖运输系统(ATP酶组分)(malK)、33)3-羟基丁酮脱氢酶(acetoindehydrogenase)复合物E1组分α亚基(acoA)、34)细胞分裂蛋白(difIVA或ftsA)、35)吡喃型UDP-半乳糖变位酶(glf)、36)谷氨酰基氨基肽酶(frvX)、37)预测的脱氢酶相关蛋白(mviM)、38)核糖体蛋白S2、39)翻译起始因子3(IF-3)(infC)、40)核糖体蛋白L4(rplD)和核糖体蛋白L23(rplW)和核糖体蛋白L2(rplB)、41)EMAP结构域(ydjD)、42)转录延伸因子(greA)、43)ATP-依赖性Clp蛋白酶的蛋白酶亚基(clpP)、44)核糖体蛋白L15(rplO)、45)核糖体蛋白L11(rplK)、46)核糖体蛋白S8(rpsH)、47)核糖体蛋白L21(rplU)、48)核糖体蛋白S13(rpsM)、49)核糖体蛋白S19(rpsS)和核糖体蛋白L22(rplU)和核糖体蛋白L16(rplP)和核糖体蛋白L14(rplN)、50)核糖体蛋白S10(rpsJ)、51)辅伴侣蛋白(co-chaperonin)GroES(Hsp10)(cpn10)、52)核糖体蛋白L24(rplX)和53)假定的蛋白LACR_0137(duf965)的天然启动子，和所述天然启动子的功能变体和功能片段。
本发明提供了重组核酸，其中启动子(P)选自乳球菌，优选乳酸乳球菌的基因1)DNA-指导的RNA聚合酶，β′亚基/160kD亚基(rpoC)、3)非血红素铁结合铁蛋白(spsA)、4)丙酮酸激酶(pyk)、5)谷氨酰胺酰-tRNA合成酶(gltX)、6)磷酸丙酮酸水合酶(eno)、9)二肽酶PepV(pepV)、12)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapB)、13)乙酸激酶(ackA)、18)果糖二磷酸醛缩酶(fbaA)、20)超氧化物歧化酶(sodA)、21)核糖体蛋白S12(rpsL)和核糖体蛋白S7(rpsG)、22)核糖体蛋白L18(rplR)和核糖体蛋白S5(rpsE)和核糖体蛋白L30/L7E(rpmD)、24)核糖体蛋白L19(rplS)、26)核糖体蛋白L10(rplJ)、28)HU-样DNA-结合蛋白(hllA)、29)50S核糖体蛋白L28(rpmB)、30)磷酸转移酶系统IIB组分(ptcB)、31)F0F1-型ATP合酶α亚基(atpA)、32)多重糖结合转运ATP结合蛋白(multiple sugar-binding transportATP-binding protein)(msmK)、33)丙酮酸脱氢酶E1组分α亚基(pdhA)、34)细胞分裂蛋白(difIVA或ftsA)、35)吡喃型UDP-半乳糖变位酶(glf1)、36)谷氨酰基氨基肽酶(pepA)、37)预测的脱氢酶相关蛋白(11mg 0272)、38)核糖体蛋白S2(rpsB)、39)翻译起始因子3(IF-3)(infC)、40)核糖体蛋白L4(rplD)和核糖体蛋白L23(rplW)和核糖体蛋白L2(rplB)、41)苯丙氨酰-tRNA合成酶β链(pheT)、42)转录延伸因子GreA(greA)、43)ATP-依赖性Clp蛋白酶的蛋白水解亚基(clpP)、44)核糖体蛋白L15(rplO)、45)核糖体蛋白L11(rplK)、46)核糖体蛋白S8(rpsH)、47)核糖体蛋白L21(rplU)、48)核糖体蛋白S13(rpsM)、49)核糖体蛋白S19(rpsS)和核糖体蛋白L22(rplU)和核糖体蛋白L16(rplP)和核糖体蛋白L14(rplN)、50)核糖体蛋白S10(rpsJ)、51)辅伴侣蛋白GroES(Hsp10)(groES)、52)核糖体蛋白L24(rplX)和53)假定的霍利迪连结体解离酶(putative holidayjunction resolvase)(11mg_0151)的天然启动子，和所述天然启动子的功能变体和功能片段。
在更优选实施方案中，本发明提供了重组核酸，其中启动子(P)选自乳球菌，优选乳酸乳球菌的基因1)DNA-指导的RNA聚合酶，β′亚基/160kD亚基(rpoC)、3)非血红素铁结合铁蛋白(dpsA)、4)丙酮酸激酶(pyk)、5)谷氨酰胺酰-tRNA合成酶(gltX)、6)磷酸丙酮酸水合酶(eno)、9)二肽酶PepV(pepV)、12)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapB)、13)乙酸激酶(ackA)、18)果糖二磷酸醛缩酶(fbaA)、20)超氧化物歧化酶(sodA)、21)核糖体蛋白S12(rpsL)和核糖体蛋白S7(rpsG)、22)核糖体蛋白L18(rplR)和核糖体蛋白S5(rpsE)和核糖体蛋白L30/L7E(rpmD)、24)核糖体蛋白L19(rplS)、26)核糖体蛋白L10(rplJ)、28)HU-样DNA-结合蛋白(hllA)、29)50S核糖体蛋白L28(rpmB)、30)磷酸转移酶系统IIB组分(ptcB)的天然启动子，如表1中所定义的。
在另外的优选实施方案中，本发明提供了包含与一个或多个对于启动子是异源的开放阅读框有效连接的启动子28)细菌类核DNA结合蛋白/HU样DNA结合蛋白(hlla或hup)的重组核酸。更优选，所述启动子是PhllA启动子。
在另外的优选实施方案中，本发明提供了分别包含启动子3)非血红素铁结合铁蛋白(dpsA或LACR_2311)、启动子9)二肽酶PepV(pepV或LACR_0908)或启动子20)超氧化物歧化酶(sodA或LACR_0458)的重组核酸，所述启动子与一个或多个对于该启动子是异源的开放阅读框有效连接。更优选，所述启动子是PdpsA、PpepV或PsodA启动子。
在优选选择中，本发明提供了包含与一个或多个对于启动子(P)是异源的开放阅读框有效连接的启动子(P)的重组核酸，其中启动子(P)选自上述1)至30)或表1中所列的乳球菌的基因的天然启动子，优选PhllA、PdpsA、PpepV或PsodA启动子，以及所述天然启动子的功能变体和功能片段。
在另外的优选实施方案中，上述基因和各自的天然启动子以及其功能变体和功能片段来源于乳酸乳球菌。
在相关示例性方面中，还提供了包含本发明的重组核酸的载体；经染色体整合的表达盒、用本发明的重组核酸或用包含该重组核酸的载体转化的宿主细胞；本发明的重组核酸用于在宿主细胞中获得由所述开放阅读框编码的表达产物，优选一种或多种多肽的表达的用途；使用所述宿主细胞重组表达和分离目的表达产物，优选多肽的方法；治疗方法，其包括通过此类宿主细胞将治疗相关表达产物，优选多肽例如抗原和/或非疫苗原性(non-vaccinogenic)治疗活性多肽原位递送至人或动物；和宿主细胞用于制备促进所述递送的药剂的相关用途；包含所述宿主细胞的药物组合物；等。
本发明的这些和另外的方面和优选实施方案描述于下列部分和所附的权利要求中。
附图概述

图1(A-H)举例说明优选的启动子序列。
图2举例说明乳酸乳球菌MG1363多肽的电泳分离。
图3举例说明克隆策略。
图4启动子-Usp45-h[Gly2]GLP2融合物的亚克隆。P代表下列启动子的任一个P1(Waterfield，等人1995)、PthyA(胸苷酸合酶启动子)和PhllA(细菌类核DNA结合蛋白/DNA结合蛋白HU的启动子)；usp45代表野生型usp45分泌信号(van Asseldonk，等人1990)或其突变体，包括其中位点4上的赖氨酸被天冬酰胺置换的Usp45 N4；Em代表红霉素(erythromycin)选择标记；ori代表复制起始区。
图5由抗hGLP2抗体显示的通过重组乳酸乳球菌株系进行的h[Gly2]GLP-2的产生和分泌。(A)h[Gly2]GLP-2的分泌。将1μg重组hGLP-2作为阳性对照上样。(B)h[Gly2]GLP-2的细胞产生和分泌。印迹上的各泳道代表在3小时的培养后获得的1ml乳酸乳球菌细胞级分或培养上清液。

Plus2(Invitrogen)用作分子量标记(MW)。
图6用于本研究的乳酸乳球菌MG1363和不同的hIL-10表达株系的示意性比较。在构建过程中，hIL-10表达盒通过分别在thyA和hIL-10表达盒的上游及下游的同一序列上同源重组而整合在乳酸乳球菌MG1363染色体中。重组点以\示意性表示。这使得对于上述株系，表达盒外的所有DNA序列都是同一的。基因元件(Genetic element)未按规定比例绘制。
图7从PthyA(胸苷酸合酶启动子，株系sAGX0005和Thy12)进行的hIL-10表达与从(A)PdpsA启动子(DNA结合铁蛋白样蛋白，SEQ IDNO3，sAGX0012)、(B)PpepV(Xaa-His二肽酶启动子SEQ ID NO9或158，株系sAGX0018)、(C)PsodA(超氧化物歧化酶启动子，SEQ IDNO20，sAGX0029)和(D)PhllA(细菌类核DNA-结合蛋白/DNA结合蛋白HU的启动子；SEQ ID NO28，株系sAGX0037)进行的hIL-10表达的比较。“启动子”表示在hIL-10基因之前的启动子。
图8每109个MG1363、sAGX0005和sAGX0037细胞的hIL-10表达的比较。
图9用于本研究的乳酸乳球菌MG1363和不同的hTFF表达株系的示意性比较。在构建过程中，TFF表达盒通过分别在thyA和TFF表达盒的上游及下游的同一序列上同源重组而整合在乳酸乳球菌MG1363的染色体中。重组点以\示意性表示。这使得对于上述株系，表达盒外的所有DNA序列是同一的。突变体usp45以★标示。基因元件未按规定的比例绘制。
图10 (A)从与野生型(wt)usp45分泌信号和hTFF1连接的PthyA(胸苷酸合酶启动子)(株系sAGX0041)、与突变体(mut)usp45分泌信号和hTFF1连接的PhllA(细菌类核DNA结合蛋白/DNA结合蛋白HU的启动子；SEQ ID NO28)(株系sAGX0049)或与wt usp45分泌信号和hTFF1连接的PhllA(株系sAGX0048)进行的hTFF1表达的比较 (B)从与wt usp45分泌信号和hTFF3连接的PthyA(胸苷酸合酶启动子)(株系sAGX0043)、与wt usp45分泌信号和hTFF3连接的PdpsA启动子(DNA-结合铁蛋白样蛋白，SEQ ID NO3)(sAGX0059)和与mutusp45分泌信号和hTFF3连接的PhllA(株系sAGX0057)进行的hTFF3表达的比较。
“启动子”和“分泌信号”表示在TFF基因之前的启动子和分泌信号。
图11不同的指定的株系的上清液的Western印迹分析。包含参照蛋白质的泳道用“hTFF1”(参照hTFF1)和“MWM”(分子量标记，分子量以“kDa”表示)标示。所有其他泳道包含等量的0.5ml如上所述收获的指定的株系的培养上清液。一抗是小鼠单克隆抗-hTFF11/1000(Abnovacat#H00007031-M02)。二抗是山羊抗小鼠-AP1/1000(Southern Biotech4050-04)并且使用NBT/BCIP(Roche 11697 471 0001)进行检测。MWM是Invitrogen SeeBlue plus2预染的标准(cat#LC5925)。
图12用于本研究的pT1NX和不同hPYY G9(3-36)表达质粒的结构的示意性概述。通过将各自的表达盒作为EcoRI-SpeI片段插入EcoRI-SpeI打开的pT1NX来获得表达质粒pAGX0211、pAGX0212和pAGX0213。这样，表达盒外的所有DNA序列的结构和位置例如复制起始区(ori)和红霉素抗性标记(EmR)对于所有质粒都是相同的。基因元件未按照规定的比例绘制。
图13从与usp45分泌信号和hPYY G9(3-36)连接的P1(Waterfield等人1995)(质粒pAGX0211)、PthyA(胸苷酸合酶启动子，质粒pAGX0212)和PhllA(细菌类核DNA-结合蛋白/DNA结合蛋白HU的启动子；SEQ ID NO28，质粒pAGX0213)进行的hPYY G9(3-36)表达的比较。所有质粒存在于乳酸乳球菌MG1363中。“启动子”表示位于hPYY G9(3-36)基因上游或存在于pT1NX的等同位置上的启动子。
图14用于本研究的pT1NX和不同hGLP-1 G8(7-36)表达质粒的结构的示意性概述。通过将各自的表达盒作为EcoRI-SpeI片段插入EcoRI-SpeI打开的pT1NX来获得表达质粒pAGX0233和pAGX0234。这样，表达盒外的所有DNA序列的结构和位置，例如复制起始区(ori)和红霉素抗性标记(EmR)对于所有质粒都是相同的。基因元件未按规定的比例绘制。
图15从与usp45分泌信号和hGLP-1 G8(7-36)连接的P1(Waterfield等人1995)(质粒pAGX0211)、PthyA(胸苷酸合酶启动子，质粒pAGX0212)和PhllA(细菌类核DNA-结合蛋白/DNA结合蛋白HU的启动子；SEQ ID NO28，质粒pAGX0213)进行的hGLP-1 G8(7-36)表达的比较。所有质粒存于乳酸乳球菌MG1363中。“启动子”表示位于hGLP-1 G8(7-36)基因上游或存在于pT1NX的等同位置上的启动子。
图16用于本研究中的乳酸乳球菌MG1363和不同的hIL-10表达株系的示意性比较。在构建过程中，hIL-10表达盒通过分别在thyA和hIL-10表达盒的上游及下游的同一序列上同源重组而整合在乳酸乳球菌MG1363染色体中。重组点以\示意性表示。这使得对于上述株系，表达盒外的所有DNA序列都是同一的。此处“启动子”是任一个存在于株系“sAGX00xx”中的启动子(表11)。基因元件未按规定的比例绘制。
图17从PthyA(胸苷酸合酶启动子，株系sAGX0005)进行的hIL-10表达与从系列株系(参见图16和表11)的任一个(其中这些乳球菌启动子置于usp45-hIL-10融合基因的上游)进行的hIL-10表达的比较。
发明详述 如本文中所使用的，除非上下文明确地另外指出，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括单数和复数指代物。例如，“细胞”表示一个或多个细胞。
本文中使用的术语“包括(comprises)”、“包含(comprising)”和“由......组成(comprised of)”与“包括(including)”、“包含(includes)”或“含有(containing)”、“包含(contains)”的意义相同，并且是包括界限的或末端未封闭的，并且不排除另外的、未引述的成员、元素或方法步骤。
由端点引述的数字范围包括该范围内包括的所有数字和部分以及引述的端点。
本文中使用的术语“大约”，当指可测量的值例如参数、量、持续时间(temporal duration)等时，是指包括与给定值+/-20％或更少，优选+/-10％或更少，更优选+/-5％或更少，更优选+/-1％或更少，和更优选+/-0.1％或更少的差异，只要该差异适合于进行所公开的发明。
本说明书中引用的所有资料以其全文通过引用合并入本文。特别地，本文中明确提及的所有资料的教导通过引用合并入本文。
除非另外定义，用于公开本发明的所有术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义。通过进一步指导，进行下列定义以更好地理解本发明的教导。
本文中使用的术语“核酸”是指本质上由核苷酸例如脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸组成的任何长度的聚合物。核酸可包括嘌呤和/或嘧啶碱基和/或其他天然的(例如，黄嘌呤、肌苷、次黄嘌呤)、化学或生物化学修饰的(例如，甲基化的)、非天然的或衍生的核苷酸碱基。核酸的主链可包含糖和磷酸基团，这通常可见于RNA或DNA，和/或一种或多种经修饰的或取代的糖和/或一种或多种经修饰的或取代的磷酸基团。术语“核酸”优选还包括DNA、RNA和DNA/RNA杂交分子，特别地包括hnRNA、pre-mRNA、mRNA、cDNA、基因组DNA、扩增产物、寡核苷酸和合成的(例如化学合成的)DNA、RNA或DNA/RNA杂交物。“核酸”可以是双链的，部分双链的或单链的。当为单链时，核酸可以是有义链或反义链。此外，核酸可以是环形的或线性的。
在优选实施方案中，包含本发明的启动子的核酸是DNA或RNA，更优选DNA。
术语“重组核酸”通常是指使用重组DNA技术将区段连接在一起而组成的核酸。当重组核酸在宿主生物体中复制时，后代核酸也包括在术语“重组核酸”内。
阐明重组DNA技术的一般原理的标准参考著作包括MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，ed.Sambrook等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；Current Protocols in Molecular Biology，ed.Ausubel等人，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1992(定期更新)(″Ausubel等人1992″)；Innis等人，PCR ProtocolsAGuide to Methods and Applications，Academic PressSan Diego，1990。在例如Davis，B.D.等人，Microbiology，第3版，Harper &Row，publishers，Philadelphia，Pa.(1980)中阐明了微生物学的一般原理。
“启动子”通常是指核酸分子优选DNA分子上的RNA聚合酶结合并且起始转录的区域。启动子优选(但不是必须)位于其转录受该启动子控制的序列的上游，即5′。在本发明中，特定的启动子由术语“P”标示，后面跟着它们所来源的基因名称。例如，“PthyA”，其表示thyA基因的启动子，以及“PhllA”，其表示hllA基因的启动子。
术语“天然启动子”是指其核苷酸序列与天然存在，例如天然存在于细胞或生物中的启动子的序列同一的启动子。因而“天然启动子”涉及启动子的序列并且不被解释为要求以任何特定的方式获得或产生启动子。例如但不限于，该术语因而包括存在于它们的天然宿主中的启动子，从其分离的启动子、使用重组DNA技术克隆和扩增的启动子，通过扩增方法产生的或通过合成方法产生的启动子等，只要此类启动子的序列与它们的天然发生的对应物(counterpart)的序列相同(参见例如表1)。
本领域技术人员理解，给定的基因的启动子的天然序列在乳球菌属的不同物种之间和/或乳球菌属的单个物种内的不同亚种之间和/或乳球菌属的单个物种或亚种内的不同株系之间，由于所述物种、亚种和/或株系之间的天然遗传分化(genetic divergence)，而可能不相同。因此，这样的分化的但天然发现(found-in-nature)的启动子序列可认为是天然的。
本领域持术人员通常能够预测和鉴定天然细菌启动子，例如乳球菌的启动子。然而，为了提供更多的指导，通常可通过分析来自细菌优选来自乳球菌属物种的基因组序列或其部分；鉴定其中的开放阅读框，即，一连串始于翻译起始密码子(优选ATG)和终止于翻译终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)并且不包含任何内部的符合读框的翻译终止密码子的编码性核苷酸三联体；并且分析所述翻译起始密码子上游的序列以定位最上游的翻译起始密码子(在其上游存在符合读框的翻译终止密码子)来鉴定天然启动子。优选，这样鉴定的开放阅读框的转录可以例如通过Northern印迹或RT-PCR来进行实验验证；并且可使用例如cDNA末端的5′快速扩增法(5′-RACE)来估计转录起始位点(例如，邻近最上游和/或可能地一个或多个更下游的翻译起始密码子的)。
通常，5′邻近和接近最上游的翻译起始密码子(和/或，如果实验证据确实表明，一个或多个更下游的翻译起始密码子)的序列可包含负责转录所述ORF的天然启动子。通过优选实例，当翻译起始密码子的第一个核苷酸被指定为+1(例如，ATG密码子的A核苷酸是+1)并且紧接其5′的核苷酸被指定为-1，那么术语“天然启动子”可以是指从大约-500至大约+50，例如，从大约-500至大约+20，从大约-500至大约+10，从大约-500至大约+5，从大约-500至大约+2，或从大约-500至大约-1；优选从大约-400至大约+50，例如，在优选实例中，从大约-400至大约+20，例如，从大约-400至大约+10，从大约-400至大约+5，从大约-400至大约+2或从大约-400至大约-1；更优选从大约-300至大约+50，例如，在优选实例中，从大约-300至大约+20，例如，从大约-300至大约+10，从大约-300至大约+5，从大约-300至大约+2或从大约-300至大约-1；例如，在优选实例中，从大约-200至大约+50和在更优选实例中，从大约-200至大约+20，例如，从大约-200至大约+10，从大约-200至大约+5，从大约-200至大约+2或从大约-200至大约-1的序列；或例如，在其他优选实例中，从大约-100至大约+50和在另外的优选实例中，从大约-100至大约+20，例如，从大约-100至大约+10，从大约-100至大约+5，从大约-100至大约+2或从大约-100至大约-1的序列；只要所述序列展示启动子活性。
还涉及天然乳球菌启动子的功能变体在本发明的重组核酸中的用途。术语“变体”是指与相应的天然序列例如与相应的天然乳球菌启动子的序列大体上同一的(即，大部分但非完全同一的)序列。“大体上同一”是指至少60％，优选至少70％同一，更优选至少80％同一，例如至少85％同一，更优选至少90％同一，例如至少91％同一，92％同一，更优选至少93％同一，例如94％同一，更优选至少95％同一，例如至少96％同一，更优选至少97％同一，例如至少98％同一，和最优选至少99％同一。可以例如使用最初由Altschul等人(1990)描述的BasicLocal Alignment Search Tool(BLAST)例如由Tatusova和Madden(1999)描述的“Blast 2序列”算法进行序列的比对和序列同一性的测定。
还涉及天然乳球菌启动子的功能性片段在本发明的重组核酸中的用途。如本文中所使用的，术语“片段”是指与天然序列例如天然乳球菌启动子或其变体相比具有一个或多个核苷酸的5’和/或3’缺失，但其中片段的剩余核酸序列与天然乳球菌启动子或其变体的序列中的相应位置同一的序列。片段的剩余序列可代表优选至少30％，例如至少40％，更优选至少50％，例如至少60％，更优选至少70％，例如至少80％或至少85％，和更优选至少90％例如至少95％或更多的各自的天然乳球菌启动子或其变体的核酸序列，例如通过本发明的方法鉴定的，例如由表1的特定的SEQ ID NO提供的核酸序列。
关于上述启动子的变体和片段，术语“功能的”是指特定变体和片段具有至少部分保留的相应天然启动子的启动子活性，即结合RNA聚合酶并且起始转录的能力的事实。优选，这样的功能变体或功能片段可保留至少50％的相应天然启动子的活性，例如至少60％，更优选至少70％，例如至少80％，更优选至少85％，例如至少86％，至少87％，至少88％或89％，更优选至少90％，例如至少91％，至少92％，至少93％，至少94％和最优选至少95％，例如至少96％，至少97％，和非常优选至少98％或至少99％的相应的天然启动子的活性。也优选地，这样的功能变体或功能片段可具有比相应的天然启动子更高的活性。
本领域技术人员还可认识到，在实施方案中本发明的重组核酸甚至可包含多于一个本发明的启动子(P)和/或功能变体和/或功能片段。例如，可以是相同或不同的所述启动子、功能变体或功能片段可与所述重组核酸内的不同转录单位有效连接并且控制其表达。可选地或此外，单个转录单位的表达可由多于一个与其有效连接的可以是相同的或不同的启动子、功能变体和/或功能片段控制。例如，多于一个具有启动子活性的上述元件与单个转录单位的有效连接可进一步增加所述单位的转录水平。例如但不限于，可按顺序地例如在各自的转录单位的上游按顺序地排列这样的启动子、功能变体和/或功能片段。
可选地，本发明还涉及包含嵌合启动子(其含有两个或更多个来源于本发明的不同启动子、功能变体和/或功能片段的部分并且一起构成新型启动子)的重组核酸。
本领域技术人员知道评价启动子的活性的技术。例如，可将期望测定其作为启动子的活性的核酸序列插入重组报告基因构建体以使其与报告基因序列优选报告基因编码序列，例如，绿色荧光蛋白(GFP)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)等的编码序列有效连接，并且当将所述报告基因构建体导入目的宿主细胞或生物时，测定报告基因mRNA(例如，通过Northern印迹法、定量RT-PCR等)和/或蛋白质(例如，通过Western印迹法、ELISA、荧光或酶活性的测量等)的表达和/或积累。
在示例性优选实施方案中，可测量对于在其中测量表达的生物是异源的，例如对细菌是异源的，优选对于乳球菌是异源的，更优选对于乳酸乳球菌是异源的蛋白的表达。例如，在优选实施方案中，可使用本发明的核酸(如在本说明书中其他地方所描述的)评估编码真核生物来源的多肽的基因，更优选编码期望表达的治疗相关多肽(优选GLP-2、GLP-1、PYY和TFF，和更优选免疫调节多肽(immuno-modulatory polypeptide)、细胞因子、生长因子或白细胞介素例如非常优选hIL-10)的任何基因在细菌中，优选乳球菌中，更优选乳酸乳球菌中的表达。所测量的被测定的核酸序列的值表示这样的序列中包含的潜在的启动子的活性或强度。本领域技术人员还理解为了确保此类启动子活性测定的可比较的性质，除了被测定的核酸序列外的条件在不同测定之间都应当保持大致相同或理想地相同。此类条件可以包括，例如，导入细胞的报告基因构建体的量、所述导入使用的转化方法、此类报告基因构建体在被测定的受体细胞的基因组中整合的数目和位置和/或测量时受体宿主细胞的状态(例如，生长期，例如优选指数生长期)等。使用hIL-10作为表达的基因测量启动子在乳酸乳球菌受体细胞中的强度的示例性方法示于实施例2中。使用GLP2作为表达的基因测量启动子在乳酸乳球菌和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)受体细胞中的强度的另外的示例性方法示于实施例3和4。现使用GLP1、hPYY、hIL-10和TFF作为表达的基因测量启动子在乳酸乳球菌受体细胞中的强度的更多的示例性方法示于实施例5-9。使用干酪乳杆菌作为受体细胞的实验产生相似的结果(未描述)。
因此，据认为比另一个启动子(2)更强的启动子(1)将展示显著更高的活性，如通过合适的测定法例如前面段落中描述的测定法，例如实施例2至9中例举的测定法评价的。显著更高的活性是指对于启动子(1)的统计学上显著的更高活性的发现，例如，优选具有p＜0.5或p＜0.05。
启动子(1)的活性可以比启动子(2)的活性高任何程度，优选，启动子(1)的活性可以比启动(2)的活性高至少1％的启动子(2)的活性的值，例如高至少2％，至少3％或至少4％，更优选至少5％，例如，高至少6％，至少7％，至少8％或至少9％，更优选高至少10％，例如，高至少15％，更优选高至少20％，例如高至少30％或至少40％，更优选高至少50％，例如，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％，以及在另外的非常优选的实例中高至少100％，至少150％，至少200％，至少250％，至少300％，至少400％或至少500％的启动子(2)的活性的值；或在另外的非常优选的实例中，启动子(1)的活性可以比启动子(2)的活性高至少10倍，例如至少大约50倍，至少大约100倍，至少大约500倍或至少大约1000倍。
因此，为了获得启动子特别地本发明公开的启动子的功能变体或片段，本领域技术人员知道制备此类变体(例如，通过被靶向的或随机诱变)或片段(例如，通过5’和/或3’截断，例如通过限制性消化或PCR)和如上就它们的启动子活性测定此类变体或片段。然而，通过进一步的指导但非限定性地，要指出的是，细菌启动子通常包括邻近位点-10和-35的共有序列。因此，细菌例如乳球菌的启动子的功能片段可优选包含至少相应于天然启动子中的从大约-10至大约-35，更优选从大约-8至大约-40，更优选从大约-5至大约-40或从大约-5至大约-45，和更优选从大约-2或-1至大约-50的位置的序列。此外，细菌例如乳球菌的启动子功能变体可优选包含存在于天然对应物启动子中的或本领域内已知的邻近位点-10和-35的共有序列。
“有效连接”是其中将调控DNA序列与期望表达的DNA序列以允许表达的方式连接的连接。
例如，DNA序列例如优选启动子和异源开放阅读框，如果序列之间的连接的性质(1)不导致移码突变的导入，(2)不干扰启动子指导开放阅读框的转录的能力，或(3)不干扰开放阅读框通过启动子区域序列转录的能力，则被认为是有效连接的。
在示例性优选实施方案中，所述启动子可置于与其有效连接的开放阅读框的上游即5′。
表达所需要的调控区的精确性质可随生物的变化而变化，但通常将包含启动子区域，所述启动子区域，在原核生物中包含启动子(其指导RNA转录的起始)和DNA序列(所述DNA序列，当转录成RNA时，将发出起始蛋白质合成的信号)。这样的区域通常包括牵涉转录和翻译的起始的5′-非编码序列，例如Pribnow-框(参照TATA-框(TATA-box))、Shine-Dalgarno序列等。
有利地，通常与本发明的给定的启动子天然连接的各个翻译起始密码子可不包括在本发明的重组核酸中，以防止从该密码子的翻译起始。例如，可将启动子的3’末端在-1位点或其上游截断；可选地，可突变翻译起始密码子(例如，从ATG突变至不同的密码子)；等。然而可选地，所述天然翻译起始密码子可存在，并且还可能存在与给定的启动子天然连接的开放阅读框的数个(例如，优选≤20，更优选≤10，更优选≤5，例如至多1、2、3或4个)随后的密码子，并且目的异源开放阅读框可符合读框地与其融合，从而产生融合产物。
术语“开放阅读框”或ORF是指一连串编码性核苷酸三联体，其始于翻译起始密码子(优选ATG)和终止于翻译终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)并且不包含任何内部的符合读框的翻译终止密码子，并且潜在地能够编码多肽。因此，该术语可以与用于本领域内的“编码序列”同义。在本发明的重组核酸中，一个或多个ORF的翻译起始密码子通常可与控制翻译的起始的调控序列，例如与Shine-Dalgarno序列连接。还已知，在细菌包括乳球菌中，可通过将下游翻译起始密码子与控制该翻译起始的所述序列连接来产生包含两个或更多个由共同上游启动子控制的连续ORF的多顺反子单位。
术语“异源的”，当涉及给定的ORF和启动子之间的关系时，是指所述启动子在天然状态下通常不与所述ORF连接，即在天然状态下通常不控制其转录。换句话说，通过重组DNA技术在本发明的重组核酸中产生连接。
术语“乳球菌”通常是指乳球菌属并且包括在本领域内分类为属于该属的任何分类群(taxon)(例如，种、亚种、株系)。例如，乳球菌包括格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、乳酸乳球菌、鱼乳球菌(Lactococcus piscium)、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)和棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)和其任何亚种和株系。
在本发明的优选实施方案中，乳球菌是乳酸乳球菌。乳酸乳球菌包括但不限于乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis ssp.Cremoris)、乳酸乳球菌霍氏亚种(Lactococcus lactis ssp.Hordniae)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis ssp.Lactis)、Lactococcus lactis ssp.bv.Diacetylactis。
在本发明的另外的优选实施方案中，乳酸乳球菌是乳酸乳球菌乳脂亚种或乳酸乳球菌乳酸亚种，更优选乳酸乳球菌乳酸亚种，并且包括其任何株系，例如乳酸乳球菌乳脂亚种SK11或乳酸乳球菌乳酸亚种MG1363。
在优选实施方案中，启动子(P)来源于如上定义的乳球菌，更优选来自如上特别地前两段中定义的优选乳球菌分类群。
当启动子(P)在乳球菌中被认为比乳酸乳球菌thyA启动子更强时，这表示其在至少一种和潜在地在多于一种或在所有乳球菌分类群(例如，种、亚种或株系)中更强。优选，启动子(P)可在至少乳酸乳球菌中如此更强(so-stronger)。也优选地，启动子(P)可在至少乳酸乳球菌乳脂亚种和乳酸乳球菌乳酸亚种中，更优选在至少乳酸乳球菌乳酸亚种中如此更强。
术语“胸苷酸合酶”是指酶EC 2.1.1.45，“乳酸乳球菌的胸苷酸合酶(thyA)基因”是指在乳酸乳球菌中编码所述酶的基因。已描述了来自几个乳酸乳球菌分类群的thyA基因的序列，例如，来自乳酸乳球菌乳酸亚种MG1363(Ross等人，1990；Steidler等人，2003；Genbank登录号AF462070)、乳酸乳球菌乳酸亚种IL1403(Bolotin等人，2001；Genbank GeneID1115198)和乳酸乳球菌乳脂亚种SK11(Genbank登录号NC_008527，locus LACR_1631，Genome GeneID4434110)的thyA基因的序列。本领域技术人员能够鉴定和分离来自乳酸乳球菌的另外的分类群的thyA基因同源物。
thyA基因的启动子因而是指本文中定义的任何thyA基因的天然启动子。例如，给定的thyA启动子可以指相应的thyA基因的从大约-500至大约+50的核酸序列(+1表示给定的thyA基因的翻译起始密码子的第一个核苷酸)；和根据另外的优选实例从大约-500至大约+20，从大约-500至大约+10，从大约-500至大约+5，从大约-500至大约+2，或从大约-500至大约-1；从大约-400至大约+50，从大约-400至大约+20，从大约-400至大约+10，从大约-400至大约+5，从大约-400至大约+2或从大约-400至大约-1；从大约-300至大约+50，从大约-300至大约+20，从大约-300至大约+10，从大约-300至大约+5，从大约-300至大约+2或从大约-300至大约-1；从大约-200至大约+50，从大约-200至大约+20，从大约-200至大约+10，从大约-200至大约+5，从大约-200至大约+2或从大约-200至大约-1；或从大约-100至大约+50，从大约-100至大约+20，从大约-100至大约+10，从大约-100至大约+5，从大约-100至大约+2或从大约-100至大约-1的核酸序列；只要所述序列展示与天然状态下的thyA启动子大致相同和优选相同的强度。
优选，在本发明中用作参照的thyA启动子是来自乳酸乳球菌乳酸亚种MG1363的thyA基因的启动子，并且本发明的启动子比其强，如上所确定的。
在实施例2中描述的和基于Steidler等人2003(同上)的示例性测定中，乳酸乳球菌乳酸亚种MG1363的thyA启动子，当其以单拷贝整合在MG1363株系的thyA基因座中时，指导6.5ng/1×109个细菌的人IL-10的表达。因此，比thyA启动子更强的本发明的启动子可在所述测定中获得高于6.5ng/1×109个细菌，优选≥7ng/1×109个细菌，例如≥8ng/1×109或≥9ng/1×109个细菌，更优选≥10ng/1×109个细菌，例如≥11ng/1×109个细菌，≥12ng/1×109个细菌，≥13ng/1×109个细菌或≥14ng/1×109个细菌，更优选≥15ng/1×109个细菌，更优选≥20ng/1×109个细菌，例如≥25ng/1×109个细菌，≥30ng/1×109个细菌，≥35ng/1×109个细菌或≥40ng/1×109个细菌和最优选≥50ng/1×109个细菌或更高，例如≥100ng/1×109个细菌的hIL-10的表达；和在另外的非常优选实施方案中，获得≥200ng/1×109个细菌，例如≥500ng/1×109个细菌或≥1000ng/1×109个细菌或≥2000ng/1×109个细菌或≥5000ng/1×109个细菌的hIL-10的表达。
在实施例3和4中描述的另外的示例性测定中，干酪乳杆菌或MG1363株系包含pT1NX载体，其中乳酸乳球菌乳酸亚种MG1363的thyA启动子指导人GLP-2基因的表达。因此，本发明的启动子例如PhllA启动子比thyA启动子更强，当在对数期结束时收获等量的1ml培养物，装载在SDS-PAGE上，然后通过western印迹法分析时，通过本发明的启动子表达的GLP-2的量比通过thyA启动子的更高。另外的示例性测定法描述于实施例5至9中。
在相关实施方案中，本发明从而还提供了重组核酸，其包含与一个或多个对于启动子(P)是异源的开放阅读框例如GLP-2基因、hIL-10基因、GLP-1基因、hPYY基因或TTF基因有效连接的启动子(P)，其中启动子(P)选自概述部分中的1)至53)下所列的乳球菌的基因的天然启动子，优选所列的乳球菌的基因的天然启动子，其中启动子(P)选自下列基因的天然启动子1)DNA-指导的RNA聚合酶，β′亚基/160kD亚基(rpoC)、3)非血红素铁结合铁蛋白(dpsA)、4)丙酮酸激酶(pyk)、5)谷氨酰胺酰-tRNA合成酶(gltX)、6)磷酸丙酮酸水合酶(eno)、9)二肽酶PepV(pepV)、12)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapB)、13)乙酸激酶(ackA)、18)果糖二磷酸醛缩酶(fbaA)、20)超氧化物歧化酶(sodA)、21)核糖体蛋白S12(rpsL)和核糖体蛋白S7(rpsG)、22)核糖体蛋白L18(rplR)和核糖体蛋白S5(rpsE)和核糖体蛋白L30/L7E(rpmD)、24)核糖体蛋白L19(rplS)、26)核糖体蛋白L10(rplJ)、28)HU-样DNA-结合蛋白(hllA)、29)50S核糖体蛋白L28(rpmB)、30)磷酸转移酶系统IIB组分(ptcB)(如表1中1)至53)下定义的)，更优选在表1的1)、3)-6)、9)、12)、13)、18)、20)-22)、24)、26)和28)-30)下所列的启动子，更优选28)下所列的PhllA启动子、3)下所列的PdpsA启动子、9)下所列的PpepV启动子或20)下所列的PsodA启动子以及所述天然启动子的功能变体和功能片段。启动子(P)也优选地选自SEQ ID NO1、3至6、9、12、13、18、20至22、24、26、28至54、160、163至165、167、169、171至180中所示的核酸，以及所述天然启动子的功能变体和功能片段。
所述名称对于本领域技术人员来说是清楚的并且教导来自不同乳球菌分类群(例如，种、亚种和株系)例如上述的优选乳球菌分类群的特定基因。然而，依靠进一步的指导，下面的表1提及将所述基因标识为分离自乳酸乳球菌乳脂亚种SK11(SK11的全长基因组序列的Genbank登录号NC_008527)和乳酸亚种MG1363的唯一的基因I D编号。基因ID编号如Maglott等人2005描述的在NCBI的“Entrez Gene”数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgidb＝gene)中唯一地标识所述基因。在此基础上，本领域技术人员可从除了SK11和/或MG1363以外的乳球菌的另外的分类群例如本文中教导的优选物种、亚种和株系鉴定和分离所述基因的同源物。本文中使用的“同源物”是指来自两个或更多个不同分类群的由于起源于共同祖先而相似的(例如，优选，可以是如本文中所定义的大体上同一的)序列，特别地基因。来自SK11和/或MG1363的上述基因的同源物优选在其他乳球菌分类群中实现相同的功能。
根据本说明书的教导和使用本领域内的常识，本领域技术人员可鉴定和分离控制表1中所列的来自SK11和/或MG1363的基因或来自另外的乳球菌分类群的其同源物的表达的天然启动子(包括控制在多顺反子转录单位中发现的，从而可以不包含紧接它们的翻译起始密码子上游的启动子的基因的表达的启动子；例如SK11和/或MG1363中的情况就是这样，例如，对于rpsL-rpsG，rpsL的上游的启动子指导两者的转录；或对于rplR-rpsE-rpmD，rpsL上游的启动子指导所有的转录；或对rplD-rplW-rplB，rplD上游的启动子指导所有的转录；或对于rpsS-rplU-rplP-rplN，rpsS上游的启动子指导所有的转录；或对于rpsM，编码翻译起始因子1(IF-1)的上游基因infA上游的启动子指导rpsM的转录)。
在优选实施方案中，本发明提供了包含与一个或多个对于启动子(P)是异源的开放阅读框有效连接的启动子(P)的重组核酸，其中启动子(P)选自概述部分中1)至30)下所列的乳球菌的基因(即，表1中的前30个基因)的天然启动子，更优选在表1的1)、3)-6)、9)、12)、13)、18)、20)-22)、24)、26)和28)-30)下所列的启动子，更优选在28)下所列的PhllA启动子，在3)下所列的DNA结合铁蛋白样蛋白(氧化损伤保护剂)(dps)启动子，在9)下所列的Xaa-His二肽酶(argE或pepV)启动子或在20)下所列的超氧化物歧化酶(sodA)启动子以及所述天然启动子的功能变体和功能片段。
在优选实施方案中，本发明提供了包含与一个或多个对于启动子(P)是异源的开放阅读框有效连接的启动子(P)的重组核酸，其中启动子(P)选自SEQ ID NO1至54和157至180中所示的核酸以及其同源物，更优选SEQ ID NO1、3至6、9、12、13、18、20至22、24、26、28至54、160、163至165、167、169、171至180和所述天然启动子的功能变体和功能片段，更优选SEQ ID NO1、3至6、9、12、13、18、20至22、24、26、28至30、160、163至165、167、169和171和所述天然启动子的功能变体和功能片段，优选SEQ ID NO28、3、9、158和/或20和其功能变体和功能片段。
所述序列SEQ ID NO1至54和157至180代表示例性的(但非限制性的)与上述1)至53)下所列的基因(如在表1中更详细教导的)在乳酸乳球菌乳酸亚种MG1363和/或乳酸乳球菌乳脂亚种SK11中的表达相关的天然启动子。因此，这些启动子和其同源物(特别地来自除了MG1363和/或SK11以外的乳球菌分类群)以及其功能变体和功能衍生物可用于本发明的重组核酸以在宿主细胞，优选在细菌宿主细胞，更优选在乳球菌，更优选在乳酸乳球菌，更优选在乳酸乳球菌乳酸亚种例如在优选实例株系MG1363中进行有用的开放阅读框的表达。
在另外的优选实施方案中，启动子(P)选自SEQ ID NO1至54和157至180，更优选SEQ ID NO1、3至6、9、12、13、18、20至22、24、26、28至54、160、163至165、167、169、171至180，更优选SEQ ID NO1、3至6、9、12、13、18、20至22、24、26、28至30、160、163至165、167、169和171，最优选SEQ ID NO28、3、9、158和/或20中所示的核酸和其同源物、其功能变体和/或功能片段。
在另一个优选实施方案中，启动子(P)选自SEQ ID NO1至30和157至171，更优选SEQ ID NO28、3、9、158和/或20中所示的核酸和其功能变体和功能片段。
在另一个优选实施方案中，本发明的重组核酸还包含位于所述一个或多个开放阅读框的3′的转录终止子序列。例如，如果只存在一个开放阅读框，那么终止子序列可有利地位于其下游即3’。如果重组核酸包含两个或更多个ORF(例如，按顺序相连并且一起形成多顺反子转录单位)，则转录终止子可有利地位于最下游ORF的3’。
术语“转录终止子”是指位于转录单位的末端的发出转录终止信号的序列元件。优选，用于本发明的转录终止子将在期望与本发明的重组核酸一起使用的宿主细胞中例如细菌宿主细胞中，更优选乳球菌中，更优选乳酸乳球菌中发出终止转录的信号。用于鉴定和分离适当的终止子例如来自乳球菌的终止子的技术在本领域内是已知的(例如，参见van der Vossen等人，1985)，示例性终止子在本领域内也是已知的，例如，参见van der Vossen等人，(1992)等。
在另外的优选实施方案中，本发明的重组核酸还包括设计用于控制从启动子(P)的转录的操纵子。如本文中使用的，术语“操纵子”是指控制序列从启动子的转录的起始和/或维持的核苷酸序列，优选DNA序列。
通常，操纵子一般可置于启动子和其转录受该启动子控制的下游序列之间。通常，操纵子能够结合阻抑物多肽，由此其减少从所述启动子的转录。有用的阻抑物可在其中其结合操纵子的状态和其中其不结合操纵子的状态之间交替变化，并且这样的交替变化可有利地受外部条件例如外部物质或特定代谢物的控制。因此，在包含相容性阻抑物的宿主细胞中，将操纵子包含在本发明的核酸中可允许控制启动子的活性和从其的表达。示例性操纵子-阻抑物系统包括，例如，lac系统，也参见例如，Nauta等人(1996)，或组氨酸生物合成系统(参见，例如，Delorme等人，1999)。操纵子序列通常可来源于细菌染色体。
在另外的优选实施方案中，本发明的重组核酸还包含设计用于进行所述重组核酸至宿主细胞的基因组例如染色体内的插入的序列。
在特别优选的实施方案中，本发明的核酸至宿主细胞的基因组例如染色体内的特定位置的插入可通过同源重组来促进。例如，本发明的重组核酸可包含与宿主细胞的基因组例如染色体内的所述整合位置同源的一个或多个区域。所述基因组例如染色体位置上的序列可以是天然的，即，如天然发生的，或可以是通过之前的基因工程导入的外源序列。
例如，所述同源性区域可以为至少50bp，优选至少100bp，例如至少200bp，更优选至少300bp，例如至少400bp，更优选至少500bp，例如至少600bp或至少700bp，更优选至少800bp，例如，至少900bp或至少1000bp或更多。
在优选实施方案中，可包含两个同源性区域，每一个区域侧翼连接存在于本发明的核酸中的表达单位的一侧。这样的构型可有利地在宿主细胞中插入相关序列，即，实现目的开放阅读框从本发明的启动子表达的序列。进行同源重组(特别地在细菌宿主中)和选择重组体的方法在本领域内通常是已知的。示例性和优选方法是例如Steidler等人(2003)中的用于将外源序列导入乳球菌的thyA基因座的方法。
因此，在优选实施方案中，当整合入基因组，例如染色体，优选细菌染色体，更优选乳球菌染色体时，本发明还提供了重组核酸。可在用所述重组核酸或包含该核酸的载体转化的宿主细胞中获得这样的整合，如在本说明书中的其他地方所描述的。
在优选实施方案中，在本发明的核酸中与本发明的启动子连接的一个或多个开放阅读框编码多肽。
如可认识到的，本发明的本质主要关注新型启动子和它们的用途并且不以任何方式限制所述表达产物，优选多肽的性质。
然而，已报导包含受乳球菌启动子控制的开放阅读框的宿主细胞作为用于病毒、原核生物或真核生物来源的相关多肽，包括用于在人和动物中预防或治疗疾病的多肽的体外产生(参见，例如，US 5,559,007；Steidler等人，1995；Wells等人，1993B)和体内递送(参见，例如，WO 97/14806；WO 01/02570；Steidler等人，2003；Steidler等人，2000)的工具。
因此，在实施方案中，本发明的重组核酸的所述一个或多个开放阅读框可编码能够在受试者中，优选在人或动物受试者中引起治疗反应的表达产物，优选多肽。
在特别有用的示例性但非限定性实施方案中，本发明的重组核酸的所述一个或多个开放阅读框可编码抗原和/或非疫苗原性治疗活性多肽。
如本文中所使用的，术语“抗原”通常指引起免疫反应包括体液免疫和/或细胞免疫反应的并且能够结合免疫反应的产物例如抗体或T细胞的物质。因此，在优选实例中，抗原需要对其施用所述抗原的受试者的功能免疫系统(functioning immune system)以从该受试者引起生理反应。本发明的“抗原”还包括不在健康个体中引起免疫反应但在患有自身免疫性疾病(即生物不能将其自己的组成部分(向下至亚分子水平)识别为“自身”，这导致抗其自己的细胞和组织的免疫反应)的人中引发免疫反应的“自身抗原”。由这样的异常免疫反应引起的任何疾病称为自身免疫性疾病。因此，本发明的“抗原”还包括(生理活性)蛋白，该蛋白不在健康个体中引起免疫反应但在遗传上缺乏所述蛋白的人中引起免疫反应。此外，本发明的“抗原”还包括变应原，其不在健康个体中引起免疫反应但在患有变应性疾病的人中引起免疫反应。
根据本发明的抗原可来源于任何多肽(人或动物受试者中针对所述多肽的免疫反应具有治疗性用途)，所述多肽例如来自病原体，例如，来自病毒、原核(例如，细菌)或真核病原体，来自非生理蛋白质(例如，来源于癌组织的蛋白质)，来自变应原(例如，用于引起免疫耐受性)等。抗原还可以是蛋白质的代谢产物。例如，抗原可以是多糖、脂质或其他物质。此处描述的强启动子可驱动合成或装配所述多糖、脂质或其他物质的必需酶的表达。
术语“非疫苗原性治疗活性多肽”通常是指多肽，所述多肽在施用了其的人或动物受试者中不引起抗其本身的免疫反应并且能够获得治疗效果。因此，这样的多肽的治疗效果预期与其自己的天然生物学功能直接相关，由此其可在受试者的体内获得特定效果；而非通过在受试者中用作免疫原性和/或免疫保护性抗原来产生治疗效果。因此，非疫苗原性治疗活性多肽在以其表达形式存在时应当具有生物学活性或，至少，一从表达宿主细胞释放就必须转化成生物学活性形式。优选，所述多肽的这样的生物学活性形式可展示与其天然构型相同或极其类似的二级以及优选三级构象。
优选，非疫苗原性治疗活性多肽也是无毒的和非病原性的。
在优选实施方案中，非疫苗原性治疗活性多肽可来源于人或动物，并且可以优选相应于与将对其施用该多肽的人或动物受试者相同的分类群。
适当的非疫苗原性治疗活性多肽的非限定性实例包括能够局部或全身性起作用的多肽，例如其为能够施加影响局部或全身新成代谢的内分泌活性的多肽，和/或生物学活性多肽是能够调节属于免疫造血(immunohaemopoeitic)系统的细胞的活性的多肽，和/或一种或多种生物学活性多肽是能够在体内影响多种正常或赘生性细胞的成活力、生长和分化或影响免疫调控或影响对损伤和感染的急性期炎症应答的诱导的多肽，和/或一种或多种生物学活性多肽是能够增强或诱导对细胞和组织的感染(通过趋化因子作用于它们的靶细胞受体而介导的)的抗性或上皮细胞的增殖或创伤愈合的促进的多肽，和/或一种或多种生物学活性多肽在体内调控细胞表达或产生物质。
此类多肽的具体实例包括但不限于胰岛素、生长激素、催乳素、降钙素、黄体生成素(luteinising hormone)，甲状旁腺激素、促生长素抑制素、促甲状腺激素、血管活性肠肽(vasoactive intestinalpolypeptide)、细胞因子例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14至IL-32的任一个、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL、细胞因子的TNF家族例如TNFa、TNFb、CD40、CD27或FAS配体、细胞因子的IL-1家族、成纤维细胞生长因子家族、血小板源性生长因子、转化生长因子和神经生长因子、细胞因子的表皮生长因子家族、胰岛素相关细胞因子等。可选地，治疗活性多肽可以是上面定义的治疗活性多肽的受体或拮抗剂。可选地，治疗活性多肽可以是其中和抗体等。此类适当的多肽的另外的具体实例列于例如WO 96/11277，第14页，第1-30行，通过引用合并入本文；WO 97/14806，第12页，第1行至第13页第27行，通过引用合并入本文；或US 5,559,007，第8栏，第31行至第9栏，第9行，通过引用合并入本文。优选，适当的多肽是IL-10肽，例如人IL-10(hIL-10)，例如实施例2、5或9中所例举的。
在优选实施方案中，适当的多肽是三叶肽，例如TTF1、TTF2和/或TTF3。已在人中鉴定了该三叶肽家族的三个成员，其最初称为pS2(乳腺癌雌激素诱导型基因，Lefebvre，1993)、SP(解痉肽(spasmolytic peptide))和ITF(肠三叶因子)。在本命名法中pS2重命名为TFF1，SP重命名为TFF2以及ITF重命名为TFF3(参见例如Wong等人，1999)。该新命名法用于整个本说明书中。在人，小鼠和大鼠中TFF1和TFF2主要见于胃，而TFF3主要见于十二指肠和结肠。TFF1据认为通过细胞表面受体起作用(Tan等人，1997)。Wong等人(1999)提供了三叶肽的最新综述。该文章的内容通过引用合并入本公开内容。三叶肽通过上皮粘液细胞分泌并且在酸性环境中是稳定的。这些肽有助于粘膜的保护(在上皮上方形成凝胶)并且可能通过刺激上皮细胞迁移来参与损伤的粘膜的修复(Playford等人，1996)。三叶肽的产量在损伤例如胃溃疡和结肠炎发生的区域局部增加(Wright等人，1990)。Babyatsky等人(1996)已显示重组三叶肽的施用减少了这些位置的损伤。与对于粘膜的保护是重要的大多数其他蛋白质(例如表皮生长因子)不同，大多数研究已证明三叶肽引起极少的增殖或不引起增殖(Playford等人，1996)。
在另一个优选实施方案中，适当的多肽是PYY肽，例如人PYY(hPYY)，和更优选hPYY Gly9变体(3-36)，如实施例7中所例举的。
在另外的优选实施方案中，适当的多肽是胰高血糖素样肽-1(GLP-1或GLP1)，例如人GLP-1(hGLP-1)，和更优选hGLP-1甘氨酸8变体(7-36)，如实施例8中所例举的。在优选实施方案中，适当的多肽是胰高血糖素样肽-2(GLP-2或GLP2)。人胰高血糖素原基因(GenBank acc.nr.NM_002054)编码被切割成4个不同的成熟肽(包括胰高血糖素样肽-2(GLP-2))的前蛋白原。外部施用GLP-2在个体例如人中产生许多效应，包括肠生长、肠功能的增强、骨分解的减少和神经保护作用。GLP-2可以以内分泌物的方式起作用来将肠生长和代谢与营养物摄入连系起来。GLP-2和相关类似物可治疗短肠综合征、克罗恩病、骨质疏松症并且在癌症化疗过程中用作辅助疗法。优选，GLP-2基因适合于乳球菌例如乳酸乳球菌中的优选密码子选择(codonusage)。优选，该基因编码氨基酸序列HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。
在另一个优选实施方案中，基因编码在位点2上具有丙氨酸至甘氨酸的置换的成熟人GLP-2类似物，已显示其减少对由二肽基肽酶-IV产生的降解的易感性(Booth等人，2004)，例如该基因编码氨基酸序列HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。
在更优选实施方案中，GLP-2基因适合于乳球菌中的优选密码子选择并且包含在位点2上的丙氨酸至甘氨酸的置换，例如h[Gly2]GLP-2的核苷酸序列 CACGGTGATGGTTCATTTTCAGATGAAATGAACACTATCCTTGATAACCTTGCTGCTCGTGATTTTAT CAACTGGCTTATCCAAACTAAAATCACTGATTAA. 因此，在实施方案中，本发明的重组核酸编码抗原和/或非疫苗原性治疗活性多肽，其中所述抗原能够在人或动物受试者中引发免疫反应，优选保护性免疫反应，和/或所述非疫苗原性治疗活性多肽能够在人或动物受试者中产生治疗效果。
WO 97/14806还明确地公开了通过细菌进行的抗原与免疫反应刺激分子例如白细胞介素，例如IL-2或IL-6的共表达。因此，还涉及使用本发明的启动子进行的此类共表达。
在另外的优选实施方案中，根据本发明的开放阅读框还包含编码与由ORF编码的多肽同相的分泌信号的序列。这有利地允许表达的多肽序列从宿主细胞分泌，从而可促进例如分离或递送。
通常，分泌信号序列代表大约16至大约35个氨基酸的区段，其通常包含被包埋在脂双层膜中的疏水氨基酸，从而允许伴随的蛋白质或肽从宿主细胞分泌，并且其通常从该蛋白质或肽切除。优选，分泌信号序列可在意欲用于包含所述信号序列的核酸的宿主细胞，例如细菌宿主细胞，优选乳酸菌，更优选乳球菌，更优选乳酸乳球菌中具有这样的活性。
在适当的宿主细胞中具有活性的分泌信号序列在本领域内是已知的；示例性乳球菌信号序列包括usp45(参见，US 5,559,007)和其他基因的信号序列，参见，例如，Perez-Martinez等人(1992)；Sibakov等人(1991)。优选，信号序列位于启动子序列与ORF之间，即，信号序列位于启动子序列的3′之后和目的多肽的ORF之前。在优选实施方案中，信号序列编码氨基酸序列MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYA(usp45)。
本发明者令人惊讶地发现PhllA启动子与突变的usp45信号序列的组合导致目的多肽的进一步可控制的产生和分泌。特别地，突变体在位点4上包含天冬酰胺(N)而非赖氨酸(K)。在优选实施方案中，信号序列编码氨基酸序列MKKNIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYADTN。
在另外的优选实施方案中，本发明涉及本文中定义的重组核酸，其中所述重组核酸包含 (a)PdpsA，usp45和hIL-10(sAGX0012)；PdpsA，usp45N4和hIL-10； PpepV，usp45和hIL-10(sAGX0018)；PpepV，usp45N4和hIL-10； PsodA，usp45和hIL-10(sAGX0029)；PsodA，usp45N4和hIL-10； PhllA，usp45和hIL-10(sAGX0037)；PhllA，usp45N4和hIL-10； (b)PdpsA，usp45N4和hTFF1；PdpsA，usp45和hTFF1； PpepV，usp45N4和hTFF1；PpepV，usp45和hTFF1； PsodA，usp45N4和hTFF1；PsodA，usp45和hTFF1； PhllA，usp45N4和hTFF1(sAGX0048)；PhllA，usp45和hTFF1(sAGX0049)； (c)PdpsA，usp45N4和hTFF3；PdpsA，usp45和hTFF3(sAGX0048)； PpepV，usp45N4和hTFF3；PpepV，usp45和hTFF3； PsodA，usp45N4和hTFF3；PsodA，usp45和hTFF3； PhllA，usp45N4和hTFF3(sAGX0057)；PhllA，usp45和hTFF3； (d)PdpsA，usp45N4和hPYY；PdpsA，usp45和hPYY(sAGX0048)； PpepV，usp45N4和hPYY；PpepV，usp45和hPYY； PsodA，usp45N4和hPYY；PsodA，usp45和hPYY； PhllA，usp45N4和hPYY(sAGX0057)；PhllA，usp45和hPYY；PhllA，usp45和hPYY G9(3-36)(sAGX0213)； (e)PdpsA，usp45N4和GLP-1；PdpsA，usp45和GLP-1； PpepV，usp45N4和GLP-1；PpepV，usp45和GLP-1； PsodA，usp45N4和GLP-1；PsodA，usp45和GLP-1； PhllA，usp45N4和GLP-1；PhllA，usp45和GLP-1； (f)PdpsA，usp45N4和GLP-2；PdpsA，usp45和GLP-2； PpepV，usp45N4和GLP-2；PpepV，usp45和GLP-2； PsodA，usp45N4和GLP-2；PsodA，usp45和GLP-2； PhllA，usp45N4和GLP-2；或PhllA，usp45和GLP-2. 在另外的方面，本发明涉及包含本发明的重组核酸的载体。
如本文中使用的，“载体”是指可将核酸片段插入其并且进行克隆即扩增的核酸分子，通常为DNA。因此，载体通常包含一个或多个独特的限制性位点，并且可以能够在确定的宿主或媒介生物(vehicleorganism)中自主复制以使克隆的序列可复制。载体可包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体、噬菌体衍生的载体、PAC、BAC、线性核酸例如线性DNA等(适当时)(参见，例如，Sambrook等人，1989；Ausubel1992)。
在选择特定的载体例如质粒中重要的因素，尤其包括可从不包含载体的那些受体细胞中识别和选择包含载体的受体细胞的容易性；在特定宿主中期望的载体的拷贝数；以及是否期望能够使载体在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”。优选原核生物载体包括质粒例如能够在大肠杆菌(E.coli)中复制的质粒(例如，pBR322、ColE1、pSC101、pUC19等)。此类质粒描述于例如Sambrook等人，1989；Ausubel 1992。特别优选载体可以是能够在大肠杆菌(或其他革兰氏阴性细菌)以及在另一种目的宿主细胞例如在革兰氏阳性细菌，乳酸菌，优选乳球菌，更优选乳酸乳球菌中复制的载体(参见，例如，Kok等人(1984))。其他优选载体可以是能够在一种或多种革兰氏阳性细菌之间但不能在革兰氏阴性细菌中复制和/或穿梭的载体。在优选实施方案中，载体是如Steidler等人，(1998)(其明确地通过引用合并入本文)描述的pT1NX。
在另外的方面，本发明提供了用本发明的重组核酸和/或载体转化的宿主细胞。例如，这样的转化可用于扩增和维持所述核酸或载体。
可选地或此外，以及有利地，转化的宿主细胞将能够使用本发明的启动子转录本发明的核酸的开放阅读框和，优选地，表达由所述开放阅读框编码的表达产物，优选一种或多种多肽。
因此，在另外的方面，本发明提供了本发明的重组核酸或载体用于在宿主细胞中获得由所述开放阅读框编码的表达产物优选一种或多种多肽的表达的用途。优选，表达产物例如多肽对于所述宿主细胞可以是异源的，即外源性的。
优选，宿主细胞可以是原核细胞，例如，细菌细胞，更优选非病原性和/或非侵入性细菌，更优选革兰氏阳性细菌，更优选乳酸菌(例如，乳球菌属(Lactococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、片球菌属(Pediococcus spp.)、短杆菌属(Brevibacterium spp.)、丙酸杆菌属(Propionibacterium spp.)或双岐杆菌属(Bifidobacterium spp.))，非常优选乳球菌和最优选乳酸乳球菌，例如，如上定义的；只要本发明的启动子在所述宿主细胞中具有适当的活性。
本发明的重组核酸或载体可以以染色体外的形式存在于宿主细胞中，优选使用自己的复制起始区自主复制，或可以整合入细菌基因组DNA，例如细菌染色体，例如，乳球菌染色体。在后一种情况下，可整合单个或多个拷贝的所述核酸，优选整合单个拷贝；整合可发生在染色体的随机位置或，如上所述，在其预先确定的位置，优选在预先确定的位置，例如在优选非限定性实例中，在乳球菌例如乳酸乳球菌的thyA基因座中，例如如由Steidler等人，(2003)(其明确地通过引用合并入本文)所描述的。
因此，在另外的方面，本发明提供了包含本文中定义的重组核酸的宿主细胞，其中所述启动子(P)存在于所述宿主细胞的染色体中，以及其中所述启动子(P)与对于所述启动子(P)是异源的一个或多个开放阅读框有效连接，更优选，所述启动子(P)还包含信号序列，优选usp45或usp45N4，更优选所述启动子(P)还包含设计用于控制从所述启动子(P)的转录的操纵子，和更优选，启动子(P)选自SEQ ID NO1、3至6、9、12、13、18、20至22、24、26、28至54、160、163至165、167、169、171至180中所示的核酸和其同源物以及其功能变体和功能片段。
在另外的方面，本发明提供了本文中定义的宿主细胞，其中所述一个或多个开放阅读框编码能够在受试者，优选人或动物受试者中引起治疗性反应或免疫原性反应的多肽，优选所述一个或多个开放阅读框编码抗原和/或非疫苗原性治疗活性多肽，更优选所述抗原能够在人或动物受试者中引起免疫反应，优选免疫耐受反应，和/或所述非疫苗原性治疗活性多肽能够在人或动物受试者中产生治疗效果。在另外的优选方面，本发明提供了本文中定义的宿主细胞，其中所述非疫苗原性治疗活性多肽是hIL-10、GLP-2、GLP-1、TFF或hPYY。在另一个进一步优选的方面，本发明提供了本文中定义的宿主细胞，其中所述抗原能够在人或动物受试者中引起免疫反应和用作疫苗，和/或。
在另外的优选实施方案中，本发明涉及本文中定义的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含 (a)PdpsA，usp45和hIL-10(sAGX0012)；PdpsA，usp45N4和hIL-10； PpepV，usp45和hIL-10(sAGX0018)；PpepV，usp45N4和hIL-10； PsodA，usp45和hIL-10(sAGX0029)；PsodA，usp45N4和hIL-10； PhllA，usp45和hIL-10(sAGX0037)；PhllA，usp45N4和hIL-10； (b)PdpsA，usp45N4和hTFF1；PdpsA，usp45和hTFF1； PpepV，usp45N4和hTFF1；PpepV，usp45和hTFF1； PsodA，usp45N4和hTFF1；PsodA，usp45和hTFF1； PhllA，usp45N4和hTFF1(sAGX0048)；PhllA，usp45和hTFF1(sAGX0049)； (c)PdpsA，usp45N4和hTFF3；PdpsA，usp45和hTFF3(sAGX0048)； PpepV，usp45N4和hTFF3；PpepV，usp45和hTFF3； PsodA，usp45N4和hTFF3；PsodA，usp45和hTFF3； PhllA，usp45N4和hTFF3(sAGX0057)；PhllA，usp45和hTFF3； (d)PdpsA，usp45N4和hPYY；PdpsA，usp45和hPYY(sAGX0048)； PpepV，usp45N4和hPYY；PpepV，usp45和hPYY； PsodA，usp45N4和hPYY；PsodA，usp45和hPYY； PhllA，usp45N4和hPYY(sAGX0057)；PhllA，usp45和hPYY；PhllA，usp45和hPYY G9(3-36)(sAGX0213)； (e)PdpsA，usp45N4和GLP-1；PdpsA，usp45和GLP-1； PpepV，usp45N4和GLP-1；PpepV，usp45和GLP-1； PsodA，usp45N4和GLP-1；PsodA，usp45和GLP-1； PhllA，usp45N4和GLP-1；PhllA，usp45和GLP-1； (f)PdpsA，usp45N4和GLP-2；PdpsA，usp45和GLP-2； PpepV，usp45N4和GLP-2；PpepV，usp45和GLP-2； PsodA，usp45N4和GLP-2；PsodA，usp45和GLP-2； PhllA，usp45N4和GLP-2；或PhllA，usp45和GLP-2. 在另外的优选实施方案中，本发明涉及在另外的方面，本发明提供了用于目的表达产物，优选多肽的重组表达的方法，其包括 a)培养包含本发明的重组核酸或载体的宿主细胞，其中所述一个或多个开放阅读框编码目的表达产物，优选多肽，和 b)分离由所述培养物中的宿主细胞产生的目的表达产物，优选多肽。
本领域技术人员通常已知和还可最优化允许多肽在宿主细胞，优选本发明的宿主细胞中表达的培养条件，例如温度、必需营养物的存在和浓度、充氧、搅拌、接种等。
本领域技术人员还已知和可进一步最优化纯化技术以分离由所述宿主细胞表达的表达产物例如优选多肽。例如，蛋白质分离的适当技术可包括通过例如机械或酶促破坏细胞壁裂解宿主生物(例如，当多肽在细胞内积累时)，和除去细胞碎片，或收集上清液(例如，当多肽分泌时)，除去非蛋白质组分例如DNA和脂多糖、硫酸铵沉淀、尺寸排阻层析(例如以富集期望的蛋白质)、亲和层析等。
在另外的方面，本发明提供了用本发明的重组核酸和/或载体转化的宿主细胞用于制造药剂的用途，所述药剂用于将由所述重组核酸内包含的一个或多个开放阅读框编码的表达产物优选多肽递送至人或动物。
在相关方面，本发明提供了用于将由本发明的重组核酸内包含的一个或多个开放阅读框编码的多肽递送至需要其的人或动物的方法，该方法包括对所述人或动物施用治疗有效量的用所述本发明的核酸和/或载体转化的宿主细胞。动物可以优选是哺乳动物例如，驯养动物、农畜、动物园动物、体育动物、宠物和实验动物例如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、母牛；灵长类动物例如猿、猴子、猩猩和黑猩猩；犬科动物例如狗和狼；猫科动物例如猫、狮子和老虎；马科动物例如马、驴和斑马；食物动物例如牛、猪和绵羊；有蹄类动物例如鹿和长颈鹿；啮齿目动物例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等。
如本文中使用的，术语“治疗”或“医治”是指治疗性处理和预防性或防治性措施，其中目的是阻止或减慢(减少)不期望的生理变化或病症。“需要治疗的人或动物”包括可从给定的病状的治疗获得益处的人或动物。
术语“治疗有效量”是指有效地治疗受试者例如人或动物中的疾病或病症(即获得期望的局部或全身性效果和表现)的治疗物质或组合物的量。例如，细菌的治疗有效量可在例如单剂量或重复剂量中包含至少1个细菌，或至少10个细菌，或至少102个细菌，或至少103个细菌，或至少104个细菌，或至少105个细菌，或至少106个细菌，或至少107个细菌，或至少108个细菌，或至少109个，或至少1010个，或至少1011个，或至少1012个，或至少1013个，或至少1014个，或至少1015个或更多个宿主细胞，例如细菌。
本发明的宿主细胞可单独施用或可与一种或多种活性化合物一起施用。后者可在施用所述宿主细胞之前、之后或与之同时施用。
存在许多关于抗原和/或治疗活性多肽的递送的现有技术公开内容，并且将认识到用本发明的强启动子可进一步有利地对这样的公开内容进行改良。例如但不限于，用于治疗结肠炎的白细胞介素特别地IL-10的细菌递送(例如，参见WO 00/23471)、用作疫苗的抗原的递送(例如，WO 97/14806)、GLP-2和相关类似物的递送可用于治疗短肠病、克罗恩病、骨质疏松症以及在癌症化疗过程中用作辅助治疗等。此外，三叶肽的细菌递送可用于治疗消化道(alimentary canal)的疾病(参见，例如，WO 01/02570)。特别地，在WO 97/38712和WO 92/14837中描述了三叶蛋白或肽用于治疗消化道病症和对消化道(包括口、食管、胃以及大肠和小肠)的损伤以及用于保护和治疗存在于消化道外的组织的用途。此类蛋白质可用于治疗这些区域的损伤或抑制损伤的形成。这些损伤可由下列因素引起用于治疗癌症的放射治疗或或化学疗法、损伤消化道的任何其他药物包括酒精、对辐射或对腐蚀性物质的意外暴露、感染、消化病症(包括但不限于非溃疡性消化不良、胃炎、胃溃疡或十二指肠溃疡、胃癌、MALT淋巴瘤、Menetier’s综合征、胃-食管反流性疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎和化学、细菌或不明来源的急性结肠炎)。三叶肽对于治疗急性结肠炎特别有用。另外的治疗性应用涉及使用本发明的启动子和宿主细胞。
可通过递送根据本发明的治疗性多肽治疗的人或动物中的疾病的类型的另外的非限定性实例包括但不限于，例如，炎性肠疾病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎(可使用例如IL-lra或IL-10或三叶肽治疗)；自身免疫性疾病，包括但不限于银屑病、类风湿性关节炎、红斑狼疮(可使用例如IL-lra或IL-10或相关自身抗原治疗)；变应性疾病，包括但不限于哮喘、食物变态反应(可使用相关变应原治疗)；腹部疾病(可使用谷蛋白变应原治疗)；神经病症，包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森氏病和肌萎缩性(脊髓)侧索硬化(可使用例如脑衍生神经营养因子(brain devated neurotropic factor)和睫状神经营养因子(ciliary neurotropic factor)治疗)；癌症(可使用例如IL-1、集落刺激因子或干扰素-W治疗)；骨质疏松症(可使用例如转化生长因子f3治疗)；糖尿病(可使用例如胰岛素治疗)；心血管疾病(可使用例如组织纤溶酶原激活物治疗)；动脉粥样硬化(可使用例如细胞因子和细胞因子拮抗剂治疗)；血友病(可使用例如凝血因子治疗)；退行性肝病(degenerative liver disease)(可使用例如肝细胞生长因子或干扰素a治疗)；肺部疾病例如囊性纤维化(可使用例如α-抗胰蛋白酶治疗)；肥胖症；病原体感染，例如病毒或细菌感染(可使用许多上述组合物或抗原治疗)等。
技术人员将认识到，本文中明确列举的疾病只是示例性的并且它们的例举决非意欲限制本发明提供的试剂例如本发明的启动子、核酸、载体和宿主细胞对这些特定疾病的应用。相反，技术人员理解，本发明的试剂原则上可用于表达任何目的表达产物优选多肽，其可以不仅在例举的疾病中而且在人和动物的不同的另外的疾病或病状中具有治疗相关性。因此，一旦选择或确定用于给定的疾病的适当的表达产物，优选多肽例如抗原和/或非疫苗原性治疗活性多肽后，本领域技术人员将能够使用本发明的试剂获得其表达、分离和/或递送。
本发明还涉及治疗其他动物包括狗、马、猫和鸟的疾病。狗的疾病包括但不限于犬瘟热(副粘病毒)、犬肝炎(腺病毒Cav-1)、犬窝咳或喉气管炎(腺病毒Cav-2)、传染性犬肠炎(冠状病毒)和出血性肠炎(细小病毒)。
猫的疾病包括但不限于病毒性鼻气管炎(疱疹病毒)、猫卡里西病(feline caliciviral disease)(杯状病毒)、猫传染性腹膜炎(细小病毒)和猫白血病(猫白血病病毒)。马和鸟中的其他病毒性疾病也预期可使用本发明的方法和组合物治疗。为此目的，表达重组干扰素的微生物的使用将是特别优选的。
在另外的方面，本发明因而还提供了包含用本发明的核酸和/或载体转化的宿主细胞的药物组合物。
优选，这样的制剂包含治疗有效量的本发明的宿主细胞和药学上可接受的载体，即一种或多种药学上可接受的载体物质和/或添加剂，例如缓冲剂、载体、赋形剂、稳定剂等。
本文中使用的术语“药学上可接受的”与本领域使用的一致，并且指与药物组合物的其他组分相容并且对其受者无害。
可将本发明的重组宿主细胞悬浮于药物制剂中以用于对患有待治疗的疾病的人或动物施用。此类药物制剂包含但不限于活宿主细胞和适合施用的介质。可在常用赋形剂例如乳糖、其他糖、碱和/或碱土硬脂酸盐、碳酸盐和/或硫酸盐(例如，硬脂酸镁、碳酸钠和硫酸钠)、高岭土、硅土、调味剂(flavorant)和香料存在的情况下冷冻干燥重组宿主细胞。
可以以胶囊剂、片剂、颗粒剂和粉剂的形式制备这样冷冻干燥的宿主细胞，其各自通过口服途径施用。
可选地，可将一些重组细菌在适当的介质中制备为水性悬浮液，或可在即将使用之前在适当的介质中悬浮冻干的细菌，此类介质包括本文中提及的赋形剂和其他赋形剂例如葡萄糖、甘氨酸和糖精钠(sodium saccharinate)。
对于口服施用，可配制肠溶口服剂型(gastroresistant oraldosage form)，该剂型还可包含提供宿主细胞的控制释放的化合物，从而提供其中编码的期望的蛋白质的控制释放。例如，口服剂型(包括片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂)可用在胃中但不在肠中抗溶解或破裂的薄层赋形剂(通常为聚合物、纤维质衍生物和/或亲脂材料)包被，从而允许运输通过胃，有利于在肠中的分解、溶解和吸收。
口服剂型可经设计以允许宿主细胞和其重组蛋白的缓慢释放，例如设计为控制释放、持续释放、延长释放、持续作用的片剂或胶囊。此类剂型通常包含常规和熟知的赋形剂例如亲脂性赋形剂、聚合物赋形剂、纤维质赋形剂、不溶性赋形剂、可膨胀的赋形剂(swellableexcipient)。控制释放制剂还可用于任何其他递送位置，包括肠、结肠、生物粘附或舌下递送(即，牙齿粘膜递送)和支气管递送。当经直肠或阴道施用本发明的组合物时，药物制剂可包括栓剂和乳膏。在该情况下，将宿主细胞悬浮在还包含脂质的常用赋形剂的混合物中。上述制剂的每一种在本领域内都是熟知的并且描述于例如下列参考资料Hansel等人(1990)，Chien(1992)，Prescott等人(1989)和Cazzaniga等人(1994)。
优选，灌肠剂制剂可用于直肠施用。术语“灌肠剂”用于涵盖意欲用于直肠使用的液体制剂。灌肠剂通常可以在单剂量容器中提供并且包含一种或多种溶解或分散在水、甘油或聚乙二醇或其他合适的溶剂中的活性物质。
因此，根据本发明，在优选实施方案中，可通过任何一种可用于特定途径的本领域现有制剂通过粘膜例如口、鼻、直肠、阴道或支气管途径将编码期望的基因的重组宿主细胞施用给动物或人。用于施用的宿主细胞的剂量将视许多因素的变化而变化，所述因素包括细菌和由其编码的基因的类型、待治疗的疾病的类型和严重性以及将使用的施用途径。
因此，对于本发明的各个和每一个实施方案不能确定精确的剂量，但当采用本发明后，精确的剂量对于本领域技术人员来说是显而易见的。总之剂量可根据具体情况具体分析的方式，通过使用熟知的方法例如称为ELISA或Biacore(参见实施例)的方法，在施用预先确定数目的细胞后测量重组蛋白的血清水平浓度来确定。递送的重组蛋白质的动力学特征和半衰期的分析提供了足以允许确定经转化的宿主细胞的有效剂量范围的信息。
在实施方案中，当宿主细胞表达抗原时，本发明从而还可提供疫苗。
术语“疫苗”指这样的药学上可接受的组合物，当以有效量对动物或人受试者施用时，其能够诱导抗疫苗中包含的免疫原的抗体和/或在受试者中引起保护性免疫。
本发明的疫苗包含用本发明的核酸或载体转化的宿主细胞和另外任选地赋形剂。此类疫苗还可包含佐剂，即增强对抗原的免疫反应的化合物或组合物。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷(saponin)、矿物凝胶(mineral gel)例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronic polyols)、多聚阴离子、肽、油或碳氢化合物乳剂以及潜在有用的药学上可接受的人佐剂例如BCG(卡介苗(bacille Calmetle-Guerin))和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。
在另外的优选实施方案中，本发明涉及本文中定义的宿主细胞用于制造药剂的用途，所述药剂用于将由所述重组核酸的一个或多个开放阅读框编码的多肽递送至人或动物，优选所述多肽是上面定义的抗原和/或非疫苗原性治疗活性肽，优选hIL-10、GLP-2、GLP-1、TFF或hPYY。本发明还涉及包含本文中定义的宿主细胞的药物组合物。此外，本发明还涉及本文中定义的用作药剂的宿主细胞。
进一步用非限定性的实施例来举例说明本发明。
实施例 用于实施例的材料 GM17-按照厂商说明书制备的但不添加任何糖的M17肉汤(OxoidCM0817)。
-20％葡萄糖(Merck 1.08337)，通过过滤(Stericup-GV 0.22μmPVDF Millipore CGVU05RE)灭菌。
-GM17肉汤补充有0.5％的葡萄糖的M17。
GM17T为补充有200μM胸苷(Sigma#T9250)的GM17。
GM17E为GM17，补充有5μg/ml红霉素(Sigma#E6376)(通过从在96％乙醇原液中的25mg/ml红霉素稀释产生)。
BM9-10％酪胨(Difco 225930)，于121℃下高压灭菌15分钟。
-0.5M NaHCO3(Merck 1.06329)，通过过滤(Stericup-GV0.22μm PVDF Millipore CGVU05RE)灭菌。
-0.5M Na2CO3(Merck 1.06392)，通过过滤(Stericup-GV0.22μm PVDF Millipore CGVU05RE)灭菌。
-1M MgSO4(Merck 1.05886)，于121℃下高压灭菌15分钟。
-100mM CaCl2(Merck 1.02382)，于121℃下高压灭菌15分钟。
-10xM9盐(Difco 248510)，于121℃下高压灭菌15分钟。在无菌水中稀释10倍从而获得M9盐。
-10ml BM9以如下描述的相同的顺序加入不同的组分。
*1ml 10x M9盐 *500μl 10％酪胨 *250μl 20％葡萄糖 *7.75ml水 *500μl 0.5M NaHCO3 *500μl 0.5M Na2CO3 恰当地混合并且加入下列组分 *20μl 1M MgSO4 *10μl 100mM CaCl2 BM9T为补充有200μM胸苷(Sigma#T9250)的BM9 BM9E为BM9，补充有5μg/ml红霉素(Sigma#E6376)(通过从在96％乙醇原液中的25mg/ml红霉素稀释产生)。
ELISA IL10-BD OptEIA Human IL-10 ELISA试剂盒II；Cat N°550613；BD Biosciences；www.bdbiosciences.com TFF-1夹心ELISA -包被抗体TFF1小鼠单克隆抗体(M02)，克隆3H5(AbnovaCat N°H00007031-M02) -检测抗体多克隆兔抗-hTFF1(Alpha Diagnostics Cat N°TFF12-A；www.4adi.com) -缀合物抗兔-HRP(Southern Biotech Cat N°4050-05；www.southernbiotech.com) -底物TMB TFF-3夹心ELISA -包被抗体抗TFF-3的小鼠单克隆抗体4408(R&D SystemsCat N°MAB4408；www.rndsystems.co) -检测抗体内部的(in house)抗TFF-3的生物素化的小鼠单克隆15C6(Calbiochem Cat No°585350；www.calbiochem.com) -缀合物链霉抗生物素蛋白-HRP(Cat N°554066；BDBiosciences；www.bdbiosciences.com) -底物TMB PYY商品化试剂盒总肽YY(PYY)ELISA；Cat N°DSL-10-33600；Diagnostic System Laboratories，Inc.；www.dslabs.com GLP-1商品化试剂盒Glucagon-like Peptide-1(Active)ELISA试剂盒；Cat.N°EGLP-35K；Linco Research；www.millipore.com 实施例1来自乳酸乳球菌的强启动子的分离 使用Antelmann等人(2000)的方法在乳酸乳球菌乳酸亚种MG1363中鉴定了强表达的蛋白质。
简而言之，通过1D凝胶中的丰富的蛋白质点鉴定高表达的蛋白质(图2)。使用胰蛋白酶降解标示的蛋白质条带，在离子阱质谱仪(Esquire HCT，Bruker)中的LC-MS/MS模式中分析肽混合物。通过MASCOT利用来自乳酸乳球菌乳脂亚种sk11蛋白(Genbank NC_008527)的数据库分析光谱(每次运行只将250个MS/MS光谱用于数据分析)。以95％的概率鉴定具有高于同一性阈值评分(identity thresholdscore)的Mascot评分的肽。来源于相同蛋白质的肽越多，鉴定的可靠性越高。
该分析产生一系列高度丰富的蛋白质和相应的基因(上面的表1，和图1)。在此基础上，我们鉴定和分离了指定的基因上游的序列(SEQID NO1至54和157至180)和它们自己的Shine Dalgarno(SD)序列。对于大多数启动子，这可通过对乳酸乳球菌MG1363染色体DNA进行PCR来完成。例如，用于扩增相应于上面1)至30)下所列的基因的启动子的序列的引物示于表2中。同样，可基于可获得的关于相应于上述31)至53)下所列的基因的启动子的基因组信息选择适当的引物。也使用寡核苷酸(表3中的寡核苷酸)合成eno、tbp和lacE的启动子。
实施例2启动子的活性 设计允许在分泌型hIL-10基因之前亚克隆不同启动子(图3)的策略。以使hIL-10表达盒侧翼于靶序列的方式进行亚克隆。该结构使得能够围绕thyA基因进行双重同源重组，从而导致染色体整合，基本上如Steidler等人2003(同上)和WO 02/090551中所描述的。
示意性地，参考图3概述该策略 A)使用适当的引物，通过PCR从乳酸乳球菌MG1363染色体DNA分离启动子；B)通过退火PCR将启动子与相关侧翼区域(部分上游靶区域，部分hIL-10)连接；C和D)通过使用适当安置的限制性内切核酸酶位点(NcoI+Af1III或可选地NcoI+BstEII)将连接的产物亚克隆在有条件地非复制性质粒中。这完成了上游靶区域和hIL-10。E)通过连续的上游和下游重组将启动子构建体导入乳酸乳球菌MG1363。通过两步骤法进行染色体整合。在将非复制性质粒导入亲本株系乳酸乳球菌MG1363后，可在包含红霉素的选择培养基上选择在上游或下游靶序列上的第一同源重组。通过thyA的缺失选择另一靶上的第二同源重组。F)最终的染色体结构，其中thyA被hIL-10替换。
参考基本上如Steidler等人(2003)中所述的其他乳球菌株系、自给性乳球菌(Self-containing Lactococcus)株系(WO 02/090551)，就分泌型hIL-10(即，符合读框地提供的具有乳球菌分泌信号序列例如usp45或相似序列的hIL-10)的表达水平评估经染色体整合的转基因，并在本文中将其简要地描述如下将不同的乳酸乳球菌株系划线至单个菌落，然后通过将1个菌落接种在GM17(M17，Oxoid，Hampshire，UK，补充有0.5％的葡萄糖)中，并且在30℃下温育16小时来制备预培养物。将这些预培养物以1/25接种在5ml GM中，然后在30℃下温育4小时。通过离心收集细胞，将其重悬浮于5ml新鲜BM9(表4中的组成)中。将这些细胞悬浮物在30℃下温育3小时。通过离心除去细菌细胞，将上清液转移至新试管。通过ELISA测定上清液的hIL-10含量，通过用western印迹法分析等量的1ml培养物来显现hIL-10蛋白。
进行反复尝试和不同的亚克隆策略直至不可能亚克隆不同的启动子序列。成功地亚克隆的启动子序列概述于表12中。
实施例3启动子的强度 在鉴定几个启动子后，我们在进一步的一系列实验中检测几个启动子构建体。此外，为了确定启动子的活性是否不依赖于报告基因，我们设计了包含GLP-2基因的报告基因构建体。
人胰高血糖素原基因(GenBank登录号NM_002054)编码被切割成4个不同的成熟肽(包括胰高血糖素样肽-2(GLP-2))的前蛋白原。我们设计以乳酸乳球菌的偏性密码子编码的h[Gly2]GLP-2的基因，该基因编码在位点2上具有丙氨酸至甘氨酸的置换的成熟人GLP-2类似物，该类似物显示减少的对由二肽基肽酶-IV产生的降解的易感性(Booth等人，2004)。使用基本上如Stemmer等人(1995)(其通过引用合并入本文)中描述的本领域现有方法装配合成的基因。
将所得的片段融合至usp45分泌信号(van Asseldonk，等人，1990)。将融合构建体置于一系列乳球菌启动子P1(Waterfield，等人，1995)、PthyA(胸苷酸合酶启动子)和PhllA(细菌类核DNA结合蛋白/DNA结合蛋白HU的启动子；SEQ ID NO28)的下游。
该策略产生可作为EcoRI-XbaI(对于P1(pT1GLP2))或EcoRI-SpeI(所有其他构建体)片段亚克隆在EcoRI-SpeI打开的质粒pT1NX中的片段(Steidler等人，1998；图4)。
不同质粒的概述示于表5中。测序验证了所有质粒，之后使用由Gasson(1983)提供的方法将它们转化至乳酸乳球菌MG1363。
在并行获得的不同株系的蛋白质提取物中证明GLP-2的表达和分泌。简而言之，将饱和培养物稀释25倍，然后将其培养在适当缓冲的生长培养基中，在对数生长期结束时收集培养物。将等量的1ml培养物装载在SDS-PAGE上，然后通过western印迹法对其进行分析。用多克隆兔抗GLP-2抗体(Abcam，Cambridge，UK)通过免疫印迹来检测GLP-2。二抗是与碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔IgG(SouthernBiotechnology Associates，Birmingham，AL)。使用NBT/BCIP底物(Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)显示酶促活性。
根据我们的数据，可得出PhllA启动子是极强的启动子。
实施例4信号序列的影响 为了控制表达水平，包括产量和分泌，我们构建了一系列usp45突变体，首先结合28)的PhllA启动子检测所述突变体。
令人惊讶地，其中位点4上的赖氨酸被天冬酰胺替换的usp45突变体(usp45 N4)导致与thyA-启动子和P1-启动子指导的表达相比，显著增加的h[Gly2]GLP-2的产量和分泌(PhllAN4GLP2)(图5A)。此外，这些转化子非常稳定。整合入乳酸乳球菌的基因组的构建体也产生显著增加的产量和分泌。报告基因构建体在干酪乳杆菌中的表达产生与在乳酸乳球菌中的结果大体上相同的结果。
然后，我们将该突变导入P1-启动子和thyA-启动子下游的usp45，从而分别产生质粒pT1N4GLP2和pThyAN4GLP2。令人惊讶地，该突变对由P1-启动子调控的h[Gly2]GLP-2的产生影响极小，但完全消除了在thyA-启动子的转录控制下的h[Gly2]GLP-2的产生(图5B)。
根据这些数据，很明显，与信号序列uspN4结合的PhllA启动子非常适合用于控制基因的表达。
实施例5通过人白细胞介素-10(hIL-10)的表达检测启动子的强度 我们在一系列实验中检测了几个启动子构建体。此外，为了确定启动子活性是否不依赖于报告基因，我们设计了其中产生表达盒的报告基因构建体，所述表达盒在融合至合成的hIL-10基因(也参见实施例2)的usp45分泌信号(van Asseldonk等人，1990)之前包含待研究的启动子。在该情况下，将融合构建体置于一系列乳球菌启动子PthyA(胸苷酸合酶启动子，株系sAGX0005和Thy12)、PdpsA启动子(DNA结合铁蛋白样蛋白，SEQ ID NO3，sAGX0012)、PpepV(Xaa-His二肽酶启动子SEQ ID NO158，株系sAGX0018)、PsodA(超氧化物歧化酶启动子，SEQ ID NO20，sAGX0029)和PhllA(细菌类核DNA结合蛋白/DNA结合蛋白HU的启动子；SEQ ID NO28，株系sAGX0037)的下游。
通过双重同源重组将所有表达盒整合在乳酸乳球菌MG1363染色体的thyA基因座中，由此去除thyA基因(与用于Thy12的构建的策略(Steidler等人，2003)相似但不使用辅助质粒pVE6007的策略)，如图3中所示的。这使hIL-10表达盒外部的所有DNA序列同一。在图6中提供了不同株系中hIL-10表达盒的结构和位置的概述。对本文中描述的株系的hIL-10表达盒(启动子、usp45分泌信号、hIL-10)进行测序验证。
将不同的受试株系在固体琼脂GM17T平板上划线至单个菌落。将单个菌落接种在GM17T中，然后培养过夜至饱和。将这些培养物的适当的稀释物在GM17T中预培养4小时。通过离心收获细菌，然后在经缓冲的培养基(BM9T)中再温育3小时。通过离心除去细菌，从该澄清的上清液收集样品以用于分析。通过对于hIL-10是特异性的ELISA分析样品。图7给出了表达水平。所有数据以3个单独测量的平均值提供。相对启动子强度示于表6中。
为了排除株系之间的不同生长特征的影响，我们在上述表达实验结束时测定菌落形成单位(CFU)并且计算对于不同株系每109CFU的hIL-10产量。该实验显示，没有观察到显著不同的生长率，和如从hIL-10的表达所判断的，PhllA比PthyA强大约4倍(图8和表7)。
根据我们的数据，可得出PdpsA、PpepV、PsodA和PhllA都是极强的启动子并且非常胜任于指导异源基因的表达。
实施例6通过人三叶因子(TFF)的表达检测启动子强度 在鉴定潜在的强启动子后，我们在另外的一系列实验中检测几种启动子构建体。此外，为了确定启动子活性是否不依赖于报告基因，我们设计其中产生表达盒的报告基因构建体，所述表达盒在融合至合成的hTFF1或hTFF3基因的野生型(wt)usp45分泌信号(van Asseldonk等人，1990)或其突变体(mut；包括其中位点4上的赖氨酸被天冬酰胺替代的usp45N4)之前包含待研究的启动子。将融合构建体置于一系列乳球菌启动子PthyA(胸苷酸合酶启动子，株系sAGX0041和sAGX0043)、PdpsA启动子(DNA结合铁蛋白样蛋白，SEQ ID NO3，株系sAGX0059)和PhllA(细菌类核DNA结合蛋白/DNA结合蛋白HU的启动子；SEQ ID NO28，株系sAGX0048、sAGX0049和sAGX0057)的下游。所有表达盒通过双重同源重组整合在乳酸乳球菌MG1363染色体的thyA基因座中，由此去除thyA基因(与用于Thy12的构建的策略(Steidler等人，2003)相似但不使用辅助质粒pVE6007的策略)，如图3中所示的。这使TFF表达盒外部的所有DNA序列都同一。在图9和表8中提供了不同株系中TFF表达盒的结构和位置的概述。对本文中描述的株系的TFF表达盒(启动子、分泌信号、TFF)进行序列验证。
将不同的受试株系在固体琼脂GM17T平板上划线至单个菌落。将单个菌落接种在GM17T中，然后培养过夜至饱和。将这些培养物的适当的稀释物在GM17T中预培养4小时。通过离心收获细菌，然后在经缓冲的培养基(BM9T)中再温育3个小时。通过离心除去细菌，然后从该澄清的上清液中收集样品以进行分析。通过对于hTFF是特异性的ELISA分析样品。图10中提供了表达水平。也通过对于hTFF1是特异性的western印迹法来分析来自hTFF1表达株系的样品(图11)。所有数据以3个单独测量的平均值给出。表8中提供了相对启动子强度。
与实施例4一致，图10中的数据显示Usp45 N4突变体不负责sAGX0057的hTFF3的增强的表达，但提供了进一步的控制表达的水平。
置于hTFF1和hTFF3表达构建体之前的PdpsA、PpepV和PsodA也显示与PthyA相比增强的表达。
根据我们的数据，可得出PdpsA、PpepV、PsodA和PhllA是极强的启动子并非常胜任于指导异源基因的表达。
实施例7通过人肽YY Gly9变体的氨基酸3-36(hPYY G9(3-36))表达检测启动子强度 在鉴定潜在的强启动子后，我们在另外的一系列实验中检测几种启动子构建体。此外，为了确定启动子活性是否不依赖于报告基因，我们设计其中产生表达盒的报告基因构建体，所述表达盒在融合至合成的hPYY G9(3-36)基因的usp45分泌信号(van Asseldonk等人，1990)之前包含待研究的启动子。将融合构建体置于一系列乳球菌启动子P1(Waterfield等人，1995)(质粒pAGX0211)、PthyA(胸苷酸合酶启动子，质粒pAGX0212)和PhllA(细菌类核DNA结合蛋白/DNA结合蛋白HU的启动子；SEQ ID NO28，质粒pAGX0213)的下游。所有表达盒作为EcoRI-SpeI片段插入质粒pT1NX(Schotte等人，2000)。这使表达盒外部的所有DNA序列(包括复制起始区和红霉素抗性)对于上述质粒都同一。在图12和表9中提供了不同表达质粒的结构的概述。对本文中描述的株系的hPYY表达盒(启动子、usp45分泌信号、PYY)进行序列验证。
将空表达载体pT1NX以及所有hPYY G9(3-36)表达质粒转化至乳酸乳球菌MG1363。将所得的株系在固体琼脂GM17E平板上划线至单个菌落。将单个菌落接种在GM17E中，然后培养过夜至饱和。将这些培养物的适当的稀释物在GM17E中预培养4小时。通过离心收获细菌，然后在经缓冲的培养基(BM9E)中再温育3个小时。通过离心除去细菌，然后从该澄清的上清液中收集样品以进行分析。通过对于hPYY是特异性的ELISA分析样品。图13中提供了表达水平。表9中提供了相对启动子强度。
置于融合至合成的hPYY G9(3-36)基因的usp45分泌信号(vanAsseldonk等人，1990)之前的PdpsA、PpepV和PsodA也显示与PthyA指导的表达相比增强的表达。
根据我们的数据，可得出PdpsA、PpepV、PsodA和PhllA都是极强的启动子且非常胜任于指导异源基因的表达。
实施例8通过人胰高血糖素样肽-1 Gly8变体的氨基酸7-36(hGLP-1G8(7-36))的表达检测启动子的强度 在鉴定潜在的强启动子后，我们在另外的一系列实验中检测几种启动子构建体。此外，为了确定启动子活性是否不依赖于报告基因，我们设计其中产生表达盒的报告基因构建体，所述表达盒在融合至合成的hGLP-1 G8(7-36)基因的usp45分泌信号(van Asseldonk等人，1990)之前包含待研究的启动子。GLP-1 Gly8变体显示减少的对由二肽基肽酶VI产生的蛋白水解切割的易感性(Deacon等人，1998)。将融合构建体置于两个乳球菌启动子PthyA(胸苷酸合酶启动子，质粒pAGX0233)和PhllA(细菌类核DNA结合蛋白/DNA结合蛋白HU的启动子；SEQ ID NO28，质粒pAGX0234)的下游。所有表达盒作为EcoRI-SpeI片段插入质粒pT1NX(Schotte等人，2000)。这使表达盒外部的所有DNA序列(包括复制起始区和红霉素抗性)对于上述质粒都同一。在图14和表10中提供了不同表达质粒的结构的概述。对本文中描述的株系的GLP-1 Gly8表达盒(启动子、usp45分泌信号、GLP-1Gly8)进行序列验证。将空表达载体pT1NX以及所有hGLP-1G8(7-36)表达质粒转化至乳酸乳球菌MG1363。将所得的株系在固体琼脂GM17E平板上划线至单个菌落。将单个菌落接种在GM17E中，然后培养过夜至饱和。将这些培养物的适当的稀释物在GM17E中预培养4小时。通过离心收获细菌，然后在经缓冲的培养基(BM9E)中再温育3个小时。通过离心除去细菌，然后从该澄清的上清液中收集样品以进行分析。通过对于hGLP-1是特异性的ELISA分析样品。图15中提供了表达水平。表10中提供了相对启动子强度。
实施例9通过人白细胞介素-10(hIL-10)的表达检测的启动子强度 我们在另外的一系列实验中检测几种启动子构建体。此外，为了确定启动子活性是否不依赖于报告基因，我们设计其中产生表达盒的报告基因构建体，所述表达盒在融合至合成的hIL-10基因的usp45分泌信号(van Asseldonk等人，1990)之前包含待研究的启动子。将融合构建体置于一系列乳球菌启动子下游(图16和表11)。
通过双重同源重组将所有表达盒整合在乳酸乳球菌MG1363染色体的thyA基因座中，由此去除t hyA基因(与用于Thy12的构建的策略(Steidler等人，2003)相似但不使用辅助质粒pVE6007的策略)。这使hIL-10表达盒外部的所有DNA序列都同一。在图16中描述了存在于不同株系(通常命名为“sAGX00xx”)中的hIL-10表达盒的结构和位置的概述。对本文中描述的株系的hIL-10表达盒(启动子、usp45分泌信号、hIL-10)进行序列验证。
将不同的受试株系在固体琼脂GM17T平板上划线至单个菌落。将单个菌落接种在GM17T中，然后培养过夜至饱和。将这些培养物的适当的稀释物在GM17T中预培养4小时。通过离心收获细菌，然后在经缓冲的培养基(BM9T)中再温育3个小时。通过离心除去细菌，然后从该澄清的上清液中收集样品以进行分析。通过对于hIL-10是特异性的ELISA分析样品。图17中提供了表达水平。所有数据以三个单独测量的平均值给出。表11中提供了相对启动子强度。
与设计的(projected)蛋白质组和转录组分析不同，特定启动子指导异源基因的表达的强度和能力仍然不可预测。



表2 表3 表4.BM9的组成
10xM9盐是每升60g的Na2HPO4，30g的KH2PO4，10g的NH4Cl，5g的NaCl。
表5不同质粒和它们的成分的概述.
表6 通过测量来自指定的株系的hIL-10表达测定的不同受试启动子的相对强度。[2]Steidler等人，2003。
表7 平均hIL10浓度 细菌密度 株系(ng/109细胞) 相对启动子强度 (x109CFU/ml) MG1363 0 0 4,1 sAGX00057,3 1 4,8 sAGX003729,1 4 4,2 作为菌落形成单位(CFU)的函数的相对启动子强度。
表8 本研究中使用的不同TFF表达株系和来自指定的株系的分泌的TFF的相对表达水平的概述。
表9 本研究中使用的不同hPYY G9(3-36)表达株系和来自指定的质粒的分泌的hPYY G9(3-36)的相对表达水平的概述。所有质粒存在于乳酸乳球菌MG1363中。[3]Schotte等人，2000。
表10 本研究中使用的不同hGLP-1G8(7-36)表达株系和来自指定的质粒的分泌的hGLP-1G8(7-36)的相对表达水平的概述。所有质粒存在于乳酸乳球菌MG1363中。[3]Schotte等人，2000。
表11 通过测量来自指定株系的hIL-10表达评估的不同启动子的相对强度。
表12成功亚克隆的启动子序列
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权利要求
1.包含启动子(P)的重组核酸，所述启动子为来自乳球菌属的种的天然启动子或其功能变体或功能片段，与对于启动子(P)是异源的一个或多个开放阅读框有效连接，所述重组核酸特征在于所述启动子(P)在乳球菌中比乳酸乳球菌的胸苷酸合酶基因(thyA)的启动子更强。
2.权利要求1的重组核酸，其中启动子(P)选自乳球菌，优选乳酸乳球菌的下述基因的天然启动子
1)DNA-指导的RNA聚合酶、β′亚基/160kD亚基(rpoC)，
3)非血红素铁结合铁蛋白(dpsA)，
4)丙酮酸激酶(pyk)，
5)谷氨酰胺酰-tRNA合成酶(gltX)，
6)磷酸丙酮酸水合酶(emo)，
9)二肽酶PepV(pepV)，
12)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapB)，
13)乙酸激酶(ackA)，
18)果糖二磷酸醛缩酶(fbaA)，
20)超氧化物歧化酶(sodA)，
21)核糖体蛋白S12(rpsL)和核糖体蛋白S7(rpsG)，
22)核糖体蛋白L18(rplR)和核糖体蛋白S5(rpsE)和核糖体蛋白L30/L7E(rpmD)，
24)核糖体蛋白L19(rplS)，
26)核糖体蛋白L10(rplJ)，
28)HU-样DNA-结合蛋白(hllA)，
29)50S核糖体蛋白L28(rpmB)，
30)磷酸转移酶系统IIB组分(ptcB)，
31)F0F1-型ATP合酶α亚基(atpA)，
32)多重糖结合转运ATP结合蛋白(msmK)，
33)丙酮酸脱氢酶E1组分α亚基(pdhA)，
34)细胞分裂蛋白(difIVA或ftsA)，
35)吡喃型UDP-半乳糖变位酶(glfl)，
36)谷氨酰基氨基肽酶(pepA)，
37)预测的脱氢酶相关蛋白(11mg 0272)，
38)核糖体蛋白S2(rpsB)，
39)翻译起始因子3(IF-3)(infC)，
40)核糖体蛋白L4(rplD)和核糖体蛋白L23(rplW)和核糖体蛋白L2(rplB)，
41)苯丙氨酰-tRNA合成酶β链(pheT)，
42)转录延伸因子GreA(greA)，
43)ATP-依赖性Clp蛋白酶的蛋白水解亚基(clpP)，
44)核糖体蛋白L15(rpl0)，
45)核糖体蛋白L11(rplK)，
46)核糖体蛋白S8(rpsH)，
47)核糖体蛋白L21(rplU)，
48)核糖体蛋白S13(rpsM)，
49)核糖体蛋白S19(rpsS)和核糖体蛋白L22(rplU)和核糖体蛋白L16(rplP)和核糖体蛋白L14(rplN)，
50)核糖体蛋白S10(rpsJ)，
51)辅伴侣蛋白GroES(Hsp10)(groES)，
52)核糖体蛋白L24(rplX)，和
53)假定的霍利迪连结体解离酶(11mg-0151)，以及所述天然启动子的功能变体和功能片段。
3.权利要求1的重组核酸，其中启动子(P)选自乳球菌，优选乳酸乳球菌的下述基因的天然启动子
1)DNA-指导的RNA聚合酶，β′亚基/160kD亚基(rpoC)，
3)非血红素铁结合铁蛋白(dpsA)，
4)丙酮酸激酶(pyk)，
5)谷氨酰胺酰-tRNA合成酶(gltX)，
6)磷酸丙酮酸水合酶(eno)，
9)二肽酶PepV(pepV)，
12)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapB)，
13)乙酸激酶(ackA)，
18)果糖二磷酸醛缩酶(fbaA)，
20)超氧化物歧化酶(sodA)，
21)核糖体蛋白S12(rpsL)和核糖体蛋白S7(rpsG)，
22)核糖体蛋白L18(rplR)和核糖体蛋白S5(rpsE)和核糖体蛋白L30/L7E(rpmD)，
24)核糖体蛋白L19(rplS)，
26)核糖体蛋白L10(rplJ)，
28)HU-样DNA-结合蛋白(hllA)，
29)50S核糖体蛋白L28(rpmB)，
30)磷酸转移酶系统IIB组分(ptcB)，以及所述天然启动子的功能变体和功能片段。
4.权利要求1的重组核酸，其中启动子(P)选自SEQ ID NO1、3至6、9、12、13、18、20至22、24、26、28至54，160、163至165、167、169、171至180中所示的核酸和其同源物，以及其功能变体和功能片段。
5.权利要求1至4的任一项的重组核酸，其还包含在所述一个或多个开放阅读框的3′的转录终止子序列。
6.权利要求1至5的任一项的重组核酸，其还包含经设计用于控制从所述启动子(P)的转录的操纵子。
7.权利要求1至6的任一项的重组核酸，其还包含经设计用于实现将所述重组核酸插入，优选通过同源重组插入至宿主细胞的染色体的序列。
8.权利要求1至7的任一项的重组核酸，其还包含信号序列，优选usp45或usp45N4。
9.权利要求1至8的任一项的重组核酸，其包含SEQ ID NO28和usp45或usp45N4。
10.权利要求1至9的任一项的重组核酸，其中所述一个或多个开放阅读框编码能够在受试者中，优选在人或动物受试者中引起治疗性或免疫原性反应的多肽。
11.权利要求10的重组核酸，其中所述一个或多个开放阅读框编码抗原和/或非疫苗原性治疗活性多肽。
12.权利要求11的重组核酸，其中所述抗原能够在人或动物受试者中引起免疫反应，优选免疫耐受反应，和/或所述非疫苗原性治疗活性多肽能够在人或动物受试者中产生治疗效果。
13.权利要求11的重组核酸，其中所述抗原能够在人或动物受试者中引起免疫反应并且用作疫苗。
14.权利要求13的重组核酸，其中所述非疫苗原性治疗活性多肽是hIL-10、GLP-2、GLP-1、TFF或hPYY。
15.权利要求14的重组核酸，其中所述重组核酸包含
(a)PdpsA，usp45和hIL-10(sAGX0012)；PdpsA，usp45N4和hIL-10；
PpepV，usp45和hIL-10(sAGX0018)；PpepV，usp45N4和hIL-10；
PsodA，usp45和hIL-10(sAGX0029)；PsodA，usp45N4和hIL-10；
PhllA，usp45和hIL-10(sAGX0037)；PhllA，usp45N4和hIL-10；
(b)PdpsA，usp45N4和hTFF1；PdpsA，usp45和hTFF1；
PpepV，usp45N4和hTFF1；PpepV，usp45和hTFF1；
PsodA，usp45N4和hTFF1；PsodA，usp45和hTFF1；
PhllA，usp45N4和hTFF1(sAGX0048)；PhllA，usp45和hTFF1(sAGX0049)；
(c)PdpsA，usp45N4和hTFF3；PdpsA，usp45和hTFF3(sAGX0048)；
PpepV，usp45N4和hTFF3；PpepV，usp45和hTFF3；
PsodA，usp45N4和hTFF3；PsodA，usp45和hTFF3；
PhllA，usp45N4和hTFF3(sAGX0057)；PhllA，usp45和hTFF3；
(d)PdpsA，usp45N4和hPYY；PdpsA，usp45和hPYY(sAGX0048)；
PpepV，usp45N4和hPYY；PpepV，usp45和hPYY；
PsodA，usp45N4和hPYY；PsodA，usp45和hPYY；
PhllA，usp45N4和hPYY(sAGX0057)；PhllA，usp45和hPYY；PhllA，usp45和hPYY G9(3-36)(sAGX0213)；
(e)PdpsA，usp45N4和GLP-1；PdpsA，usp45和GLP-1；
PpepV，usp45N4和GLP-1；PpepV，usp45和GLP-1；
PsodA，usp45N4和GLP-1；PsodA，usp45和GLP-1；
PhllA，usp45N4和GLP-1；PhllA，usp45和GLP-1；
(f)PdpsA，usp45N4和GLP-2；PdpsA，usp45和GLP-2；
PpepV，usp45N4和GLP-2；PpepV，usp45和GLP-2；
PsodA，usp45N4和GLP-2；PsodA，usp45和GLP-2；
PhllA，usp45N4和GLP-2；或PhllA，usp45和GLP-2。
16.包含权利要求1至15的任一项中定义的重组核酸的载体。
17.权利要求16的载体，其中所述载体来源于pT1NX。
18.用权利要求1至15的任一项中定义的重组核酸或用权利要求16或17的载体转化的宿主细胞。
19.包含权利要求1至15的任一项中定义的重组核酸的宿主细胞，其中所述启动子(P)存在于所述宿主细胞的染色体中，并且其中所述启动子(P)与对于所述启动子(P)是异源的一个或多个开放阅读框有效连接。
20.权利要求19的宿主细胞，其中所述启动子(P)还包含信号序列，优选usp45或usp45N4。
21.权利要求19或20的宿主细胞，其中所述启动子(P)还包含经设计用于控制从所述启动子(P)的转录的操纵子。
22.权利要求19至21的任一项的宿主细胞，其中所述启动子(P)选自SEQ ID NO1、3至6、9、12、13、18、20至22、24、26、28至54、160、163至165、167、169、171至180中所示的核酸和其同源物，以及其功能变体和功能片段。
23.权利要求19至22的任一项的宿主细胞，其中所述一个或多个开放阅读框编码能够在受试者中，优选在人或动物受试者中引起治疗反应或免疫原性反应的多肽。
24.权利要求19至23的任一项的宿主细胞，其中所述一个或多个开放阅读框编码抗原和/或非疫苗原性治疗活性多肽。
25.权利要求24的宿主细胞，其中所述抗原能够在人或动物受试者中引起免疫反应，优选免疫耐受反应，和/或所述非疫苗原性治疗活性多肽能够在人或动物受试者中产生治疗效果。
26.权利要求24的宿主细胞，其中所述非疫苗原性治疗活性多肽是hIL-10、GLP-2、GLP-1、TFF或hPYY。
27.权利要求24的宿主细胞，其中所述抗原能够在人或动物受试者中引起免疫反应并且用作疫苗。
28.权利要求24的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含
(a)PdpsA，usp45和hIL-10(sAGX0012)；PdpsA，usp45N4和hIL-10；
PpepV，usp45和hIL-10(sAGX0018)；PpepV，usp45N4和hIL-10；
PsodA，usp45和hIL-10(sAGX0029)；PsodA，usp45N4和hIL-10；
PhllA，usp45和hIL-10(sAGX0037)；PhllA，usp45N4和hIL-10；
(b)PdpsA，usp45N4和hTFF1；PdpsA，usp45和hTFF1；
PpepV，usp45N4和hTFF1；PpepV，usp45和hTFF1；
PsodA，usp45N4和hTFF1；PsodA，usp45和hTFF1；
PhllA，usp45N4和hTFF1(sAGX0048)；PhllA，usp45和hTFF1(sAGX0049)；
(c)PdpsA，usp45N4和hTFF3；PdpsA，usp45和hTFF3(sAGX0048)；
PpepV，usp45N4和hTFF3；PpepV，usp45和hTFF3；
PsodA，usp45N4和hTFF3；PsodA，usp45和hTFF3；
PhllA，usp45N4和hTFF3(sAGX0057)；PhllA，usp45和hTFF3；
(d)PdpsA，usp45N4和hPYY；PdpsA，usp45和hPYY(sAGX0048)；
PpepV，usp45N4和hPYY；PpepV，usp45和hPYY；
PsodA，usp45N4和hPYY；PsodA，usp45和hPYY；
PhllA，usp45N4和hPYY(sAGX0057)；PhllA，usp45和hPYY；PhllA，usp45和hPYY G9(3-36)(sAGX0213)；
(e)PdpsA，usp45N4和GLP-1；PdpsA，usp45和GLP-1；
PpepV，usp45N4和GLP-1；PpepV，usp45和GLP-1；
PsodA，usp45N4和GLP-1；PsodA，usp45和GLP-1；
PhllA，usp45N4和GLP-1；PhllA，usp45和GLP-1；
(f)PdpsA，usp45N4和GLP-2；PdpsA，usp45和GLP-2；
PpepV，usp45N4和GLP-2；PpepV，usp45和GLP-2；
PsodA，usp45N4和GLP-2；PsodA，usp45和GLP-2；
PhllA，usp45N4和GLP-2；或PhllA，usp45和GLP-2。
29.权利要求18至28的宿主细胞，其是非病原性和非侵入性细菌，优选革兰氏阳性细菌，更优选乳酸菌，更优选乳球菌或乳杆菌以及最优选乳酸乳球菌或干酪乳杆菌。
30.权利要求1至15的任一项的重组核酸或权利要求16或17的载体用于在宿主细胞中获得由所述一个或多个阅读框架编码的表达产物的表达的用途。
31.用于目的多肽的重组表达的方法，其包括
a)培养权利要求18至29的任一项中定义的宿主细胞，其中所述一个或多个开放阅读框编码目的多肽，
b)分离由所述培养中的宿主细胞产生的目的多肽。
32.权利要求18至29的任一项中定义的宿主细胞用于制造药剂的用途，所述药剂用于将由所述重组核酸的一个或多个开放阅读框编码的多肽递送至人或动物。
33.权利要求32的用途，其中所述多肽是抗原和/或非疫苗原性治疗活性多肽，优选hIL-10、GLP-2、GLP-1、TFF或hPYY。
34.包含权利要求18至29的任一项中定义的宿主细胞的药物组合物。
35.权利要求18至29的任一项的宿主细胞，其用作药剂。
全文摘要
本发明在分子生物学领域内，并且涉及重组基因工程及蛋白质表达。更具体地，本发明涉及用于蛋白质的重组表达的核酸，其包含来源于乳球菌并且用作启动子的序列。本发明还涉及包含所述核酸的载体和用其转化的宿主细胞。本发明还包括包含所述核酸或载体的宿主细胞用于表达异源或同源蛋白质的用途；以及用于所述蛋白质至受试者的递送，特别地治疗性递送的用途。
文档编号C12N15/74GK101605900SQ200880004485
公开日2009年12月16日 申请日期2008年1月14日 优先权日2007年1月12日
发明者L·斯特德勒, K·万德恩布鲁克, S·内尔恩克 申请人:阿克图杰尼斯公司