一种浒苔蛋白酶的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种浒苔蛋白酶的制备方法，该方法包括：选择原料、高压清洗、漏水剪切、添加蛋白酶抑制剂榨汁、加入抽提液和缓冲液放入捣碎机制备粗抽提液、固体硫酸铵离心、乙酸溶液透析脱盐、加入罗氏蛋白酶抑制剂冰浴冷却、加入氯丁橡胶cr322搅拌离心、用碳酸氢钠纯化、n-乙酰-l-半胱氨酸溶液结晶、冷冻离心收集结晶、成品保存。有效保证浒苔蛋白酶活力和纯度。本发明的可广泛应用在洗涤工业、食品工业、纺织工业、皮革工业、纸浆工业、饲料、石油天然气钻井、临床医药、农业、林业、畜牧业等行业。并在的应用中具有减少耗能，减少化学品、快速环保的优良效果。
【专利说明】一种浒苔蛋白酶的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种植物蛋白酶，尤其涉及一种浒苔蛋白酶的制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来，植物蛋白酶在洗涤工业、食品工业、纺织工业、皮革工业、纸浆工业、饲料、石油天然气钻井、临床医药、农业、林业、畜牧业等行业的中广泛应用，植物蛋白酶具有减少耗能，减少化学品、快速环保等优良效果，其应用也越来越受到人们的关注。
[0003]植物蛋白酶的制备以植物质为原料，进行蛋白酶制备。常用的植物蛋白酶植物质多采用绿色谷物、草类、未成熟的谷物和树叶等。浒苔蛋白酶的优势在于能够与海洋经济很好的结合，原料价格低，有助于更好的对浒苔原料进行综合利用，实现产生价值最大化。浒苔细胞培养可以不受地域、土地、气候、季节等自然条件的限制，在工业化条件下，可实现全年生产。浒苔生长的倍增时间一般为15h-60h，生产周期为8-15d，与木瓜、大蒜、紫草等相t匕，浒苔大大缩短了生产周期。
[0004]现有技术中还没有一种浒苔蛋白酶的制备方法。
【发明内容】
[0005]在下文中给出关于本发明的简要概述，以便提供关于本发明的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本发明的穷举性概述。它并不是意图确定本发明的关键或重要部分，也不是意图限定本发明的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。
[0006]本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种浒苔蛋白酶的制备方法。该方法能够与海洋经济很`好的结合，具有原料价格低，有助于更好的对浒苔原料进行综合利用，实现产生价值最大化的优点。
[0007]为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
[0008]本发明提供一种浒苔蛋白酶的制备方法，包括以下步骤:
[0009](I)选择浒苔，并清洗打捞的浒苔；
[0010](2)将打捞的浒苔剪切，然后加入蛋白酶抑制剂进行榨汁，得到浒苔汁液；所述蛋白酶抑制剂的加入量为浒苔汁液重量的1%_3% ；
[0011](3)将浒苔汁液放入捣碎机，给捣碎机加入抽提液和缓冲液，捣碎抽提后，将悬浮液过滤，得到的滤液为浒苔蛋白酶的粗抽提液；
[0012]所述抽提液制备方法:按照IL蒸馏水加入0.5-2g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的氯化钠NaCI溶液中加入0.1-0.3g氯化钾；按照IL蒸馏水配置的所述抽提液用于加入100克的浒苔汁液中；
[0013]所述缓冲液制备方法:按照IL蒸馏水加入0.3-1.5g三羟甲基甲烷，配置三羟甲基甲烷溶液，按照IL蒸馏水配置的所述缓冲液用于加入100克的浒苔汁液中；
[0014](4)在0_2°C将固体硫酸铵加入所述的粗抽提液中，搅拌，至溶液饱和度35-45%，离心后弃上清夜，得到浒苔蛋白酶溶液；
[0015](5)将浒苔蛋白酶溶液装入透析袋中，将透析袋浸泡在0.5-2mol/L乙酸溶液中进行脱盐处理；
[0016](6)给脱盐处理后的浒苔蛋白酶溶液中加入罗氏蛋白酶抑制剂，冰浴冷却，再加入氯丁橡胶，搅拌，离心，得沉淀，沉淀再用NaHCO3洗脱，搅拌，离心后再次得到沉淀；
[0017]所述蛋白酶抑制剂用量为:每100克的浒苔汁液中对应加入0.05-0.1ml蛋白酶抑制剂；
[0018]所述氯丁橡胶的用量为:每100克的浒苔汁液中对应加入20_30mg氯丁橡胶； [0019]所述NaHCO3的用量为:每100克的浒苔汁液中对应加入5_10g NaHCO3 ；
[0020](7)将步骤(6)最终得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在23_25°C室温下放置60-120min生成结晶，所得到的结晶为浒苔蛋白酶；
[0021 ] 所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液按照IOOmL蒸馏水加入0.1-0.3gN_乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，按照IOOmL蒸馏水配置的所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液用于加入100克的浒苔汁液中。
[0022]所述蛋白酶抑制剂选自EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid乙二胺四乙酸)、a2-巨球蛋白、B.M.综合酶片或罗氏蛋白酶。
[0023]进一步地，步骤(1)中还包括:
[0024]选择的浒苔为:打捞后到使用< 2天，自然温度打捞后，浒苔的加工温度< 37°C，优选20-37°C;优选20°C至37°C，通过IOOkpa高压水清洗浒苔，去除沙石，时间20-30分钟。
[0025]进一步地，步骤(2)中:
[0026]对清洗的浒苔进行自然漏水处理:
[0027]将冲洗后的浒苔平整堆放在漏水架上，每层漏水架设置接水底盘，每层浒苔厚度15-25cm，所述剪切的浒苔的长度和宽度为1-1.5cm。
[0028]所述浸泡的时间为l_2h。
[0029]所述透析袋为玻璃纸透析袋。
[0030]所述冰浴冷却的时间为10-15min，加入氯丁橡胶的搅拌时间为5_10min，加入NaHCO3的搅拌时间为2-16min。
[0031]进一步地，将步骤(7)的得到的结晶在4°C的条件下放置8_16h，结晶长大，冷冻离心收集结晶。
[0032]所述氯丁橡胶选自氯丁橡胶CR322、氯丁橡胶CR2442或氯丁橡胶CR121。
[0033]所述浒苔蛋白酶在0°C冰箱保存。
[0034]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0035]1、本发明可广泛应用在洗涤工业、食品工业、纺织工业、皮革工业、纸浆工业、饲料、石油天然气钻井、临床医药、农业、林业、畜牧业等行业。并在的应用中具有减少耗能，减少化学品、快速环保的优良效果。
[0036]2、浒苔蛋白酶能够与海洋经济很好的结合，原料价格低，制备工艺简单，有助于更好的对浒苔原料进行综合利用，实现产生价值最大化。
[0037]3、浒苔细胞培养可以不受地域、土地、气候、季节等自然条件的限制，在工业化条件下，可实现全年生产。[0038]4、浒苔蛋白酶具有生物降解性，一定程度上缓解给环境带来的污染。
[0039]5、浒苔蛋白酶的制备技术带动浒苔的综合利用，使其高效地转化为洗涤、食品、饲料、纺织和各类物质的化学品。
[0040]6、制备工艺具有酶的活力和纯度较高，浒苔蛋白酶活力> 230万单位/克。
[0041]7、有利促进海洋经济发展。
【具体实施方式】
[0042]下面结合实施例，对本发明做进一步的说明:
[0043]实施例1
[0044]一种浒苔蛋白酶的制备方法，包括以下步骤:
[0045](1)选择浒苔，并清洗打捞的浒苔；
[0046](2)将打捞的浒苔剪切，然后加入a2_巨球蛋白进行榨汁，得到浒苔汁液；取100克浒苔汁液中含有I克a2-巨球蛋白；
[0047](3)将100克浒苔汁液放入捣碎机，给捣碎机加入抽提液和缓冲液，捣碎抽提后将悬浮液过滤，得到的滤液为浒苔蛋白酶的粗抽提液；
[0048]所述抽提液制备方法:将IL蒸馏水加入0.5g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的氯化钠NaCI溶液中加入0.3g氯化钾；
[0049]所述缓冲液制备方法:将IL蒸馏水加入1.5g三羟甲基甲烷，配置三羟甲基甲烷溶液；
[0050](4)在0°C，将固体硫酸铵加入所述的粗抽提液中，搅拌，至溶液饱和度35%，离心后弃上清夜，得到浒苔蛋白酶溶液；
[0051](5)将浒苔蛋白酶溶液装入透析袋中，将透析袋浸泡在0.5ml/L乙酸溶液中进行脱盐处理；
[0052](6)给脱盐处理后的浒苔蛋白酶溶液中加入0.05g罗氏蛋白酶抑制剂，冰浴冷却，再加入20mg氯丁橡胶，搅拌，离心，得沉淀，沉淀再用5g浓度为60%的NaHCO3溶液洗脱，搅拌，离心后再次得到沉淀；
[0053](7)将步骤(6)最终得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在25°C室温下放置IOOmin生成结晶，所得到的结晶为浒苔蛋白酶；其中，N-乙酰-L-半胱氨酸溶液为IOOmL蒸馏水加入0.1gN-乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液。
[0054]实施例2
[0055]一种浒苔蛋白酶的制备方法，包括以下步骤:
[0056](1)选择浒苔，并清洗打捞的浒苔；选择的浒苔为:打捞后到使用< 2天，自然温度打捞后，浒苔的加工温度30°C ;通过IOOkpa高压水清洗浒苔，去除沙石，时间20-30分钟。
[0057](2)对清洗的浒苔进行自然漏水处理:
[0058]将冲洗后的浒苔平整堆放在漏水架上，每层漏水架设置接水底盘，每层浒苔厚度15-25cm，所述剪切的浒苔的长度和宽度为1-1.5cm;将打捞的浒苔剪切，然后加入B.M.综合酶片进行榨汁，得到浒苔汁液；B.M.综合酶片的加入量为浒苔汁液重量的2%，即100克浒苔汁液加入2克蛋白酶抑制剂；
[0059](3)将100克將苔汁液加入2克B.M.综合酶片放入waringblender高速组织捣碎机，给捣碎机加入抽提液和缓冲液，温度(TC -50C，间隙式操作5s，重复10次捣碎抽提，悬浮液用布氏漏斗过滤，用美蓝染色法测定浒苔细胞破碎程度，过滤后得到的滤液为浒苔蛋白酶的粗抽提液；
[0060]所述抽提液制备方法:将IL蒸馏水加入Ig的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的NaCI溶液中加入0.2g氯化钾；
[0061]所述缓冲液制备方法:将IL蒸馏水加入0.Sg三羟甲基甲烷，配置三羟甲基甲烷溶液；
[0062](4)将固体硫酸铵磨碎成均匀细粒，在1°C下搅拌下分批加入所述的粗抽提液至饱和度40%，离心，弃上清夜，沉淀为澄清的浒苔蛋白酶溶液。
[0063](5)将浒苔蛋白酶溶液装入透析袋中，将玻璃纸透析袋浸泡在0.7ml/L乙酸溶液中进行脱盐处理，浸泡的时间为1.5h ；
[0064](6)给脱盐处理后的浒苔蛋白酶溶液中加入0.08ml罗氏蛋白酶抑制剂，冰浴冷却IOmin,再加入25mg氯丁橡胶CR322,搅拌6min,离心,得沉淀,沉淀再用8g50%的NaHCO3溶液洗脱，搅拌lOmin，离心后再次得到沉淀；
[0065](7)将步骤(6)最终得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在25°C室温下放置IOOmin生成结晶，结晶在4°C的条件下放置10h，结晶长大，冷冻离心收集结晶，所得到的结晶为浒苔蛋白酶；
[0066]所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液的制备:IOOmL蒸馏水加入0.2gN_乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液；
[0067](8)保存结晶:0°C 下冰箱保存，液态浒苔蛋白酶pH5-10于_5°C下稳定，pH ( 8时稳定性有所增加，可保存6-12个月。
[0068]实施例3
[0069]一种浒苔蛋白酶的制备方法，包括以下步骤:
[0070](I)选择浒苔，并清洗打捞的浒苔；选择的浒苔为:打捞后到使用< 2天，自然温度打捞后，浒苔的加工温度20°C ;通过IOOkpa高压水清洗浒苔，去除沙石，时间20-30分钟。
[0071](2)对清洗的浒苔进行自然漏水处理:
[0072]将冲洗后的浒苔平整堆放在漏水架上，每层漏水架设置接水底盘，每层浒苔厚度15-25cm，所述剪切的浒苔的长度和宽度为1-1.5cm;将打捞的浒苔剪切，然后加入罗氏蛋白酶进行榨汁，得到浒苔汁液；罗氏蛋白酶的加入量为浒苔汁液重量的2%，即100克浒苔汁液加入2克蛋白酶抑制剂；
[0073](3)将100克將苔汁液加入3克罗氏蛋白酶放入waringblender高速组织捣碎机，给捣碎机加入抽提液和缓冲液，温度0°C _5°C，间隙式操作5s，重复10次捣碎抽提，悬浮液用布氏漏斗过滤，用美蓝染色法测定浒苔细胞破碎程度，过滤后得到滤液为浒苔蛋白酶的粗抽提液；
[0074]所述抽提液制备方法:将IL蒸馏水加入2g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的氯化钠NaCI溶液中加入0.3g氯化钾；
[0075]所述缓冲液制备方法:将IL蒸馏水加入1.5g三羟甲基甲烷，配置三羟甲基甲烷溶液；
[0076](4)将固体硫酸铵磨碎成均匀细粒，在2°C下搅拌下分批加入所述的粗抽提液至饱和度35%，离心，弃上清夜，沉淀为澄清的浒苔蛋白酶溶液。
[0077](5)将浒苔蛋白酶溶液装入透析袋中，将玻璃纸透析袋浸泡在1.5ml/L乙酸溶液中进行脱盐处理，浸泡的时间为2h ；
[0078](6)给脱盐处理后的浒苔蛋白酶溶液中加入0.05ml罗氏蛋白酶抑制剂，冰浴冷却12min,再加入20mg氯丁橡胶CR322,搅拌8min,离心,得沉淀,沉淀再用10g45%的NaHCO3溶液洗脱，搅拌2min，离心后再次得到沉淀；
[0079](7)将步骤(6)最终得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在23°C室温下放置60min生成结晶，结晶在4°C的条件下放置16h，结晶长大，冷冻离心收集结晶，所得到的结晶为浒苔蛋白酶；
[0080]所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液的制备:IOOmL蒸馏水加入0.3gN_乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液；
[0081](8)保存结晶:0°C下冰箱保存，液态浒苔蛋白酶pH5-10于_5°C下稳定，pH ( 8时稳定性有所增加，可保存6-12个月。
[0082]实施例4
[0083]一种浒苔蛋白酶的制备方法，包括以下步骤:
[0084](I)选择浒苔，并清洗打捞的浒苔；选择的浒苔为:打捞后到使用< 2天，自然温度打捞后，浒苔的加工温度37°C ;通过IOOkpa高压水清洗浒苔，去除沙石，时间20-30分钟。
[0085](2)对清洗的浒苔进行自然漏水处理:
[0086]将冲洗后的浒苔平·整堆放在漏水架上，每层漏水架设置接水底盘，每层浒苔厚度15-25cm，所述剪切的浒苔的长度和宽度为1-1.5cm ;将打捞的浒苔剪切，然后加入a2-巨球蛋白进行榨汁，得到浒苔汁液；所述蛋白酶抑制剂的加入量为浒苔汁液重量的3%，即100克浒苔汁液加入3克蛋白酶抑制剂；
[0087](3)将100克將苔汁液放入waringblender高速组织捣碎机,给捣碎机加入抽提液和缓冲液，温度(TC -50C，间隙式操作5s，重复10次捣碎抽提，悬浮液用布氏漏斗过滤，用美蓝染色法测定浒苔细胞破碎程度，过滤后得到的滤液为浒苔蛋白酶的粗抽提液；
[0088]所述抽提液制备方法:将IL蒸馏水加入1.5g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的氯化钠NaCI溶液中加入0.15g氯化钾；
[0089]所述缓冲液制备方法:将IL蒸馏水加入0.3g三羟甲基甲烷，配置三羟甲基甲烷溶液；
[0090](4)将固体硫酸铵磨碎成均匀细粒，在0°C下搅拌下分批加入所述的粗抽提液至饱和度40%，离心，弃上清夜，沉淀为澄清的浒苔蛋白酶溶液。
[0091](5)将浒苔蛋白酶溶液装入透析袋中，将玻璃纸透析袋浸泡在2ml/L乙酸溶液中进行脱盐处理，浸泡的时间为100分钟；
[0092](6)给脱盐处理后的浒苔蛋白酶溶液中加入0.1ml罗氏蛋白酶抑制剂，冰浴冷却15min,再加入30mg氯丁橡胶CR322,搅拌8min,离心,得沉淀,沉淀再用5g85%的NaHCO3溶液洗脱，搅拌5min，离心后再次得到沉淀；
[0093](7)将步骤(6)最终得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在24°C室温下放置120min生成结晶，结晶在4°C的条件下放置8h，结晶长大，冷冻离心收集结晶，所得到的结晶为浒苔蛋白酶；[0094]所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液的制备:IOOmL蒸馏水加入0.1gN-乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液；
[0095](8)保存结晶:0°C下冰箱保存，液态浒苔蛋白酶pH5-10于_5°C下稳定，pH≤8时稳定性有所增加，可保存6-12个月。
[0096]用福林试剂还原，分光光度法测定本发明浒苔蛋白酶活力:
[0097]1、先将酪素溶液放入40°C ±0.2°C恒温水浴中，预热5min
[0098]2、4个试管(浒苔蛋白酶实例1-4试样)一加浒苔蛋白酶液态的酶液
1.0Oml — 400C ±0.2°C，2min 加酪素 1.0Oml (摇匀)一40°C ±0.2°C，2min 加三氯乙酸
2.0Oml (摇匀)一取出静置lOmin，过滤一取1.0Oml滤液一碳酸钠溶液(取43g碳酸钠，以蒸馏水溶解并定溶至1000ml)5.0ml —加福林试剂使用液1.0Oml — 40°C ±0.2°C显色20min于680波长，用IOmm比色皿测其吸光度。
[0099]3、标准曲线计算:X=AXKX4/10XN=2/5XAXKXN
[0100]X-样品酶活力，u/g(u/ml)，A-样品平行试验的平均吸光度，k_吸光常数，4_反应试剂的总体积(ml), 10-反应时间IOmin (以Imin计算),N_稀释倍数，行试验测定值误差
(3%。
[0101]4、测定吸光度计算:X=AXKX8/2X10/1XNXE=2/5XAXKXNXE
[0102]X:样品酶活力，u/g(u/ml) ; A:样品平行试验的平均吸光度；
[0103]k:吸光常数；8:反应试剂的总体积(ml)；
[0104]2:吸取酶液 2.0Oml;1/10:反应时间 IOmin,以 Imin 计；
[0105]N:稀释倍数；E:紫外法与福林法的换算系数(系数为
[0106]0.50)，平行试验测定值误差≤3%。
[0107]5、测定酶(固体或液体)，稀释倍数标准，如表1。
[0108]表1
[0109]
【权利要求】
1.一种浒苔蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)选择浒苔，并清洗打捞的浒苔； (2)将打捞的浒苔剪切，然后加入蛋白酶抑制剂进行榨汁，得到浒苔汁液；所述蛋白酶抑制剂的加入量为浒苔汁液重量的1%_3% ； (3)将浒苔汁液放入捣碎机，给捣碎机加入抽提液和缓冲液，捣碎抽提后将悬浮液过滤，得到的滤液为浒苔蛋白酶的粗抽提液； 所述抽提液制备方法:按照IL蒸馏水加入0.5-2g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的氯化钠NaCI溶液中加入0.1-0.3g氯化钾；按照IL蒸馏水配置的所述抽提液用于加入100克的浒苔汁液中； 所述缓冲液制备方法:按照IL蒸馏水加入0.3-1.5g三羟甲基甲烷，配置三羟甲基甲烷溶液，按照IL蒸馏水配置的所述缓冲液用于加入100克的浒苔汁液中； (4)在0-2°C，将固体硫酸铵加入所述的粗抽提液中，搅拌，至溶液饱和度35-45%，离心后弃上清液，得到浒苔蛋白酶溶液； (5)将浒苔蛋白酶溶液装入透析袋中，将透析袋浸泡在0.5-2mol/L乙酸溶液中进行脱盐处理； (6)给脱盐处理后的浒苔蛋白酶溶液中加入罗氏蛋白酶抑制剂，冰浴冷却，再加入氯丁橡胶，搅拌，离心，得沉淀，沉淀再用重量百分比浓度为45-90%的NaHCO3溶液洗脱，搅拌，离心后再次得到沉淀； 所述蛋白酶抑制剂用量为:每100克的浒苔汁液中对应加入0.05-0.1ml蛋白酶抑制剂； 所述氯丁橡胶的用量为:每100克的浒苔汁液中对应加入20-30mg氯丁橡胶； 所述45-90%的NaHCO3溶液用量为:每100克的浒苔汁液中对应加入5_10g NaHCO3溶液； (7)将步骤(6)最终得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在23-25°C室温下放置60-120min生成结晶，所得到的结晶为浒苔蛋白酶； 所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液按照IOOmL蒸馏水加入0.1-0.3gN-乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，按照IOOmL蒸馏水配置的所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液用于加入100克的浒苔汁液中。
2.根据权利要求1所述的浒苔蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂选自乙二胺四乙酸、a2-巨球蛋白、B.Μ.综合酶片或罗氏蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的浒苔蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中还包括: 选择的浒苔为:打捞后到使用< 2天，自然温度打捞后，浒苔的加工温度为20-37°C;通过IOOkpa高压水清洗浒苔，去除沙石，时间20-30分钟。
4.根据权利要求3所述的浒苔蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中: 对清洗的浒苔进行自然漏水处理: 将冲洗后的浒苔平整堆放在漏水架上，每层漏水架设置接水底盘，每层浒苔厚度15-25cm，所述剪切的浒苔的长度和宽度为1-1.5cm。
5.根据权利要求1所述的浒苔蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述浸泡的时间为l_2h。
6.根据权利要求1所述的浒苔蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述透析袋为玻璃纸透析袋。
7.根据权利要求1所述的浒苔蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述冰浴冷却的时间为10-15min，加入氯丁橡胶的搅拌时间为5_10min，加入NaHCO3的搅拌时间为2-16min。
8.根据权利要求1所述的浒苔蛋白酶的制备方法，其特征在于，将步骤(7)的得到的结晶在4°C的条件下放置8-16h，结晶长大，冷冻离心收集结晶。
9.根据权利要求1所述的浒苔蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述氯丁橡胶选自氯丁橡胶CR322、氯丁橡胶CR2442或氯丁橡胶CR121。
10.根据权利要求1-9任一项所述的浒苔蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述浒苔蛋白酶在O °c冰箱保存。
【文档编号】C12N9/50GK103589704SQ201310496220
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2012年12月27日
【发明者】王慧芳, 李春雁 申请人:青岛海芬海洋生物科技有限公司