碱性果胶酶基因工程菌及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及碱性果胶酶基因工程菌及其构建方法，工程菌的保藏编号CCTCC?NO:?M2013393，而碱性果胶酶基因能够在本发明的碱性果胶酶基因工程菌中进行活性表达，优化后胞内酶活为89.5U／mL，胞外酶活为2.5U／mL。
【专利说明】碱性果胶酶基因工程菌及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，尤其涉及碱性果胶酶基因工程菌及其构建和分析。
【背景技术】
[0002]果胶酶(pectinase)是一类分解果胶质的酶的总称，是含有多种组分的复合酶。果胶酶广泛分布于高等植物和微生物中，但从植物中提取受到资源、技术水平的诸多限制而一直未能真正实现产业化，因此微生物来源的果胶酶成为研究热点。国内外对酸性果胶酶的研究已经具有一定基础，但是对碱性果胶酶尤其是果胶裂解酶(pectate lyase)的研究报道较少。
[0003]碱性果胶酶是指最适作用pH在碱性范围内的果胶酶，是果胶酶研究领域中的新兴内容，主要应用于纺织工业中用作对环境友好的生物催化剂，用柔和的酶生物精练代替传统的碱高温蒸煮技术，实现绿色清洁生产，既可减少碱排放污染，又可降低加热能耗和漂洗用水量，同时提高纺织物的加工和使用性能。因而随着生物技术的不断快速发展，碱性果胶酶在纺织工业中的应用潜力也越来越受到大家的关注。
[0004]从1972年Horikoshi，K.发表第一篇关于芽孢杆菌生产碱性果胶酶的论文开始，日本等国开始致力于碱性果胶酶的研究。印度Mukesh Kapoor于2001年报道了 Bacillussp.MG-cp-2碱性聚半乳糖醛酸酶的生产、纯化和酶学性质，确定该菌株发酵活力为47u /mL，培养基优化后活力提升为98u / mL，室温时在pH7.0~12.0范围内稳定，可有效应用于芒麻和菽麻纤维脱胶；德国学者2004年测定了果胶酶菌种Bacillus IicheniformisDSM13的基因组序列。美国、荷兰、英国、西班牙等国的学者也分别对碱性果胶酶的菌种资源、发酵、纯化方法、酶学性质、分泌调控及分子生物学等内容进行了报道，研究对象除了上述芽孢杆菌之外，还包括一些植物病原菌，如菊欧文氏菌、洋葱伯克霍尔德菌等。
[0005]为了获得高产，优质的碱性`果胶酶产品，自1990年以来，国外学者把研究重点从筛选产碱性果胶酶菌种方面逐步转向产酶基因及基因工程菌的研究上，尤其是随着1999年丹麦Novo Nordisk (诺和诺德)碱性果胶酶Bioprep (是一种基因改良的芽孢杆菌经发酵制成的酶制剂，其最适pH值为7.5~9.5，适用温度为55°C左右)和碱性果胶裂解酶ScourzymeL (最佳pH值为7.5~9.5,对温度的选用则根据pH值而定,如pH值在8~8.5时，温度掌握在55°C~60°C )的产品问世，人们将注意力越来越多地转向了酶基因及其克隆技术的研究。西班牙、法国、荷兰、日本学者分别将Bacillus sp.(2000年)、Erwinia chrysanthemi3937> Thermotoga maritima (海栖热袍菌，2OO3 年)、Bacillussubtilis (2002年)四种菌株的碱性果胶酶基因克隆到大肠杆菌中成功进行了表达。
[0006]国内对果胶酶的研究始于20世纪60年代，1990年初开始对碱性果胶酶进行研究，大量文献对果胶酶菌种的筛选、传统诱变育种、生产工艺和酶的工业应用等方面做了报道，但关于碱性果胶酶的发酵、酶制剂制备和分子生物学遗传育种方面的研究内容较少。菌种主要是芽孢杆菌，如吉氏芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌N0.46、XZ2、B13、LH-16、WSHB04-02以及小芽孢杆菌WSH03-09、RK9等，此外还有嗜盐嗜碱菌Alkalibacteriumsp.F26等。2006年我国学者K东晓等将Clostridium stercorarium(耐热梭状芽孢杆菌)的耐热果胶裂解酶基因pel9A克隆到表达载体ρΕΤ28α然后转化大肠杆菌进行表达；同年，诸葛斌等利用温控载体构建了碱性果胶酶工程菌。越来越多的研究单位在基因工程菌应用于工业生产的总体趋势下进行了碱性果胶酶分子生物学操作的有效尝试，大多分子生物学操作或以大肠杆菌表达体系为主要内容，或以枯草芽孢杆菌表达体系为研究对象，但大多载体和宿主的选择在以生产为目的时均显示了某种不足，例如温控载体和穿梭质粒的使用会因表达中需要温度、诱导剂等条件而增加生产成本。
[0007]我国碱性果胶酶研究总体起步较晚，在国外酶制剂公司80%的工业用酶都是由基因工程菌发酵生产获得，发酵酶活较高、酶学性质优良的酶制剂工业生产背景下，必须进行基因工程菌构建体系和方法的研究以拓宽民族工业酶制剂的竞争和发展空间。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌来源的碱性果胶酶的基因工程菌及其构建方法，并对其基因进行分析。
[0009]本发明采取的技术方案是:
[0010]一种碱性果胶酶基因工程菌，是将出发菌株枯草芽孢杆菌碱性果胶酶基因连接在表达载体pET22b (+)上，并采用电击方法转化大肠杆菌得到的工程菌株。
[0011]而且，所述枯草芽孢杆菌为B.subtilisl68，其碱性果胶酶基因的大小为1263bp。
[0012]一种碱性果胶酶基因工程菌的构建方法，构建方法包括如下步骤:
[0013](I).以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，设计特异的PCR引物，扩增碱性果胶酶基因；
·[0014](2).将目的基因酶切后与载体连接，命名重组质粒为pET-pelG2 ；
[0015](3).重组质粒pET-pelG2在DH5 α中克隆后转化大肠杆菌表达宿主，构建碱性果胶酶基因工程菌BL21 / PET-PelG2，最终获得大肠杆菌碱性果胶酶基因工程菌。
[0016]而且，所述步骤[I]中用于PCR其中上游引物5’端AAGCTT为HindIII酶切位点，保护碱基CCC ;下游引物5’端CTCGAG为XhoI酶切位点，保护碱基CCG。
[0017]而且，所述步骤[2]中pET22b(+)分子量5493bp，pET_pelG2大小为6747bp，载体上转录起始密码子与目的基因上转录起始密码子之间相距51bp。
[0018]本发明的优点和积极效果是:
[0019]1、本发明探索了碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的转化和表达条件，构建了枯草芽孢杆菌来源的碱性果胶酶基因的工程菌株，建立了工程菌发酵产酶的工艺，分析了枯草芽孢杆菌碱性果胶酶基因的表达特性和分子生物学可操作性，可以指导碱性果胶酶基因构建芽孢杆菌基因工程菌的操作。
[0020]2、分析了枯草芽孢杆菌中碱性果胶酶基因及其蛋白组成，结构和性质，有利于该菌株来源的碱性果胶酶的发酵、纯化等系列生物学操作。
[0021]3、野生菌株的果胶酶是复合酶系，通过选用成熟的大肠杆菌表达体系，可以针对其中一种碱性果胶酶基因进行快速克隆和表达，从而能够在非纯化条件下测定单一碱性果胶酶的酶学性质，有利于对碱性果胶酶基因资源的筛选和利用。【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是本发明基因工程菌中pET-pelG2的酶切验证电泳图，其中:1.pET_pelG22.Marker ；
[0023]图2是本发明基因工程菌BL21 / pET-pelG2对照未诱导菌株的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中:1.Marker2.PELG2(诱导)3.PELG2(诱导优化)4.CK(未诱导)；
[0024]图3是本发明基因工程菌BL21 / pET-pelG2对照携带空质粒菌株BL21 /pET22b (+)的碱性果胶酶的酶活平板显影图(刚果红染色)，其中:a.BL21 / pET22b (+)对照b.BL21 / pET-pelG2微生物信息
[0025]本发明的一个优选实施方式以及【具体实施方式】中所使用的碱性果胶酶基因工程菌BL21 / PET-PelG2已经保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名:大肠杆菌BL21 (pET-pelG2)
Escherichia coli BL21 (pET_pelG2)，保藏编号 CCTCC N0.M2013393，保藏地址为:中国武汉武汉大学，保藏日期为2013年9月6日。
[0026]下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0027]一、碱性果胶酶基因工程菌的构建
[0028]从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(保藏单位:中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号:CICC10027)中分离出碱性果胶酶基因，设计引物(引物由上海invitrogen生物有限公司合成)，以pET22b (+)为载体，以大肠杆菌DH5 α为克隆宿主，BL21为表达宿主。
[0029]1、PCR扩增目的基因
[0030]根据枯草芽孢杆菌碱 性果胶酶的基因序列兼顾考虑pET22b(+)载体多克隆位点的基因序列设计引物GE2。
[0031 ] GE2UP:5' -CCCAAGCTTATGAAAAAAGTGATGTTAGC-3'
[0032]GE2DOffN:5/ -CCGCTCGAGTTAATTTAATTTACCCGCAC-3
[0033]GE2引物扩增的枯草芽孢碱性果胶酶基因命名为PelG2
[0034]其中上游引物5’端AAGCTT为HindIII酶切位点，保护碱基CCC ;下游引物5’端CTCGAG为XhoI酶切位点，保护碱基CCG。
[0035]以枯草芽孢杆菌的总DNA为模板进行PCR扩增,在0.5mL Eppendorf管中按以下顺序分别加入各试剂:
[0036]扩增体系(50μ L):ddH2037 μ L, 10Xbuffer5.0 μ L，dNTPs (2.5mmol / L) 5.0 μ L，上游引物 GE UPdOymol / L) 0.75 μ L，下游引物 GE D0WN(10ymol / L) 0.75pL，DNA 模板1.0 μ L, Pyrobest 高保真 DNA 聚合酶 0.5 μ L ;
[0037]pelG2 扩增程序:95°C 5min, I 个循环；94°C 45s，49°C 45s，72°C 90s, 30 个循环；72°C lOmin, I 个循环。
[0038]2、重组质粒的构建和转化
[0039](I).将PCR扩增得到的目的基因PelG2分别用HindIII和XhoI双酶切，酶切产物经DNA纯化试剂盒(该试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司)纯化。
[0040](2).将pET22b (+)质粒(该质粒购自TAKARA公司)经HindIII和XhoI双酶切、纯化后与第(I)步的纯化产物通过连接试剂盒(该试剂盒购自TAKARA公司)在16°C的条件下连接12h,得到重组质粒pET-pelG2。
[0041]pET22b (+)大小为5493bp，pET_pelG2分子量为6747bp，载体上转录起始密码子与目的基因上转录起始密码子之间相距51bp。
[0042]双酶切体系:10XHbuffer2 μ L, DNA / pET22b (+) 8 μ 1，HindIIIl.2 μ L，XhoIl.2μ L，ddH207.6 μ L。37°C酶切过夜，目的基因酶切产物直接回收，质粒酶切产物电泳后切胶回收。
[0043]连接体系:50111衍01115 4 1^，载体0嫩14 1^，目的基因4 4 1^，161:作用12h。
[0044](3).将10μL的，pET-pelG2电转化40μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素(50 μ g / mL)的LA平板上，从抗性平板上挑选抗性菌落进行HindIII和XhoI双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。阳性克隆子提取质粒转化大肠杆菌BL21感受态，双重平板法筛选得到一株工程菌株BL21 / pET_pelG2，该菌株已经保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO:M20133939。 [0045]3、碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的表达
[0046]将验证正确工程菌株BL21 / pET-pelG2，与对照菌BL21 / pET22b (+)分别接种于液体发酵培养基中IPTG诱导表达，离心收集细胞制备电泳检测样品，并测定样品酶活性。
[0047]二、发酵培养及样品制备
[0048]在LA培养基上培养24h，挑取活化的BL21 / pET_pelG2接种到LB培养基中，装液量50mL / 250mL三角瓶，37°C，200r / min发酵培养4h细胞浓度OD6tltl达到1.2时加入lmmol / L IPTG，30°C诱导培养5h后收集细胞制备电泳检测样品，并测定样品酶活性。
[0049]电泳样品制备:取3mL培养液12000r/min离心收集菌体，重悬于250 μ L ρΗ9.0的Gly-NaOH-CaCI2缓冲液中，-80。。和37°C反复冻融3次，12000r / min离心IOmin取上清。用3倍体积丙酮室温沉淀蛋白lh，离心收集蛋白溶于30 μ L电泳上样缓冲液，用于蛋白电泳检测，以非IPTG诱导的大肠杆菌工程菌做对照。
[0050]酶活测定样品制备:取2mL培养液12000r / min离心收集菌体，重悬于100 μ LpH9.0的Gly-NaOH-CaCl2缓冲液中，加入溶菌酶(50mg / mL) 10 μ L，离心保留上清液，测定碱性果胶酶活。
[0051]三、碱性果胶酶活力的测定
[0052]酶活力单位定义:lmL酶液在45°C，pH为9.0条件下，每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生I μ mo I的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。
[0053]测定方法酶液制备:果胶酶菌种经发酵培养结束后，8000转离心5分钟，取上清液。用缓冲液稀释不同倍数，和原液平行测定；酶活测定方法:反应体系中包括粗酶稀释液20 μ L，0.2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH(0.2moI / L)缓冲液(pH9.0，含有0.44mmol /L的CaCl2) 2mL,反应条件为45°C温育15min，用3mL0.03mol / L的磷酸终止反应，在235nm处测定其吸光度值。酶空白:将2mL上述缓冲体系配制的底物保温2min后，依次加入3mL0.03mol / L的磷酸和20 μ L与实验样相同稀释倍数的灭活的酶液，混匀。其他操作与
实验样相同。
[0054]
【权利要求】
1.碱性果胶酶基因工程菌，其特征在于所述工程菌的保藏编号CCTCCN0.M2013393，保藏地址为:中国武汉武汉大学，保藏日期为2013年9月6日；或者是与CCTCC N0.M2013393的碱性果胶酶基因工程菌具有95%以上亲缘性的碱性果胶酶基因工程菌。
2.一种如权利要求1所述的碱性果胶酶基因工程菌的构建方法，其特征在于:构建方法包括如下步骤: (1).以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，设计特异的PCR引物，扩增碱性果胶酶基因； (2).将目的基因酶切后与载体连接，命名重组质粒为pET-pelG2； (3).重组质粒PET-PelG2转化大肠杆菌克隆宿主DH5α，构建碱性果胶酶基因工程菌DH5a / pET-pelG2，提取阳性质粒进一步转化大肠杆菌表达宿主，最终筛选获得大肠杆菌碱性果胶酶基因工程菌。
3.根据权利2要求所述的 碱性果胶酶基因工程菌的构建方法，其特征在于:所述步骤[I]中用于PCR上游引物5’端AAGCTT为HindIII酶切位点，保护碱基CCC ;下游引物5’端CTCGAG为XhoI酶切位点，保护碱基CCG。
4.根据权利3要求所述的碱性果胶酶大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于:所述步骤[2]中pET22b (+)分子量为5493bp，DH5 a / pET_pelG2大小为6747bp，载体上转录起始密码子与目的基因上转录起始密码子之间相距51bp。
5.权利要求1所述的碱性果胶酶基因工程菌在制备碱性果胶酶中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK103589675SQ201310496223
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月18日 优先权日:2013年10月18日
【发明者】肖静, 王瑞明, 李丕武 申请人:齐鲁工业大学