一种利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物抗病育种领域，具体涉及一种利用植物抗病基因富集簇的分子育 种方法。
【背景技术】
[0002] 由于植物病害每年给农、林生产带来巨大的损失，合理有效地防治植物病害是保 障农、林可持续发展所必须解决的关键问题之一。大量实践证明，开发和利用已有的植物抗 病种质资源是防治植物病害最为有效的方法之一，其中又以植物抗病基因的开发与利用最 为经济有效。
[0003] 但到目前为止，国际、国内传统的抗病育种主要有两种途径：途径一，常规育种方 法，即将优质高产的品种与抗病性强的材料杂交，然后通过不断的回交选育，最后得到抗病 且优质的新品种。这一过程尽管有效，但极其耗时，因此当新品种培育出来之后，极可能对 病原菌新进化产生的株系或小种表现为感病。途径二：利用基因定位、克隆、转基因的途径， 目前利用最多的克隆方式为经典的图位克隆方法，即将抗病和感病的品种杂交，然后对大 量的分离后代接种病菌、鉴定抗性、遗传作图等，最后在精确遗传定位的基础上进行克隆； 这种方法虽然取得了一定的效果，但同样存在克隆周期长、费时费力、分离和鉴定困难，难 于找到用于农业生产的有效基因。以水稻抗稻瘟病基因为例，到目前为止，全世界共克隆了 20多个抗稻瘟病基因，且尚无用于生产实际的报道。追溯其主要原因，我们认为，缺乏对植 物抗病基因抗病机制及田间持久抗性机制的认知所致。
[0004] 植物抗病基因是植物与病原菌长期相互作用的结果，在植物的进化过程中扮演着 十分重要的角色。近年来，植物抗病分子机制的研究取得了突破性进展，但从生产实践的 角度看，目前植物抗病基因的研究存在三个根本问题：一是能否发现抗病基因的高效克隆 方法；二是究竟能否找到广谱高抗的基因；三是多少抗病基因才能使一个品种具有田间抗 性，从而使这些基因用于育种实践。由于克隆的抗病基因数量太少，因而尚不知道一个基因 组有多少抗病基因？在高抗品系中是否存在广谱高抗的基因？决定品种抗性的究竟是几 个主效抗病基因，还是许多个抗不同病菌小种基因的组合？这些基本问题不清楚，就不知 道抗病基因抗性变化及其在基因组中分布的规律性，很难实现抗病基因的实用化。
[0005] 我们另辟新径，提出了以植物与病菌共进化为基础的抗病基因克隆方法，专利申 请号：201210453400. 9。该方法的基本假设为，为了对付快速进化的病菌，寄主的抗病基因 位点的进化也更快。反之，植物对付进化较慢的病菌（或病菌的基因），其相应抗病基因进 化也较慢。我们以水稻稻瘟病的抗性为例进行了研究，通过各种遗传参数的计算，从而估计 每一个基因位点的进化速度，在水稻基因组500多个NBS-LRR基因位点中，选出了 130多个 进化快的位点；在10个高抗品系中系统的克隆这些位点的基因，共克隆了约1000个候选抗 病基因；通过遗传转化到感病品系，最后用不同小种的稻瘟病菌鉴定其抗性。最终，我们一 共获得168个功能性抗稻瘟病基因，其中含27个抗谱广、抗性强的抗稻瘟病基因。
[0006] 通过对抗病基因在各个品种基因组的遗传定位分析，发现多个高抗广谱的基因位 于某个高抗品种的同一个基因簇中，即抗稻瘟病基因的富集簇。这些抗病基因的富集簇，不 仅为指导我们利用抗病基因富集簇进行分子抗病育种提供了理论基础，同时由于我们非常 清楚这些富集簇的染色体位置、序列、来源品系等，为我们进行快速的抗病育种提供了可靠 的原材料。
[0007] 目前克隆的基因，还没有用于生产的成功例子。一个突出的问题是：从抗性很好的 水稻供体品系中克隆的基因，其抗谱和抗性均欠佳。抗稻瘟病的基因Pi2/9就是突出的例 子，其供体抗谱很广，但克隆的pi2/9单个基因的抗性则相对有限。这种现象暗示，一个抗 病品种中可能含有多个抗稻瘟病基因。要使抗稻瘟病基因用于实际生产，不仅需要一定数 量的广谱高抗基因，而且需要把他们组合到一起。因此，定位育成的品种，多了 5-10个广谱 高抗的基因，抗性强或抗性得到加强，使之可以在生产上继续使用。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种稻瘟病性强的利用植物抗病基因富集簇 的分子育种方法及其应用。
[0009] 为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明提供了一种利用植物 抗病基因富集簇的分子育种方法，包括如下步骤：
[0010] (1)抗稻瘟病基因富集簇的挖掘与功能验证：筛选含抗稻瘟病基因的候选基因 簇，选择15-20个高抗稻瘟病的水稻品系；
[0011] 对候选富集簇的每一个基因进行克隆，通过遗传转化这些基因到感病品系，最后 用不同小种的稻瘟病菌鉴定其抗性；筛选2个或多于2个抗病基因的富集簇，其中包括广谱 尚抗的基因；
[0012] (2)挑选抗病基因位点：挑选可靠的抗病基因富集簇，只需一个标记，即一个单 位，就代表了 2个或更多的抗病基因，选择1个或多个富集簇作为导入对象；
[0013](3)培育中介品种：每一个富集簇，都来源于一个特定抗源品系，不同的富集簇， 来源于同一抗源或来自不同抗源；
[0014] 这些抗源与数个具备优良农艺性状的水稻品种杂交获得"中介品种"，使每一个中 介品种含有1个或多个富集簇，平均5个以上抗稻瘟病基因；
[0015] 中介品种的富集簇区段要保证纯合，其余则无需纯合，可以自交繁殖；
[0016] 对中介品种和抗源亲本均需全基因组测序来获取高密度标记；
[0017] 优良的中介品种也可直接作为抗病的优良品种；
[0018] (4)筛选目的品种：在广泛推广的高产优质但抗稻瘟病欠佳；或开始丧失抗性的 优良品种中；或在区试中表型优异但抗稻瘟病欠佳的品系中，选择数十个目的品种作为抗 病性改造对象，对每一个目的品种全基因组测序并与中介品种比较，从而在每一个Mb的染 色体上找到3-5个特定遗传标记；
[0019] (5)定位选育抗病品种：对每一个目的品种都与1-2个中介品种杂交并回交，对回 交子代幼苗提取DNA，用PCR检测96遗传标记，大约每3个Mb -个标记；
[0020] 选择具有富集簇标记，但其余标记均为目的品种的株系；再回交1-2次，用更多标 记进行检测，保证除了富集簇标记而外，均为目的品种的遗传标记；
[0021] 同时，观察育成品种优良农艺性状是否保持；最后，观察育成品种的表型是否抗性 变强。
[0022] 进一步地，在步骤（1)中，筛选含抗稻瘟病基因的候选基因簇，根据NBS-LRR基因 簇数量、进化速率、品种间同一基因簇拷贝数量变化及核苷酸差异度遗传特征来进行挑选。
[0023] 进一步地，在步骤（1)中，水稻品系为Tetep，谷梅2号，Moroberekan、LAC23或PAI KAN TA0〇
[0024] 更进一步地，在步骤（3)中，挑选具备优良性状的水稻品种，将其与含富集簇的抗 源品系进行杂交，得到富集簇区段纯合的中介品种。
[0025] 进一步地，在步骤（4)中，目的品种和中介品种每Mb染色体上为特定遗传标记。
[0026] 本发明所述的含多个抗病基因的富集簇，其包含的稻瘟病抗性基因的核苷酸序列 分别如SEQIDN0:1-15所示。
[0027] 本发明含有所述的稻瘟病抗性基因的载体。
[0028] 本发明所述的稻瘟病抗性基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0:16-30。
[0029] 本发明所述的稻瘟病抗性基因在制备转基因抗稻瘟病水稻的应用。
[0030] 本发明所述的载体用于转化水稻从而制备转基因抗稻瘟病水稻中的应用。
[0031] 有益效果：本发明的分子育种方法得到的水稻的稻瘟病性强并能保持优良农艺性 状，选育成的仅含富集簇标记和目的品种遗传标记的抗病品种，最终育成的高产、优质、抗 病的新水稻品系。利用植物抗病基因富集簇的分子育种，可望与高产优质品种相结合，避开 转基因技术，实现作物抗病育种方法的突破，形成一套全新、高效的作物育种体系。可以供 其他农艺性状精准定位育种借鉴与应用；抗病基因在育