orthegrisea)-RMg-(]4。RMg-Cl 包含 5 个抗稻痕病基因（0sllg44960，0sllg44970， 0sllg45090, 0sllg45160, 0sllg45190)，其中有 2 个是广谱高抗基因（0sllg44960 和 0sllg45190) ;RMg-C2 包含 4 个抗稻瘟病基因（0sllg39320, 0sllg39330, 0sllg39340， 0sllg39730)，其中有2个是广谱高抗基因（0sllg39320和0sllg39730) ;RMg-C3包含2个 广谱高抗的基因（0s06g06380和0s06g06390) ;RMg-C4包含2个抗稻瘟病基因（0s06gl5730 和0s06gl5750)，其中0s06gl5750具有广谱抗性。有一个富集簇来自于新育成的抗性栽培 种Q2436,包含1个抗稻瘟病基因（0s08g07340和0s08g07390)，其中08g07340具有广谱抗 性，我们将这个抗病基因富集簇命名为RMg-C5RMg-Cl，C2, C3, C4和C5所含抗病基因的核苷 酸序列见序列表SEQ ID NO: 1-15,所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列表分别如SEQ ID NO: 16-30所示。挑选其中两个富集簇RMg-Cl和RMg-C5为实例进行后续的抗病育种。C5 来自Q2436 ;
[0068] 在前期的研究中，我们已经获得了 168个功能性抗稻瘟病基因，其中包含27 个抗谱广、抗性强的基因。经分析获得5个抗稻瘟病基因的富集簇。专利【申请号】 201210453400. 9,提到了前期研究。
[0069] (2)抗病基因富集簇位点的确定：对两个抗源品种Tetep和Q2436进行全基因组 测序。用生物信息学的方法（包括序列比对，遗传参数的计算等）分析RMg-Cl和RMg-C5 这两个基因簇的序列特征，及其遗传标记。
[0070] (3)培育中介品种：将含RMg-Cl的Tet印与我们挑选的优良品种"武运粳24"杂 交，获得F1-1 ;将含RMg-C5的Q2436与优良品种"武运粳24"杂交，获得F1-2 ;将F1-1与 F1-2杂交再自交，通过遗传标记的鉴定，筛选出同时含RMg-Cl和RMg-C5的中介品种，而且 保证导入的富集簇区段纯合。对获得的中介品种利用二代测序的方法进行全基因组测序。
[0071] (4)筛选目的品种：挑选高产、优质、推广潜力大，但抗稻瘟病较差或抗病性开始 丧失的推广品种或优良品种作为抗病性改造对象即目的品种，本实施例采用"空育131"。从 全国各地挑选这些品种：高产、优质、推广潜力大，但抗稻瘟病较差或抗病性开始丧失的推 广品种或优良品种，任何一种都可以作为我们的改造对象。对挑选的目的品种进行全基因 组测序，同时与培育的中介品种的基因组序列进行比较，在每一个Mb的染色体上找到3-5 个特定的遗传标记。
[0072] (5)定位选育抗病品种：将空育131与培育的中介品种进行杂交并回交，对回交子 代幼苗提取DNA，用PCR检测96遗传标记，大约每3个Mb -个标记。选择具有富集簇标记， 但其余标记均为目的品种的株系；再回交1-2次，用足够的遗传标记进行检测，保证除了富 集簇标记而外，均为目的品种的遗传标记。同时，在田间种植育成的品种，观察其表型是否 抗性变强、优良农艺性状是否保持。
[0073] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明 要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
【主权项】
1. 一种利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 抗稻瘟病基因富集簇的挖掘与功能验证：筛选含抗稻瘟病基因的候选基因簇，选 择15-20个高抗稻瘟病的水稻品系； 对候选富集簇的每一个基因进行克隆，通过遗传转化这些基因到感病品系，最后用不 同小种的稻瘟病菌鉴定其抗性；筛选2个或多于2个抗病基因的富集簇，其中包括广谱高抗 的基因； (2) 挑选抗病基因位点：挑选可靠的抗病基因富集簇，只需一个标记，即一个单位，就 代表了 2个或更多的抗病基因，选择1个或多个富集簇作为导入对象； (3) 培育中介品种：每一个富集簇，都来源于一个特定抗源品系，不同的富集簇，来源 于同一抗源或来自不同抗源； 这些抗源与数个具备优良农艺性状的水稻品种杂交获得"中介品种"，使每一个中介品 种含有1个或多个富集簇，平均5个以上抗稻瘟病基因； 中介品种的富集簇区段要保证纯合，其余则无需纯合，可以自交繁殖； 对中介品种和抗源亲本均需全基因组测序来获取高密度标记； 优良的中介品种也可直接作为抗病的优良品种； (4) 筛选目的品种：在广泛推广的高产优质但抗稻瘟病欠佳；或开始丧失抗性的优良 品种中；或在区试中表型优异但抗稻瘟病欠佳的品系中，选择数十个目的品种作为抗病性 改造对象，对每一个目的品种全基因组测序并与中介品种比较，从而在每一个Mb的染色体 上找到3-5个特定遗传标记； (5) 定位选育抗病品种：对每一个目的品种都与1-2个中介品种杂交并回交，对回交子 代幼苗提取DNA，用PCR检测96遗传标记，大约每3个Mb -个标记； 选择具有富集簇标记，但其余标记均为目的品种的株系；再回交1-2次，用更多标记进 行检测，保证除了富集簇标记而外，均为目的品种的遗传标记； 同时，观察育成品种优良农艺性状是否保持；最后，观察育成品种的表型是否抗性变 强。2. 根据权利要求1所述的利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法，其特征在于：在 步骤⑴中，筛选含抗稻瘟病基因的候选基因簇，根据NBS-LRR基因簇数量、进化速率、品种 间同一基因簇拷贝数量变化及核苷酸差异度遗传特征来进行挑选。3. 根据权利要求1所述的利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法，其特征在于：在 步骤（1)中，水稻品系为Tet印，谷梅2号，Moroberekan、LAC23或PAI KAN TAO。4. 根据权利要求1所述的利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法，其特征在于：在 步骤（3)中，挑选具备优良性状的水稻品种，将其与含富集簇的抗源品系进行杂交，得到富 集簇区段纯合的中介品种。5. 根据权利要求1所述的利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法，其特征在于：在 步骤（4)中，目的品种和中介品种每Mb染色体上为特定遗传标记。6. 权利要求1所述的含多个抗病基因的富集簇，其包含的稻瘟病抗性基因的核苷酸序 列分别如SEQ ID NO: 1-15所示。7. 含有权利要求6所述的稻瘟病抗性基因的载体。8. 权利要求6所述的稻瘟病抗性基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:16-30。9. 权利要求6所述的稻瘟病抗性基因在制备转基因抗稻瘟病水稻的应用。10. 权利要求7所述的载体用于转化水稻从而制备转基因抗稻瘟病水稻中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法及其应用，利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法包括如下步骤：(1)抗稻瘟病基因富集簇的挖掘与功能验证；(2)挑选抗病基因位点；(3)培育中介品种；(4)筛选目的品种；(5)定位选育抗病品种。本发明所述的含多个抗病基因的富集簇，其包含的稻瘟病抗性基因的核苷酸序列分别如SEQ？ID？NO:1-15所示。本发明含有所述的稻瘟病抗性基因的载体。本发明所述的稻瘟病抗性基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO:16-30。本发明所述的稻瘟病抗性基因在制备转基因抗稻瘟病水稻的应用。本发明的分子育种方法得到的水稻的稻瘟病性强并能保持优良农艺性状。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/11, A01H5/00, C12Q1/68, C07K14/415
【公开号】CN105063206
【申请号】CN201510483647
【发明人】田大成, 杨四海, 张小辉
【申请人】南京大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月3日