一种用于人参实时荧光pcr检测的引物、探针及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，本发明针对人参(/5.ginseng) 18S rRNA基因序列设计并筛选出的一组特异引物和探针及其使用方法，用于人参的实时荧光PCR方法特异性检测。
【背景技术】
[0002]人参(H，被人们称为“百草之王”，具有大补元气、补脾益肺、生津止渴、安神益智等功效，是我国应用最广泛的名贵中药材，分布于我国东北、俄罗斯远东地区及朝鲜等地。近年来，随着人们“回归自然”的迫切需求和中草药市场的国际化，对人参等药用植物的利用不再局限于传统的入药治病，而广泛应用于饮食、保健、畜禽业等人类生活的各个方面，因而导致资源的过度开发利用，已有相当一部分珍贵药用植物资源受到严重破坏或濒临灭绝，与此同时，市场上伪混品当道，使用野红豆根、商陆根、紫茉莉根、栌兰根等冒充人参的现象屡见不鲜，严重危害消费者的利益，亟待建立准确快速的人参检测技术。
[0003]人参类中药的传统鉴定方法为基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。传统鉴定方法的理论基础建立于分类群的性状特征分析，这些性状特征是与环境紧密相关的表现型。从分子遗传学角度来看，物种表现型的差异归根结底应追溯到基因型的差异，即在DNA序列上的差异。因此，对基因组序列差异的比较研究无疑为植物分类和鉴定提供了本质依据。随着生命科学不断取得重大突破，分子生物学鉴定方法应运而生，此类方法应用DNA分子标记技术鉴定中药原植物及其药材和饮片，取得了快速发展。从1994年AP-PCR首次用于人参、西洋参的鉴别以来，DNA分子标记鉴别应用于参类药材鉴别已有不少的报道，RFLP、SSR、RAPD、AP-PCR、AFLP、ISSR、SNP等技术相继应用于参类药材的鉴别鉴定。然而，这些技术由于存在着操作步骤繁琐、工作量大、实验结果重复性差等弱点，难以在实际中得到应用而逐渐退出舞台。随着分子生物学的发展和后基因组时代的到来，一些新的技术为参类药材的鉴定提供了新的方法。
[0004]实时荧光PCR技术在物种鉴定上已经是非常成熟与成功的技术，利用一组特异性的引物探针，通过检测荧光强度变化来进行检测，特异性强、灵敏度高，可提高结果准确性，而且在数小时内即可完成检测，提高了工作效率。通过实时荧光PCR方法检测人参，特异性强，结果准确，具有良好的市场应用前景和推广应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供用于人参实时荧光PCR检测的引物探针序列及其检测方法。
[0006]一种用于人参实时荧光PCR检测的引物和探针，包括一对引物，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，以及探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.3。
[0007]利用上述引物和探针进行人参实时荧光PCR检测的检测方法，包括以下步骤:
I)制备待检模板DNA:用市售的磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取样品中的DNA ο
[0008]2) PCR反应体系:10 μ L 2 X荧光PCR反应预混液，0.4 μ L 10 μ mol/L的引物SEQID N0.1,0.4 yL 10 μ mol/L 的引物 SEQ ID N0.2,0.8 yL 10 μ mol/L 的 TaqMan 探针 SEQID N0.3,4 μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照或空白对照，灭菌去离子水4.4 μ L ;其中阳性对照采用人参基因组DNA，阴性对照采用西洋参基因组DNA，空白对照采用灭菌去离子水。
[0009]3)实时荧光 PCR 反应参数:第一步:95 V 30s ;第二步:95°C 5s，60°C 30s, 40个循环；60°C时设置FAM荧光通道采集荧光。
[0010]4)结果判定:在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，被检样品进行检测时:如果Ct值< 35.0，则判定为阳性；如果Ct值多40，则判定为阴性；如果35.0
<Ct值< 40.0，则重复一次，如果再次扩增后Ct值仍为< 40.0，则判定为阳性，如果再次扩增后Ct值多40，则判定为阴性。
[0011]上述引物和探针在制备人参实时荧光PCR检测用试剂盒中的用途。
[0012]采用本发明的引物和探针进行实时荧光PCR检测，相比于普通PCR方法，灵敏度要高1-2个数量级，特异性更强，整个检测能控制在2个小时内完成，大大缩短检测时间。相较于化学方法，操作简便，价格相对较低，检测难度较低。本方法特异性强，灵敏度高，结果准确，具有良好的市场应用前景和推广应用价值。
【附图说明】
[0013]图1为应用本发明设计的引物探针所建立的实时荧光PCR特异性实验检测图；
图2为应用本发明设计的引物探针所建立的实时荧光PCR灵敏度实验检测图。
【具体实施方式】
[0014]实施例1:引物、探针的设计和合成
参照GenBank中人参属物种基因序列，挑选种内保守、种间特异的18S序列(GenBankN0.KC593817.1)，针对该基因，利用软件primer Express3.0设计引物及探针，最后经过比较筛选确定的引物和探针的序列为:
SEQ ID N0.1:CACGGGGAGGTAGTGACAATASEQ ID N0.2:AGACTTGCCCTCCAATGGATSEQ ID N0.3:FAM-CGGGCTGATTCAGTCT-MGB以上引物和探针由生物公司合成。
[0015]实施例2:本发明实时荧光PCR方法检测人参样品的具体操作
I)配制反应液:根据上述
【发明内容】
2所述，在试剂准备区配制PCR反应体系，各物质浓度体积如下:10yL 2 X荧光PCR反应预混液，0.4 yL引物SEQ ID N0.1 (10 μ mol/L),0.4 yL 引物 SEQ ID N0.2 (10 μ mol/L)，0.8 μ LTaqMan 探针 SEQ ID N0.3 (10 μ mol/L), ^菌去离子水4.4 μ L。试验设置两次重复，同时阳性对照、阴性对照和空白对照。
[0016]2)加模板:在样本区，每个反应加4 μ L模板DNA，阳性对照用人参基因组DNA，阴性对照用西洋参基因组DNA，空白对照用灭菌去离子水。盖上反应管盖。
[0017]3)实时荧光PCR检测:在检测区，将配制好的PCR反应管放到ABI StepOnePl μ S荧光PCR仪上，循环程序参数设定为:第一步:95 0C 30s ;第二步:95°C 5s,60°C30s, 40个循环。60°C时设置FAM荧光通道采集荧光。
[0018]4)结果判定:在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，被检样品进行检测时:如果Ct值< 35.0，则判定为阳性；如果Ct值多40，则判定为阴性；如果35.0
<Ct值< 40.0，则重复一次，如果再次扩增后Ct值仍为< 40.0，则判定为阳性，如果再次扩增后Ct值多40，则判定为阴性。
[0019]实施例3:实时荧光PCR方法的特异性试验
以人参近缘种以及常见伪混品的DNA作为模板，包括:白:E、北沙参、西洋参、三七、桔梗、川明参、玄参、党参、丹参、竹节参。以人参的DNA为阳性对照。结果显示，只有人参DNA检测为阳性，其余均为阴性，证明本发明的引物探针特异性良好。结果见附图1，扩增曲线为阳性对照及人参样品DNA。
[0020]实施例4:实时荧光PCR方法的灵敏度试验
用灭菌去离子水将提取的人参基因组DNA (初始浓度为3X 102pg/ μ L) 10倍梯度稀释成6个系列梯度，稀释后浓度分别为3 X 102pg/ μ L至0.003pg/ μ L，取4 μ L作为模板进行灵敏度检测。结果如附图2显示，0.03pg/μ L浓度以上均获得强的荧光信号，故最低检测限是0.12pg DNA/反应。
【主权项】
1.一种用于人参实时荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于:包括一对引物，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，以及探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.3。2.一种利用权利要求1所述引物和探针进行人参实时荧光PCR检测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)制备待检模板DNA:用市售的磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取样品中的DNA ； 2)PCR反应体系:10yL 2X荧光PCR反应预混液，0.4 μ L 10 μ mol/L的引物SEQ IDN0.1,0.4 yL 10 μ mol/L 的引物 SEQ ID N0.2,0.8 yL 10 μ mol/L 的 TaqMan 探针 SEQ IDN0.3,4 μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照或空白对照，灭菌去离子水4.4 μ L ; 3)实时荧光PCR反应参数:第一步:950C 30s;第二步:95°C 5s, 60°C 30s，40个循环；60°C时设置FAM荧光通道采集荧光； 4)结果判定:在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，被检样品进行检测时:如果Ct值< 35.0，则判定为阳性；如果Ct值彡40，则判定为阴性；如果35.0 < Ct值< 40.0，则重复一次，如果再次扩增后Ct值仍为< 40.0，则判定为阳性，如果再次扩增后Ct值多40，则判定为阴性。3.根据权利要求2所述人参实时荧光PCR检测方法，其特征在于:所述阳性对照采用人参基因组DNA，阴性对照采用西洋参基因组DNA，空白对照采用灭菌去离子水。4.权利要求1所述引物和探针在制备人参实时荧光PCR检测用试剂盒中的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种用于人参实时荧光PCR检测的引物、探针及其检测方法。本发明针对人参（<i>Panax</i><i>？ginseng</i>）18S？rRNA基因序列设计并筛选出的一组特异引物和探针，其核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.2以及SEQ？ID？NO.3，用于人参的实时荧光PCR方法特异性检测。以本发明所设计的引物探针采用实时荧光PCR方法检测，具有良好的特异性、灵敏度，能快速、方便、高效的检测中药材人参及其基原植物。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105063203
【申请号】CN201510479788
【发明人】孔德英, 孙涛, 滕少娜, 邓朝晖, 陆丽华, 蒋丹, 何玲
【申请人】重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月7日