的阳性植株，三泳道为3株不同株系 转基因植株。
[0018] 图3为阳性转基因植株与对照植株株花蕾青蒿素含量的数据统计数据图，图中， Vector表示对照，Dxr+Fpps表示候选转基因植株。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题 范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知 识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
[0020] 材料：采用高青蒿素含量的常规野生青蒿，2008年来源于重庆秀山县，在重庆医 药高等专科学校以高青蒿素为目标常规选育了 5代。
[0021] 菌株和质粒：E.coliJM109,pMD18-T载体，质粒载体pBI121,质粒载体 PCAMBIA2301,根瘤农杆菌C58C1。
[0022] 酶和化学试剂：DNATaq聚合酶、小牛肠碱性磷酸酶、T4-DNA连接酶购自Sigma公 司；限制性内切酶XbaI和SacI，限制性内切酶EcoRI和HindIII，PCRMarker购自亚 辉生物术公司，PCR引物由Sangon生物技术公司合成，随机引物标记试剂盒购自华美生物 技工程公司。
[0023] 分子生物学技术
[0024] 除另有说明外，所有分子生物学技术一般按SambrookT等在分子克隆实验手册 (SambrookT,TanaKaK,MonmaT.MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpring HarborLaboratorypress,NewYork, 1989)中提供的方法进行。
[0025] 步骤与结果：
[0026]DNA的提取。青蒿DNA提取参照文献[11]按照CTAB法从上部嫩片中提取，略有 改动。取嫩叶5g加液N研磨快速转入2mlEP管中，加lml65°C水浴预热的CTAB提取缓冲 液，混勾，3000r/min，离心10min.吸取上清液，加入酷：氯仿各0. 5ml溶液，离心15min;上 清液，加氯仿4°C离心15min，重复上述步骤除尽蛋白层为止。取上清液体，-20°C沉淀离心 151^11，用70%乙醇洗涤沉淀2次，-701：保存备用。
[0027] 下列实施例中未作特别说明的均按照常规实验条件进行，如分子克隆采取 SAMBROOK.T等编著的实验手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPreSS, 1989) 中描述条件，或采取制造厂商提供的试剂盒要求之条件进行。
[0028] 材料：植物材料：采用青蒿素含量相对高的青蒿（ArtemisiaeannieL.)品种。
[0029] 实验步骤：
[0030] l.Dxr基因片段的克隆，该Dxr基因片段的DNA序列为SEQIDNO. 1。
[0031] 包括两对引物，引物设计为：
[0032] 第一轮扩增用引物的上游引物SEQIDNO. 3 :
【主权项】
1. 共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法，其特征在于，包 括如下步骤： 1) 克隆脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶的基因片段，记为Dxr基因片段，并将Dxr基因片 段构建成Anti-Dxr基因植物表达载体； 2) 克隆法呢基二磷酸合酶的基因片段，记为Fpps基因片段，并将Fpps基因片段构建成 Anti-Fpps基因植物表达载体； 3) 利用转基因技术将Anti-Dxr和Anti-Fpps导入青蒿，获得包含Dxr基因和Fpps基 因的青蒿植株。
2. 根据权利要求1所述共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的 方法，其特征在于：所述步骤3)中将Anti-Dxr和Anti-Fpps分别导入不同的青蒿，分别获 得Dxr转基因青蒿与Fpps转基因青蒿，然后将Dxr转基因青蒿与Fpps转基因青蒿进行杂 交，获得包含Dxr基因和Fpps基因的F1代青蒿植株。
3. 根据权利要求1所述共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的 方法，其特征在于：所述步骤3)中采用电击法将Anti-Dxr和Anti-Fpps导入同一根癌农杆 菌EHA101，然后采用农杆菌介导法将所述癌农杆菌EHA101导入青蒿，构成包含Dxr基因和 Fpps基因的青蒿植株。
4. 根据权利要求1、2或3所述共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量 青蒿的方法，其特征在于：所述Dxr基因的DNA序列为SEQ ID NO. 1。
5. 根据权利要求4所述共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的 方法，其特征在于：扩增获得所述SEQ ID NO. 1序列所用的引物为： 第一轮扩增用引物的上游引物SEQ ID NO. 3 : 5r -TCGGCTCTCATCTCTTCTCTCTTTTCCT-3r 第二轮扩增用引物的上游引物SEQ ID NO. 4: 5r -TCCGTGGATCCGCAATCACATTTCTTAT-3r 第一轮扩增用引物的下游引物SEQ ID NO. 5 : 5，-CATCGAGCAAAGCGCGCCACT-3' 第二轮扩增用引物的下游引物SEQ ID NO. 6 : 5，-AAGCAGGATAGCCACAGA-3, 〇
6. 根据权利要求1、2或3所述共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量 青蒿的方法，其特征在于：所述Fpps基因的DNA序列为SEQ ID NO. 2。
7. 根据权利要求6所述共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的 方法，其特征在于：扩增获得所述SEQ ID NO. 2序列所用的引物为： 第一轮扩增用引物的上游引物SEQ ID NO. 7 : 5r -TCTTCATCTCTCTATCAAACTGACA-3r 第一轮扩增用引物的下游引物SEQ ID NO. 8 : 5，-TGGCACATCCACAAGAACAT-3， 第二轮扩增用引物的上游引物SEQ ID NO. 9 : 5r -CATCCTCCAAAAGCACTACGT-3r 第二轮扩增用引物的下游引物SEQ ID NO. 10 :
【专利摘要】本发明公布了一种共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法。该方法是将Dxr和Fpps两个基因通过植物表达载体导入青蒿中,筛选得到花蕾青蒿素含量高的青蒿，具体步骤:从青篙中克隆Dxr基因和Fpps基因,构建含Dxr基因和Fpps两个基因的植物表达载体,用根癌农杆菌介导,将Dxr基因和Fpps基因转入青篙并培育筛选再生植株，获得花蕾青篙素含量提高的转基因青篙植株。在非转化对照青篙CK含量为6.20mg/g干重时,本发明得到的基因工程青篙植株中花蕾青篙素含量最高17.40mg/g干重,其含量是非转化对照青篙含量的2.81倍,本发明的方法对于以青篙为原料的药厂节约成本具有重要意义。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-61, C12N15-82, C12N15-54
【公开号】CN104531752
【申请号】CN201410765826
【发明人】陈俊意, 朱照静, 杨治国, 杨延音, 谭丽, 田数高, 管琴, 张宝勇, 彭坤, 曾祥琼
【申请人】重庆医药高等专科学校
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月12日