一种利用重组Corynebacterium crenatum全细胞转化AD生成ADD的方法
【技术领域】
[0001] 一种利用重组Corynebacteriumcrenatum全细胞转化AD生成ADD的方法，属于 基因工程和酶工程领域。 技术背景
[0002] 目前，虽然留体药物在国际市场上仅占药物价值的2. 5%，但是世界各地的制药工 业需要超过2000吨的留体原材料。天然的留体化合物也变得越来越重要了。长时间以来， 谷甾醇被人们视为在豆留醇的生产中的废物。由于豆留醇结构中的24, 25位的双键促进了 甾体结构边链的化学降解，所以豆留醇在工业上大规模的用于孕留烷衍生物的合成。与此 同时，产生了大量的谷留醇废物。而现在，谷留醇作为一种最便宜的合成留体化合物最便宜 的原材料。随着时代的不断发展，留体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物，2000年 甾体药物在全球药物市场的销售额已突破200亿美元，约占世界医药总销售额的6%。
[0003] 甾体激素类药物分类：肾上腺皮质激素，包括氢化可的松，强的松等。可治疗阿狄 森氏症，抗炎，抗过敏，抗休克的等；蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白异化和促进 蛋白合成，主要用于治疗蛋白质增加和合成不足引起的疾病；性激素，包括雌性激素、雄性 激素和孕激素。
[0004] 留体化合物微生物转化是指利用微生物细胞对留体化合物某一特定部位（基团） 的作用，使其转化成与其结构上相类似的更有价值的新化合物。微生物对留体化合物的转 化反应主要有氧化、还原、水解、酯化、酰化、异构化、卤化、A环开环、边链降解等。目前在 甾体激素药物的生产中，一种非常重要的微生物转化反应就是留体母核A环的C1，2位脱 氢，用于Cl，2位脱氢的微生物主要分枝杆菌（Mycobactersp.)、假单胞菌（Pseudomonas sp.)、有节杆菌（Arthrobactersp.)、芽抱杆菌（Bacillussp.)、红球菌（Rhodococcus sp.)以及诺卡氏菌属（Nocardiasp.)等。
[0005] 微生物法具有成本低、对环境温和等优点，越来越受到人们的重视。世界先进国家 目前进行留体药物制备，大多以动植物留醇为起始原料进行微生物转化，得到AD和ADD后， 再进一步制备。
[0006] 3_ 留酬-A1-脱氛酶（3-ketosteroid-A1-dehydrogenase,KSDD或KSTD)也称 C1，2位脱氢酶，它是留体母核降解的关键酶，属于黄素蛋白酶类，位于细胞膜上，能在甾体 母核C1和C2之间引入双键，提高原有底物的抗炎活性及经济价值，实现AD向ADD转化，在 甾体药物开发上发挥着重要作用。同时，KSDD是诱导酶，只有当培养基中添加了具有C1>2位 饱和键的3-留酮化合物时，该酶才能表达。对3-留酮-AL脱氢酶（KSDD)的深入研宄 对整个留体药物行业的发展意义深远。
[0007] 分枝杆菌是一株能同时转化植物甾醇生成雄甾二酮AD和ADD的基因工程菌，有一 定的应用前景。但AD和ADD结构相似，在工业生产中很难进行分离，这成为该菌的缺陷。 目前国内对留体药物生产的研宄主要集中在菌种筛选和发酵优化上，对机理方面的研宄还 比较欠缺；而欧美等发达国家更加注重对发酵过程中各种物质功能机理的分析与研宄。近 年来，众多学者成功实现了来源于不同菌株的KSDD的外源表达。不同来源的KSDD在大肠 杆菌系统中表达时，主要以无活性的包涵体形式存在，检测不到KSDD酶活或者酶活水平较 低。本实验室前期实现了分枝杆菌的KSDD在大肠杆菌体系中的表达，以无活性的包涵体形 式存在，未检测到酶活与相关报道的一致。虽然在枯草芽孢杆菌中成功表达了KSDD酶，同 时也检测到酶活，但是却未能成功的纯化出有活性的KSDD酶，因此对该酶的酶学性质了解 很少，从而阻碍了对AD到ADD的全细胞转化的条件优化。
[0008] 本发明通过质粒PXMJ19,实现了分枝杆菌KSDD在钝齿棒杆菌SYPA5-5中的可溶性 过量表达以及成功纯化出KSDD并对该酶的酶学性质进行了研宄，最终酶活达2. 58U/mg，全 细胞转化AD 12h后转化率达83. 78%。这是首次成功纯化出有活性的分枝杆菌KSDD，也是 首次将钝齿棒杆菌表达系统应用于AD的合成，且重组子表达的酶活及AD的转化率均较高。 钝齿棒杆菌作为安全稳定的工业生产菌株，培养条件简单，发酵周期短，成为微生物留醇发 酵工业潜在生产菌株。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供：通过基因工程手段来获得能纯化出具有KSDD的纯酶，研 宄该酶的酶学性质，从而优化全细胞转化生产ADD能力的微生物的条件。对构建的重组菌 株进行酶活力及发酵性能进行研宄发现3-留酮-AL脱氢酶活力为出发菌的6倍左右， 并且得到了较高的转化率。为微生物发酵生产ADD的工业化提供了有益的指导。
[0010] 本发明的技术方案：是以基因工程为手段构建一株全细胞转化AD生成ADD重组枯 草芽孢杆菌，以TLC及HPLC为方法检测发酵液中产物的生成，筛选阳性重组子，通过酶活力 和发酵性能的检测来确定其目标酶的活力及底物转化率。本发明成功构建了一株以4-AD 为底物全细胞转化为方法的高产ADD的钝齿棒杆菌工程菌株，其3-留酮-A^脱氢酶活 力和底物转化率较出发菌株有较大提高。
[0011] 主要试剂：AD，ADD购自美国SIGMA公司
[0012] 重组菌株构建方法：
[0013] (1)3-甾酮-A^脱氢酶（KSDD)基因全序列的克隆
[0014]根据GENBANK网站公布的Mycobacterium neoaurum strainNWIBL-01ksdD基因 序列（GQ228843. 1)，以及pXMJ19质粒上的酶切位点设计ksdD基因引物。以制备的新金色 分枝杆菌染色体DNA为模板，以ksdDF、ksdD R为引物，通过PCR扩增出ksdD全序列。
[0015]PCR反应体系：10XExTaqBuffer2. 5yL，dNTP2yL，模板DNA1yL，上下游引物 各 0? 5yL，ExTaq酶 0? 5yL，ddH20 补齐至总体积 25yLQPCR反应条件：94°C4min，94°C90s， 59°C90s，72°C120s，循环 30 次，72°C10min，15°ClOmin。
[0016] (2)重组表达载体pXMJ19-ksdD的构建
[0017] 参照博大泰克公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，胶回收产物按一定比例与 PMD18-Tvector过夜连接，转化E.coliJM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选 重组菌，重组质粒经BamHI/HindIII酶切释放出大小为2. 7kb和1. 7kb的基因条带，表明 重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMD18-T-ksdD。
[0018]提取保存于E.coliJM109 中的质粒pMD18-T-ksdD和pXMJ19,质粒pMD18-T-ksdD 和口乂1〇19经8&111111/把11(1111双酶切，胶回收纯化，1' 40嫩连接酶过夜连接两片段，过夜后 将连接物热击转化E.coliJM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提 取转化子质粒，重组质粒经BamHI/HindIII双酶切后释放出大小为6. 6kb和1. 7kb的基 因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pXMJ19-ksdD。
[0019] (3)重组质粒pXMJ19_ksdD化学转化法转化模式菌株Corynebacteriumcrenatum SYPA5-5中将经验证构建成功的重组质粒pXMJ19-ksdD用化学转化法转化至模式菌株 CorynebacteriumcrenatumSYPA5-5 中表达。
[0020] (4)重组菌株Corynebacterium crenatum阳性转化子的筛选；
[0021] 挑取在具有卡那霉素抗生素压力平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶 切验证。
[0022] (5)重组Corynebacterium crenatum酶活测定，TLC及HPLC分析
[0023] 酶活测定方法：采用PMS-DCPIP的方法。具体方法如下：取培养24h的菌液 50mL, 4°C，8, 000r/min离心 5min收集菌体，用 50mLpH7. 0 的Tris-HCL缓冲液洗绦二次， 重悬于5ml的该缓冲液中。冰浴中40%功率超声破碎，工作3s间歇7s，工作时间15min。 10, 000r/min离心30min获得上清液，取0.lmL上清液，加入含50mM的Tris_HCL(PH7. 0)、 40yM的2,6-二氯酚靛酚、1.5mM的吩嗪硫酸甲酯、300yMAD(溶于2%的甲醇）总反应体 系达lmL。30°C反应50min，检测600nm波长下吸光值变化情况。将每分钟内能引起0. 01 个吸光度单位变化的酶量定义为一个单位U。
[0024]TLC分析（如附图所示）：重组Corynebacteriumcrenatum以2%接种量接种 于50ml发酵液，培养24h，按0. 1 % (w/v)投4-AD和0. 3 % (w/v) 0 -环糊精，继续培养 811取样，进行几(：分析；11(：展开剂：石油醚/乙酸乙酯（6 :4);11(：显色：显色剂20% 硫酸溶液，均匀喷洒，l〇〇°C烘烤五分钟标准曲线对产物进行定量分析。色谱条件：色谱 柱：dimosoilC18(5y1，250mmX4. 6m