m)，流动相：甲醇-水（V/V= 70:30)，检测器：UV Detector，检测波长：254nm，柱温：30°C，进样量：10yL。
[0025]HPLC分析：AD与ADD在254nm紫外波长下均有特征吸收峰，所以采用HPLC法进样 10UL，流速：1. 0ml/min〇
[0026] LBG培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/L，NaCL10g/L，葡萄糖5g/L(固体培养基加 入2 %琼脂粉）
[0027] 转化条件：将重组钝齿棒杆菌以1%接种量接种于50mLLBG培养基中，培养24h， 离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCL(PH7. 0)缓冲液复溶，按1% (w/v)投 4-AD和3% (w/v) 0 -环糊精，继续在30°C，160rpm培养。
[0028] 本发明的有益效果：通过基因工程手段扩增本实验已有的具有3-留酮-AL脱 氢酶能力的新金色分枝杆菌的该酶基因，借助本实验室有的钝齿棒杆菌表达体系，实现了 3-甾酮-AL脱氢酶基因在模式菌株钝齿棒杆菌SYPA5-5中的过量表达。本发明首次探 索了新金色分枝杆菌来源的KSDD酶的酶学性质，为利用钝齿棒杆菌全细胞转化AD为ADD 提供了一定的理论价值。在其酶学性质的基础上，我们将该菌株接种于以1 %接种量接种于 50mLLBG培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCL(PH7. 0) 缓冲液复溶，加入1% (w/v)4_AD和3% (w/v) |3 -环糊精，继续在30°C，160rpm培养10h。 最终底物摩尔转化率达到83. 87%，比原始菌提高了约23倍。
[0029] 将底物4-AD-步转化成具有更高附加价值的ADD，其是重要医药中间体；同时用 微生物法生产ADD，其较之化学生产法具有反应条件温和、原料利用率高、产品纯度高及工 艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。
【附图说明】
[0030] 重组菌株全细胞转化液TLC分析图
[0031] Lanel,标样AD;
[0032] Lane2,标样ADD ;
[0033] Lane3, C. crenatumSYPA5-5 全细胞转化液；
[0034] Lane4, C. crenatumSYPA5-5/pXMJ19 全细胞转化液；
[0035] Lane5, C. crenatumSYPA5-5/pXMJ19_ksdD全细胞转化液；
[0036] 具体实施方法
[0037]实施例 1:重组Corynebacterium crenatum株的构建
[0038] 以实验室具有3-留酮-AL脱氢酶活力的新金色分枝杆菌作为出发菌株，以其 染色体为模板，利用PCR手段获得该酶的基因，连接克隆载体，实现基因的大量扩增。将大 量扩增的KSDD基因片段，纯化后连接到pXMJ19载体上，验证成功后，转化模式菌株钝齿棒 杆菌SYPA5-5。在抗性平板上筛选阳性转化子，接种摇瓶发酵，用TLC和HPLC检测发酵液中 产物ADD。检测到有产物ADD的为构建成功的具有转化AD为ADD能力的重组菌株。本发明 最终得到具有转化AD产ADD的重组钝齿棒杆菌。
[0039] 实施例2 :重组菌株的酶活力测定
[0040] 菌株在LBG培养基中过夜培养，8000rpm离心lOmin,pH7. 0的50mMTris-HCL缓 冲液清洗3次，悬浮在该缓冲液中，超声波破碎处理制备粗酶液。lml反应混合物由100yL 粗酶液、50mM的Tris-HCL(PH7. 0)、40yM的2，6-二氯酚靛酚、1. 5mM的吩嗪硫酸甲酯、 500yMAD(溶于2%的甲醇）所组成，30°C反应50min，检测600nm波长下吸光值变化情况。 将每分钟内能引起0.01个吸光度单位变化的酶量定义为一个单位U。测得重组菌株酶活为 2. 58U/mg〇
[0041] 粗酶液经Ni-NTA柱纯化后得到纯的KSDD，纯化后的纯酶液的比酶活是12. 96U/ mg，BDH方向比酶活为112. 56U/g，纯化倍数达5. 02倍，回收率为7. 37%。
[0042] (1)最适pH的研宄
[0043] 配制不同pH梯度的缓冲液（pH3. 0-6. 0 :50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；pH 6. 0-9. 0 :50mMTris-HCL缓冲液；pH9. 0-10. 0 :50mM硼砂-氢氧化钠缓冲液，每 1.OpH为 一个梯度），在酶活反应体系中，测定不同pH条件下的酶相对活力，并进行比较。结果表明， 在pH7. 0时此酶的活性最强。
[0044] (2)酶的pH稳定性的研宄
[0045] 配制不同pH梯度的缓冲液（pH3. 0-6. 0:50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；pH 6. 0-9. 0 :50mMTris-HCL缓冲液；pH9. 0-10. 0 :50mM硼砂-氢氧化钠缓冲液，每 1.OpH为一 个梯度）。将酶存放于不同pH环境中2h，测定该酶的pH稳定性。结果表明，在中性pH环 境范围（pH6. 0-8. 0)，KSDD酶较为稳定。
[0046] (3)最适温度的研宄
[0047] 设置反应温度（0°C-60°C，每10°C为一个梯度）测定不同温度条件下酶活力，确定 该酶反应最适温度。结果表明，随着温度的升高，酶的活性也逐步增强，在30°C时酶活性是 最高的，随后随着温度的继续上升，酶活力急剧下降。
[0048] (4)热稳定性研宄
[0049] 将酶液分别存放在0°C、10°C、20°C、30°C、40°C、50°C、60°C环境下2h，测定不同温 度下酶的剩余活力，从而研宄该酶在不同温度下的热稳定性。结果表明，在o°c环境下该酶 最稳定，随着温度的升高，酶的稳定性逐步减弱，到60°c时相对酶活力已经小于10%。
[0050] (5)不同金属离子以及EDTA对酶活的影响
[0051] 以不加金属离子的反应体系为对照，分别在反应体系中加入终浓度为ImM的K+,Na +，Ag+，Ca2+，Mg2+，Mn2+，Cu2+，Fe3+离子以及EDTA，研宄各金属离子及EDTA对酶活力的影响。结 果表明，Mn2+，Cu2+，Ag+，Fe3+离子对酶活力有明显的抑制作用，K+，Na+，Ca2+，EDTA离子对酶活 力有明显的促进作用。
[0052] (6)酶的动力学参数
[0053] 在pH7.0,30°C条件下，通过改变酶活反应体系中底物的终浓度，测定酶活力，考察 酶反应速率。以Lineweaver-Burk双倒数法作图，求得KSDD酶的。结果表明，Km 为8.9yM，乂隨为 6. 43mM/min。
[0054] 实施例3:重组菌株全细胞转化性能检测
[0055] 将重组钝齿棒杆菌以1%接种量接种于50mlLBG培养基中，培养24h，离心回收菌 体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCL(pH7. 0)缓冲液复溶，加入1% (w/v)4-AD和3% (w/v) 0 -环糊精，继续在30°C，160rpm培养12h。经HPLC检测分析后，最终底物摩尔转化 率达到83. 87%，比出发菌提高了约23倍。
【主权项】
1. 一种重组表达载体pXMJ19-ksdD，其特征是： 通过PCR技术获得来源于新金色分枝杆菌的KSDD编码基因ksdD，将其与表达载体 PXMJ19连接获得。
2. -种重组钝齿棒杆菌，其特征是： 将权利要求1中构建的重组载体pXMJ19-ksd D用化学转化法转化至菌株 Corynebacterium crenatum SYPA5-5 中。
3. 将权利要求2所述的重组钝齿棒杆菌全细胞转化4-AD产ADD的方法，其特征是：将 该菌株以1%接种量接种于50mL LBG培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当 的50mM的Tris-HCl pH7. 0缓冲液复溶，加入1 % (w/v) 4-AD和3% (v/v) 0 -环糊精继续 在30°C，160rpm培养12h ;最终底物摩尔转化率达到83. 87%，比原始菌新金色分枝杆菌的 转化率提高了约23倍。
【专利摘要】一种利用重组Corynebacterium crenatum全细胞转化AD生成ADD的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明首先获得新金色分枝杆菌中3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD)的基因扩增，然后利用pXMJ19质粒，实现了该基因在模式菌株钝齿棒杆菌SYPA5-5中的过量表达,首次成功的纯化出有活性的来源于金色分枝杆菌中的KSDD酶，并首次对其酶学性质进行了研究。本发明构建以4-AD为底物全细胞转化为方法的高产ADD的枯草芽孢杆菌工程菌株，对该菌株的酶活力及发酵性能进行研究发现3-甾酮-△1-脱氢酶的活力较出发菌株有了明显提高，以1％(w/v)4-AD为底物，全细胞转化12h，底物摩尔转化率达到83.87％,是出发菌株相对转化率的23倍。
【IPC分类】C12P33-02, C12R1-15, C12N15-77, C12N1-21
【公开号】CN104531746
【申请号】CN201410748156
【发明人】饶志明, 许正宏, 吴丹, 邵明龙, 张显, 徐美娟, 杨套伟
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月9日