一种防治Ⅰ型糖尿病和阿尔茨海默症蛋白药物的制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物药物开发技术领域，具体涉及一种防治I型糖尿病和阿尔茨 海默症蛋白药物的制备和应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所导致的以血糖高为特征的 代谢性疾病，目前已经成为世界上影响人体健康的重大疾病之一。糖尿病分为I型和II型， 其中，I型糖尿病（胰岛素依赖性糖尿病，IDDM)是由于胰岛0细胞受到破坏导致胰岛素 分泌缺陷的自身免疫性疾病，而II型糖尿病患者体内分泌胰岛素的能力并未完全丧失，有 的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果较差，导致体内胰岛素相对缺乏。
[0003] I型糖尿病占全国糖尿病总数的5-10%，全国I型糖尿病的患者至少有100万， 目前还呈上升趋势。I型糖尿病患者必须长期服用胰岛素以维持生命，给家庭和社会带来 了严重的精神压力和经济负担，且糖尿病引起的各种并发症是导致残疾和死亡的主要原 因，因此糖尿病的防治迫在眉睫。现有技术中治疗糖尿病的药物多数针对II型糖尿病，用于 治疗I型糖尿病的药物则相对较少。
[0004]I型糖尿病的抗原包括胰岛素及其前体、谷氨酸脱羧酶（Glutnmicacid decarnoxylase，GAD)蛋白、热休克蛋白、羧基肽酶H等多种抗原。研宄表明，仅 给动物口服一种自身抗原如胰岛素，就能诱导免疫耐受，对机体产生保护作用 (Science, 1994, 265:1237)。这是由于口服抗原能够诱导调节性T细胞分泌抑制性细胞因 子IL-4、IL-10和TGF-0，降低自身免疫疾病病灶由IL-2、IFN-y和TNF-a导致的炎症反 应。这种由相互间无关的各种抗原诱导的，在同一特定器官发生的所有病理免疫反应进行 抑制，被称为抗原驱动旁观者抑制（Antigen-drivenBystanderSupression)。抗原驱动旁 观者抑制的诱导是抗原特异性的，而效应是非特异性的，这为防预I型糖尿病等自身免疫 性疾病提供了一条新途径（ImmunolToday, 1998, 19:173)。
[0005] 阿尔茨海默症（Alzheimer'sdisease,AD)俗称老年痴呆症，是一种起病隐匿的进 行性发展的神经系统退行性疾病。临床上主要表现为中枢神经系统的全面衰退，认知功能， 记忆逐渐丧失，造成生活自理能力的障碍和精神行为的异常，最终导致死亡。目前中国阿尔 茨海默症患者1000万人之多，而且平均每7秒就会有一名患者加入这个行列。阿尔茨海默 症患者需要长期护理，全球护理费用超6000亿美元，占全球⑶P的1%。随着我国人口老 龄化问题的突出，对阿尔茨海默症的预防和治疗已显得越来越重要。AD最显著的神经病理 组织学特征：老年斑的形成，神经元纤维缠结和神经细胞的大量凋亡。其中老年斑主要是由 41-43个氨基酸片段的0淀粉样蛋白沉积而形成，Af3是0淀粉样前体蛋白经由0和Y 分泌酶分解产生的，具有高度的成纤维性和神经毒性。以A0 42及其亚单位片段为靶点的 免疫治疗已在临床试验中取得显著效果（Janusetal，2000)。2000年，美国生物制药企业 Elan制药公司着手的阿尔茨海默症疫苗在临床试验中，患者的认知和记忆能力得到显著的 改善。但是，在II期临床最终因为参与试验的患者中有几位患者出现了严重的脑膜炎而被 停止。有证据表明，口服疫苗不会引起小鼠脑发炎或出血，大大减少了毒副作用。
[0006] 同时，研宄表明霍乱病毒B亚基（CTB)可作为诱导口服耐受的强大粘膜运载系统， 并且CTB偶联抗原可能涉及到与传统大量口服自身抗原产生免疫耐受效应明显不同的免 疫调节机制，可能涉及到发炎细胞的移动行为的变化（NatBiotechnol，1998, 16, 292)，暗 示CTB偶联自身抗原不仅使应用口服耐受防治I型糖尿病等自身免疫性疾病更具实际应 用价值，而且还有潜在的治疗前景（ProcNatlAcadSciUSA，1997, 94:4610)。
[0007] 目前还未见CTB与A0 42的融合蛋白的在I型糖尿病的防治方面的相关报道。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种融合基因，该融合基因表达的融合蛋白可用于制备I型糖尿病 和阿尔茨海默症防治药物。
[0009] 一种融合基因及其表达的融合蛋白，所述融合基因由CTB基因和A0 42基因重组 而成，所述融合蛋白由CTB和A42融合而成。
[0010] 为保证Af3 42基因的表达量，作为优选，所述融合基因中，Af3 42基因的拷贝数为 2;即融合基因CTB-(A0 42)2是由CTB基因和两倍的A0 42基因重组而成。
[0011] 作为优选，所述融合基因的碱基序列如SEQIDNo.1所示；如SEQIDNo.1所示融 合基因的制备方法为：
[0012] (a)以pBac-CTB-A|3 42质粒为模板，以aF/aR为引物进行扩增，获得目的片段 CTB-A0 42-GPGP；
[0013] 上游引物aF的碱基序列如SEQIDNo. 3所示，下游引物aR的碱基序列如SEQID No. 4所示；
[0014] (b)以pBac-CTB-Af3 42质粒为模板，以bF/bR为引物进行扩增，获得目的片段 GPGP-A0 42；
[0015] 上游引物bF的碱基序列如SEQIDNo.5所示，下游引物bR的碱基序列如SEQID No. 6所示；
[0016] (c)以CTB-A0 42-GPGP和GPGP-A0 42互为引物和模板进行链延伸反应，获得产物 S1，以S1为模板，以aF/bR为引物进行扩增，获得融合基因CTB-(Af3 42)2。
[0017] 由SEQIDNo.1所示的融合基因表达的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所 不〇
[0018] 本发明还提供了含有所述融合基因的表达载体和转化子。作为优选，所述转化子 为重组家蚕杆状病毒。该重组家蚕杆状病毒的制备方法为：
[0019] ⑴用BamH1和Xhol对融合基因CTB-(Af3 42)2进行双酶切，将酶切片段连接到 经同样处理的转移载体上，构建含目的基因的家蚕杆状病毒转移质粒；所述转移载体可选 用pFastBacl;
[0020] (ii)将家蚕杆状病毒转移质粒转化大肠杆菌，通过蓝白斑筛选获得重组病毒质 粒；
[0021] (iii)将重组病毒质粒转染家蚕卵巢细胞，获得重组家蚕杆状病毒。
[0022] 本发明还提供了一种所述融合蛋白的制备方法，包括：
[0023] (1)将上述制备的重组家蚕杆状病毒感染家蚕卵巢细胞，进行病毒扩增；
[0024] (2)将扩增得到的重组家蚕杆状病毒注射至家蚕幼虫或蚕蛹体内，经5-6d后取蚕 幼虫或蚕蛹淋巴血，离心取上清，分离纯化获得所述融合蛋白。
[0025] 利用被重组家蚕杆状病毒感染的家蚕幼虫或蚕蛹高效表达融合蛋白，比直接用原 核生物表达的活性高，比通过转基因植物表达的产率高；家蚕是可以无菌大规模饲养经济 昆虫，可以低成本、大规模饲养，而且不会造成公害；蚕体中有多重天然蛋白质保护剂，对表 达产物有保护作用，使基因表达产物更加稳定。
[0026] 本发明还提供了所述融合蛋白在制备I型糖尿病治疗药物中的应用。试验表明， 该融合蛋白能够显著改善受试小鼠的胰岛炎患病状况，在连续监测25周后，阴性对照组有 86. 7%小鼠患病，而饲喂融合蛋白的小鼠只有53. 3%患病。
[0027] 本发明还提供了所述融合蛋白在制备阿尔茨海默症防治药物中的应用。试验表 明，该融合蛋白能够显著提高阿尔茨海默症模型小鼠A0 42抗体水平，降低大脑内A0 42的 含量。
[0028] 由此可见，本发明的融合蛋白可作为活性成分，用以制备I型糖尿病和阿尔茨海 默症防治药物。作为优选，所述I型糖尿病防治药物以及阿尔茨海默症防治药物均为口服 药物，为患者解除注射痛苦和感染威胁。
[0029] 本发明将二倍的人A0 42基因插入CTB基因的下游，构建融合基因及含有融合基 因的重组家蚕杆状病毒，最后将重组家蚕杆状病毒感染家蚕幼虫或蚕蛹，通过家蚕幼虫或 蚕蛹高效表达融合蛋白。该融合蛋白中，人A0 42与CTB融合表达，CTB能够强化A0 42的 免疫原性。
[0030] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0031] 本发明利用CTB基因与两倍的人Af3 42基因构建融合基因，将该融合基因表达的 融合蛋白饲喂小鼠，不仅能显著改善受试小鼠的胰岛炎患病状况，在连续监测25周后，阴 性对照组有86. 7%小鼠患病，而饲喂融合蛋白的小鼠只有53. 3%患病；还能显著提高阿尔 茨海默症模型小鼠A0 42抗体水平，降低阿尔茨海默症模型小鼠大脑内A0 42的含量，提示 该融合蛋白能用于制备I型糖尿病和阿尔茨海默症防治药物。
【附图说明】
[0032] 图1为杆状病毒转移质粒pBac-CTB-(A0 42)2的图谱；
[0033] 图2为家蚕表达的融合蛋白的Westren杂交分析结果图；
【具体实施方式】
[0034] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0035] 实施例1、融合基因的构建
[0036] (1)以pBac-CTB-A |3 42质粒为模板，以aF/aR为引物进行扩增，获得目的片段 CTB-A 0 42-GPGP；
【主权项】
1. 一种融合基因，其特征在于，由CTB基因和A 0 42基因重组而成。
2. 如权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述A 0 42基因的拷贝数为2。
3. 如权利要求1或2所述的融合基因，其特征在于，碱基序列如SEQ ID No. 1所示。
4. 含有如权利要求1?3任一所述融合基因的表达载体。
5. 含有如权利要求1?3任一所述融合基因的转化子。
6. 如权利要求5所述的转化子，其特征在于，所述转化子为重组家蚕杆状病毒。
7. 如权利要求1?3任一所述融合基因表达的融合蛋白。
8. 如权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
9. 如权利要求7或8所述融合蛋白在制备I型糖尿病治疗药物中的应用。
10. 如权利要求7或8所述融合蛋白在制备阿尔茨海默症防治药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种防治Ⅰ型糖尿病和阿尔茨海默症蛋白药物的制备和应用。本发明利用CTB基因与两倍的人Aβ42基因构建融合基因，将该融合基因表达的融合蛋白饲喂小鼠，不仅能显著改善受试小鼠的胰岛炎患病状况，在连续监测，25周后，阴性对照组有86.7％小鼠患病，而饲喂融合蛋白的小鼠只有53.3％患病；还能显著提高阿尔茨海默症模型小鼠Aβ42抗体水平，降低大脑内Aβ42的含量，提示该融合蛋白能用于制备Ⅰ型糖尿病和阿尔茨海默症的防治药物。
【IPC分类】A61K38-17, A61P3-10, C12N15-866, C12N7-01, C12N15-62, C07K19-00, A61P25-28, A61K47-42
【公开号】CN104531736
【申请号】CN201410734935
【发明人】金勇丰, 刘宝平, 杨赟, 岳媛, 潘华伟, 李司
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月5日