一种阿尔茨海默症的靶位蛋白质及其编码基因和应用的制作方法

专利名称：一种阿尔茨海默症的靶位蛋白质及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种阿尔茨海默症的靶位蛋白质及其编码基因和应用。本发明发现可用于治疗人类神经退行性疾，特别是阿尔茨海默症的靶位基因Zipl，通过RNAi干扰Zipl的表达可以显著改善或延缓阿尔茨海默病人的病症。
背景技术：
阿尔兹海默病(Alzheimer，s disease, AD)是目前影响人类健康的主要神经退行性疾病，因其发病与年龄密切相关，且多发于老人，故随着社会人口的老龄化，发病率会越来越高。在美国，每800万人口就有2047位AD患者，在中国的患病人群也有600-1000万人。然而，到目前为止人类还没有治疗该病的有效措施。β-淀粉样蛋白(Αβ)是人老年大脑斑的主要组成成分，该蛋白在病人脑部的积累被认为是诱发AD病症的主要原因(Hardy and Selkoe,2001 ；Hardy, 2006 ；Walsh andSelkoe 2007)。Αβ蛋白来自于β分泌酶(BACE)和γ分泌酶对Aβ前体蛋白(ΑβΡΡ) 进行的有序性的蛋白水解(Evin and ffeidemann, 2002 ；Mattson，2004)。然而，究竟是什么样的原因导致了 Αβ积累，而其又是如何与痴呆相联系的仍旧不清楚。越来越多的证据表明内源性的金属动态平衡的打破，尤其是锌和铜的浓度的改变与 AD 的病理过程有很强的联系(Danscher，et al.，1997,2007 ；Lovell, et al.，1998 ； Frederickson and Bush, 2001 ；Sensi, et al. ,2007) Zn2+是唯一可以在 ρΗ7· 4 的生理条件下聚集 A β 的金属离子(Bush，et al.，1994 ；Frederickson, et al.，2005 ；Stoltenberg, et al.，2007)。即使铜和铁也能部分诱导聚集(铁的作用稍小)，但它们需要略酸的环境 (pH6. 6) (Atwood, et al. 1998)。有研究指出AD病人脑部锌浓度升高，尤其在大脑老年斑中呈现明显的高浓度水平(Opazo，et al.，2002)。对具有明显AD特征的晚期病人脑部海马区、多处新皮质区、杏仁核进行切片取样并直接测定其锌含量，通过与同年龄正常人做比较，发现AD病人这些组织的锌含量明显提高(Samudralwar et al.，1995 ；Deibel et al.， 1996 ；Danscher, et al.，1997 ；Lovell, et al.，1998 ；Cornett et al.，1998)。有报告指出在很低的生理浓度下锌就能诱导A β的沉积(Mantyh, et al. , 1993 ；Bush, et al. , 1994 ； 1995)，但高浓度的锌对于大量A β原纤维的形成是必须的(Clements，et al. , 1996 ； Esler, et al.，1996)。因此，通过调控锌离子在大脑的累积，有可能预防或改善AD病症的发展。锌的体内平衡主要由Zip(Zrt_Irt like)蛋白、锌转运蛋白(ZnT)和金属硫因 (MT)共同维持的。而Zip蛋白被认为是细胞吸收锌的主要转入蛋白，能调节从细胞外或胞内小泡到胞质的锌的吸收(Cousins，et al. ,2006 ；Lichten and Cousins，2009)。虽然我们对于大脑如何从细胞外环境吸收锌进入神经元和神经胶质细胞的过程仍不完全了解，但 Zip 蛋白被认为参与进了这一过程(Cousins, et al.，2006 ；Lichten and Cousins，2009)。 根据功能特征推断典型的Zip蛋白结构具有8个跨膜(Transmembrane，TM)结构域和一个类似膜拓扑结构。该家族蛋白的氨基端和羧基端位于质膜的外表面，其C端很短。Zip蛋白长约309-476个氨基酸，序列差别主要在跨膜结构域TM3和TM4之间，被命名为“可变区 (Variable region) ”，该区域大多含有一个富含His残基的潜在金属结合域，存在于细胞质中。Zip家族中最保守的部分是TM4结构域，推测与一个完全保守的His残基形成了一个两亲性螺旋。该His残基与一个邻近的极性残基可能包含部分膜内重金属结合位点，此位点是金属运载的部分通道(Eng et al，1998)。目前在人和哺乳动物中发现15种Zip蛋白基因(Zipl-15)，它们或者可以通过增强锌的吸收(Zipl-5 ；7-15)而提高细胞内的锌含量，亦或者可以在锌缺乏的时候从胞内释放储存的锌(Zip6和Zip7)。其中7种Zip蛋白基因(Zip 1，3，4，5，10，13，和14)检测到在大脑中有不同程度表达(Dufner-Beattie et al. ,2003 ；Belloni-Olivi et al. ,2009 ； Emmetsberger et al. ,2010).已有证据表明Zipl和Zip3在大脑中负责Si的吸收和Si平衡(Dufner-Beattie et al. ,2003 ；Qian et al. ,2011) dZipl，作为人 Zipl 的同源类似物，隶属于果蝇SLC39锌转运蛋白家族。利用系统发生树分析表明dZipl和人hZipl、3是垂直同源基因，在系统发生树中形成一个子群，表明这些蛋白在锌转入胞质的过程中起着相似的作用。因此，可以以果蝇为模式动物研究hZipl、3治疗阿尔茨海默症的应用。应用果蝇模型在脑部表达人Αβ 42蛋白可以重现人类AD的主要症状，包括具有年龄相关性的记忆力丧失，淀粉样Αβ沉积，神经退化，行为缺陷和寿命缩短等。通过RNAi基因沉默技术， 本发明在AD果蝇大脑选择性沉默dZipl基因显著延缓了果蝇AD病症的进程。本发明为有效治疗AD病症提供了一关键的基因靶位，有望通过调控该基因靶位的表达防御和延缓人类AD疾病。

发明内容
本发明的目的是提供一种有效治疗AD病症的靶位蛋白质。本发明的再一目的是提供一种有效治疗AD病症的靶位基因及其序列。本发明的再一目的是提供包含上述靶位基因的干扰和过表达载体。本发明的再一目的是提供上述AD病症的靶位蛋白质制备用于治疗阿尔茨海默症的药物的应用。本发明的再一目的是提供上述AD病症的靶位基因制备用于治疗阿尔茨海默症的药物的应用。本发明的再一目的是提供上述包含上述靶位基因的干扰和过表达载体制备用于治疗阿尔茨海默症的药物的应用。根据本发明的人类AD果蝇模型靶位基蛋白dZipl的氨基酸序列如SEQ ID No. 1 所示。MSATATMSQEQTQDVDHHALLVAKIVSMVVLVVITVLCGSLPYVLNRCFHWTKASPEETRSSLVVRCLL FFGGGVLICTTFLHMLPEVIEVVEALQECGSLVKTPFALAEMLLCTGFFLMYALDELMTSLVRHHQGKLSRKESVAS LAFERGRSIRHSVLLNPQAKEEVEVKDTEPQPHKDHHGHSHMPVPADDGSSARGLGIILALSLHELFEGMAIGLEGT VSTVWFMFGAVSAHKLVLAFCVGMELLVARTRSSLAILYLVTFSIVTPIGIGVGLGISQQVAAGQPSLPSGVLQGIA CGTLLYVVFFEILIESHAGWRALVAAVAGFALMFGLQILSDEAEGDDSLTCS根据本发明的治疗AD病症的果蝇模型靶位基因dZipl，其编码上述膜蛋白dZipl， 例如，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
AGTGAATCCGCGTATCAATCAGCGATCAGATTTCAATCGGCTCCCGCTGATATATGACTGGAAATATAA
accattagcctggttgtgagttccagccagcacagtcgaagctatcaactcgggaggtgaagQagcgctaccgca
ACTATGTCACAAGAGCAAACGCAAGACGTGGATCACCATGCGCTGCTGGTGGCCAAAATAGTTTCCATGGTGGTGCT CGTGGTGATCACCGTGCTTTGCGGCAGCCTTCCCTACGTCCTGAACAGGTGCTTCCATTGGACGAAGGCGAGTCCGG AGGAAACCCGCTCGTCATTGGTGGTGCGGTGCCTACTCTTTTTCGGCGGCGGTGTGCTCATCTGCACCACCTTCCTG CACATGCTGCCCGAGGTGATCGAGGTGGTGGAAGCGCTCCAGGAATGCGGCTCGCTTGTCAAGACGCCCTTCGCTCT GGCGGAGATGCTGCTGTGCACGGGCTTTTTCCTGATGTACGCGTTGGACGAGCTGATGACCAGCCTCGTGCGGCACC ACCAGGGAAAGCTTAGTCGGAAAGAGTCGGTGGCCAGTCTGGCTTTCGAAAGAGGACGCAGCATTCGTCACAGTGTT CTCCTCAATCCACAGGCGAAGGAAGAAGTGGAAGTTAAGGATACGGAACCGCAGCCACACAAGGATCACCACGGCCA CTCGCACATGCCCGTGCCAGCGGACGATGGATCCTCTGCCAGGGGGCTGGGCATTATCCTCGCCCTTTCGCTCCACG AACTGTTCGAGGGCATGGCCATTGGTCTGGAGGGCACTGTGAGCACTGTGTGGTTCATGTTTGGAGCGGTCTCCGCC CACAAGTTGGTGTTGGCCTTCTGCGTGGGTATGGAGCTTCTGGTCGCCCGCACACGCAGTTCGCTGGCCATCTTGTA CCTGGTGACATTCTCCATTGTTACACCCATCGGTATCGGTGTTGGCCTCGGCATCAGCCAGCAGGTGGCAGCGGGTC AGCCCAGTCTGCCATCCGGAGTCCTCCAGGGCATCGCCTGTGGAACCTTGCTGTACGTAGTCTTCTTTGAGATCCTC ATTGAGAGCCATGCCGGATGGAGGGCCCTTGTGGCCGCCGTTGCGGGATTCGCTCTAATGTTTGGCCTTCAAATTCT
ttctgacgaagcggagggtgatgacagcctaacctgttcc Qccagtgtgacgccacttcagtattatcaagtta
TAGAGGAAGCAACAAAATAGTATACAAAACGATTCCCTGGGGATCTGTAAAAGTTATTATATAAAATACGAATAGAA TTTCAAAAGAGGTTTCTCAGAAATCTTATCCAACGCAAATAATTAAAAATGTAATAACCATATGGATTAAAAGAGAC AATATTTTACTTT根据本发明的人阿尔茨海默症的靶位蛋白质包括如SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列(hZipl)。
MGPffGEPELLVffRPEAVASEPPVPVGLEVKLGALVLLLVLTLLCSLVPICVLRRPGANHEGSASRQKA LSLVSCFAGGVFLATCLLDLLPDYLAAIDEALAALHVTLQFPLQEFILAMGFFLVLVMEQITLAYKEQSGPSPLEE TRALLGTVNGGPQHWHDGPGVPQASGAPATPSALRACVLVFSLALHSVFEGLAVGLQRDRARAMELCLALLLHKG ILAVSLSLRLLQSHLRAQVVAGCGILFSCMTPLGIGLGAALAESAGPLHQLAQSVLEGMAAGTFLYITFLEILPQ ELASSEQRILKVILLLAGFALLTGLLFIQI根据本发明的人阿尔茨海默症的靶位基因编码上述的蛋白质，所述基因包括如 SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。Q GGGCCCTGGGGAGAGCCAGAGCTCCTGGTGTGGCGCCCCGAGGCGGTAGCTTCAGAGCCTCCAGT GCCTGTGGGGCTGGAGGTGAAGTTGGGGGCCCTGGTGCTGCTGCTGGTGCTCACCCTCCTCTGCAGCCTGGTGCCCA TCTGTGTGCTGCGCCGGCCAGGAGCTAACCATGAAGGCTCAGCTTCCCGCCAGAAAGCCCTGAGCCTAGTAAGCTGT TTCGCGGGGGGCGTCTTTTTGGCCACTTGTCTCCTGGACCTGCTGCCTGACTACCTGGCTGCCATAGATGAGGCCCT GGCAGCCTTGCACGTGACGCTCCAGTTCCCACTGCAAGAGTTCATCCTGGCCATGGGCTTCTTCCTGGTCCTGGTGA TGGAGCAGATCACACTGGCTTACAAGGAGCAGTCAGGGCCGTCACCTCTGGAGGAAACAAGGGCTCTGCTGGGAACA GTGAATGGTGGGCCGCAGCATTGGCATGATGGGCCAGGGGTCCCACAGGCGAGTGGAGCCCCAGCAACCCCCTCAGC CTTGCGTGCCTGTGTACTGGTGTTCTCCCTGGCCCTCCACTCCGTGTTCGAGGGGCTGGCGGTAGGGCTGCAGCGAG ACCGGGCTCGGGCCATGGAGCTGTGCCTGGCTTTGCTGCTCCACAAGGGCATCCTGGCTGTCAGCCTGTCCCTGCGG CTGTTGCAGAGCCACCTTAGGGCACAGGTGGTGGCTGGCTGTGGGATCCTCTTCTCATGCATGACACCTCTAGGCATCGGGCTGGGTGCAGCTCTGGCAGAGTCGGCAGGACCTCTGCACCAGCTGGCCCAGTCTGTGCTAGAGGGCATGGCAG CTGGCACCTTTCTCTATATCACCTTTCTGGAAATCCTGCCCCAGGAGCTGGCCAGTTCTGAGCAAAGGATCCTCAAG gtcattctgctcctagcaggctttgccctgctcactggcctgctcttcatccaaatc:^ag根据本发明的人阿尔茨海默症的靶位蛋白质包括如SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列(hZip3)。MVKLLVAKILCMVGVFFFMLLGSLLPVKIIETDFEKAHRSKKILSLCNTFGGGVFLATCFNALLPAVR EKLQKVLSLGHISTDYPLAETILLLGFFMTVFLEQLILTFRKEKPSFIDLETFNAGSDVGSDSEYESPFMGGARGH ALYVEPHGHGPSLSVQGLSRASPVRLLSLAFALSAHSVFEGLALGLQEEGEKVVSLFVGVAVHETLVAVALGISM ARSAMPLRDAAKLAVTVSAMIPLGIGLGLGIESAQGVPGSVASVLLQGLAGGTFLFITFLEILAKELEEKSDRLL KVLFLVLGYTVLAGMVFLKff根据本发明的人阿尔茨海默症的靶位基因hZip3编码上述的蛋白质，所述基因包括如SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列。|atg| gtgaaattgctagtggccaaaatcctgtgcatggtgggcgtgttcttcttcatgctgctcggc
TCCCTGCTCCCCGTGAAGATCATCGAGACAGATTTTGAGAAGGCCCATCGCTCGAAAAAGATCCTCTCTCTCTGCAA CACCTTTGGAGGGGGGGTGTTTCTGGCCACGTGCTTCAACGCTCTGCTGCCCGCTGTGAGGGAAAAGCTCCAGAAGG TCCTGAGCCTCGGCCACATCAGCACCGACTACCCGCTGGCCGAGACCATCCTCCTGCTGGGCTTCTTCATGACCGTC TTCCTGGAGCAGCTGATCCTGACCTTCCGCAAGGAGAAGCCGTCCTTCATCGACCTGGAGACCTTCAACGCCGGATC GGACGTGGGCAGCGACTCGGAGTATGAGAGCCCCTTCATGGGGGGCGCGCGGGGCCACGCGCTGTACGTGGAGCCCC ACGGCCACGGCCCCAGCCTGAGCGTGCAGGGCCTCTCGCGCGCCAGCCCCGTGCGCCTGCTCAGCCTGGCCTTCGCG CTGTCGGCCCACTCGGTCTTTGAGGGCCTGGCCCTGGGCCTGCAGGAGGAGGGGGAGAAAGTGGTGAGCCTGTTCGT GGGGGTGGCCGTCCACGAGACGCTGGTGGCCGTGGCCCTGGGCATCAGCATGGCCCGGAGTGCCATGCCCCTGCGGG ACGCGGCCAAGCTGGCGGTCACCGTGAGCGCCATGATCCCCCTGGGCATCGGCCTGGGCCTGGGCATTGAGAGCGCC CAGGGCGTGCCGGGCAGCGTGGCCTCCGTGCTGCTGCAGGGCCTGGCGGGCGGCACCTTCCTCTTCATCACCTTCCT GGAGATCCTGGCCAAGGAGCTGGAGGAGAAGAGTGACCGTCTGCTCAAGGTCCTCTTCCTGGTGCTGGGCTACACCG TCCTAGCCGGGATGGTCTTCCTCAAGTGG ITGAI根据本发明的包括上述靶位基因hZipl、3的载体可以为hZipl、3的正义载体或 RNAi干扰载体。根据本发明的上述载体可以为UAST-hZipl RNAi或UAST-Miρ3 RNAi，或其它利用 hZipl和hZip3核苷酸序列构建的干扰或抑制hZipl、3表达的载体。根据本发明的阿尔茨海默症的靶位蛋白质可以用于制备治疗阿尔茨海默症的药物中。根据本发明的阿尔茨海默症的靶位基因hZipl、3可以用于制备治疗阿尔茨海默症的药物中。根据本发明的上述载体可以用于制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。根据本发明的靶位基因，通过rnai干扰可以用于提高ad病人的早期认知能力，减缓或阻抑Αβ蛋白在脑部的沉积及其引起的神经退变，改善运动能力和延长寿命。实验结果表明DdZipl是作用于系统和脑部锌吸收的转运蛋白。利用系统发生树分析表明dZipl和人hZipl、3是垂直同源基因，在系统发生树中形成一个子群，表明这些蛋白在锌转入胞质的过程中起着相似的作用。拓扑分析推定dZipl中有8个跨膜结构域，在第三和第四结构域间有一富组氨酸的胞质环，dZipl蛋白的C端和N端被预测位于细胞外。所有这些特征都是 SLC39 家族所特有的(Cousins, et al. ,2006 ；Lichten and Cousins，2009)。利用半定量的RT-PCR(sqRT-PCR)、本发明检测到dZipl在果蝇肠，脑部和全身其它组织均有表达。dZipl在锌过度供给时转录水平降低，在锌缺乏时转录水平升高。说明 dZipl对胞外锌浓度的变化敏感，是维持果蝇脑部锌稳态的重要调节因素。利用免疫组化方法，dZipl蛋白在肠部被定位在肠腔内侧的顶端膜上(apical membrane)与其参与肠道从食物中摄取锌的功能相符合。为了验证EdZipl在体内的功能，本发明测试了全身dZipl 过表达和RNAi的转基因果蝇在过量供给锌食物中的死亡率。结果表明，dZipl过表达会使果蝇对锌的过量供给敏感，反之，RNAi干扰dZipl的表达就会使果蝇对锌的过量供给更具有抗性。利用感应耦合等离子发射光谱法(ICP-0EQ，本发明直接测定了果蝇脑部的锌含量，表明在果蝇脑部过表达dZipl会促进脑部的锌积累(t-test，P < 0. 01)，而RNAi干扰 dZipl则会降低锌积累(t-test，ρ < 0. 05)。因此，特异性的操控dZipl在果蝇脑部的表达水平可改变其脑部锌积累的状态。2)在人类AD果蝇模型中，脑部dZipl mRNA的水平随年龄升高，而对照组正常果蝇则随年龄降低。半定量RT-PCR被用来显示dZipl在果蝇脑部的转录水平。在不同年龄的正常ElavfeiW果蝇脑部发现羽化3天的果蝇dZipl有很高的转录水平，之后随年龄下降， 到羽化后35天，已不能检测到。相比而言，羽化3天的A β 42果蝇，dZipl mRNA水平很低， 并随年龄呈现增长趋势。3)通过调节dZipl的表达水平可改变致病因子A β 42在脑部的沉积。应用组织化学方法，通过硫磺素-S (Thioflavin S，TS)染色会特异性的标识出A β 42在脑部的沉积情况。结果表明，TS阳性的A β 42沉积数量会随着年龄的增长而增加，过表达dZipl会会加速 A β 42的积累(120%增长)，相反的，而抑制dZipl的表达会降低甚至消除A β 42的沉积。4)Αβ 42在果蝇脑部的沉积与锌的聚集相关联。为了验证EAβ 42在脑部的沉积是否与锌的积累相关，本发明用zinquin染色来确定锌在脑部的水平。结果发现，过表达 dZipl会在果蝇脑部的皮层和神经纤维网中造成明显的锌积累，在dZipl RNAi的果蝇脑部只检测到少量信号，而在脑部Αβ主要沉积在皮层和神经纤维网区，说明dZipl过表达的水平与锌的积累，及A β 42的沉积呈现正相关。通过用ICP-OES直接测量20天和30天果蝇脑部的锌含量，发现随着年龄增长，果蝇脑部的锌积累呈上升趋势，过表达dZipl很大程度上促进了 Αβ 42果蝇脑部的锌积累，而抑制dZipl的表达则减缓了 Αβ 42果蝇脑部的锌积累ο5)调控dZipl可以改善由Αβ42引起的早期记忆丧失。利用被广泛认知的巴普洛夫嗅觉厌恶条件作用(Tully and Quirm，1985)，本发明之前的研究表明羽化2天的A β 42 果蝇有正常的当前记忆(Iijima et al.，2004)，但从5天开始，当前记忆则出现了明显的缺陷。结果显示，过表达dZipl和抑制dZipl的表达均显著改善了 5天大的A β 42果蝇记忆功能的损害。6)调节dZipl表达能改变由Αβ 42引起的神经退变。解剖学分析显示年老的 A β 42果蝇脑部广泛存在的神经退变，即脑区可见空泡形成(Iijima et al.，2004，2008)。
7利用用苏木精依红(H&E)染色，发现dZipl RNAi的Αβ 42果蝇中的脑组织得到很好的保持， 而过表达dZipl的果蝇脑部含有更多更大的空泡。用A β 42抗体进行整体的免疫组化染色， 发现RNAi干扰dZipl的A β 42果蝇脑部A β 42沉淀会很大程度地减少，而当dZipl过表达时，沉淀则会大幅度增多。这些结果再次证明了调节dZipl的表达水平将会改变Αβ 42的沉积过程，这也与大脑神经退变过程紧密相关。7)调节dZipl表达会影响A β 42果蝇的爬行能力和寿命。Ii jima等人指出A β 42 果蝇在3周时开始出现运动功能障碍，它们的寿命也将会大幅度缩短(Iijima et al., 2004，2008)。爬行能力测试显示，过表达dZipl的A β 42果蝇在15天时就开始出现运动障碍，这比所有别的基因型果蝇早得多。相比而言，通过RNAi降低dZipl表达的Aβ 42果蝇会 延缓其爬行障碍，而且在RNAi干扰使dZipl几乎不表达的AD果蝇中，爬行能力的改善更为显著。同样结果，果蝇寿命上也显示出来，Αβ42果蝇的寿命会因dZipl的过表达而缩短， 因RNAi抑制dZipl而延长。在本验所有的遗传基因操作的果蝇里，dZipl RNAi#2转基因果蝇表现出最强的效果。Aβ 42果蝇中50%死亡率达到的时间在RNAi干扰使dZipl几乎不表达的AD果蝇中延长了近33%。综上所述，在果蝇神经系统中特异地过表达dZipl提高了果蝇脑部的锌积累，而 RNAi干扰dZipl的表达则降低或延缓了(果蝇脑部)锌的积累。更为重要的是，特异阻抑人AD果蝇模型神经系统dZipl的表达会显著减少其脑部A β纤维的沉积、减缓神经退变， 显著提高果蝇的认知水平，运动能力并延长寿命。这些发现表明Zipl蛋白是调节锌代谢的一关键靶位，根据本发明的靶位基因，通过RNAi干扰可以用于提高AD病人的早期认知能力，减缓或阻抑Αβ蛋白在脑部的沉积及其引起的神经退变，改善运动能力和延长寿命。该发明有望为治疗阿尔兹海默病的提供一新的治疗策略和关键靶位。


图1 种系发生树分析果蝇dZipl与人hZipl-3属于直系同源基因(括号内为 GenBank注册号)。图2 =HMM-TM软件预测dZipl的拓扑结构，含8个跨膜结构域(TM1-8)，在TM3与 TM4之间有一富His胞质环，符合典型的ZIP家族结构特征。图3 半定量RT-PCR方法检测dZipl在果蝇脑(泳道1)，肠(泳道3)和其它组织(泳道2)均有表达，但丰度不一。在脑部(泳道4-6)，饲喂Zn限制食物(添加200 μ M EDTA，泳道6)，比正常食物(泳道4)喂养dZIPl明显增强表达，而饲喂Zn过量食物(添加 ImMZnSO4,泳道5)则dZipl转录水平明显降低。应用Actin_Gal4启动子，Actin_Gal4 > UAS-dZipl转基因果蝇(泳道9)比对照Actin-Gal4 > +/+转基因果蝇(泳道7)的dZIPl 转录水平显著提高，Actin-Gal4 > UAS-dZipIRNAi 1#转基因果蝇(泳道8)的dZIPl转录水平则明显降低。图4 在富Zn饲喂条件下(2. 5mM ZnCl2)雌果蝇A和雄果蝇B分别培养6天和3天， 全身过表达dZipl (actin-Gal4 > UAS-dZipl)果蝇的死亡率显著高于对照actin_Gal4果蝇，而 dZiplRNAi (actin_Gal4 > UAS-dZipIRNAi)果蝇的死亡率显著低于对照 actin_Gal4 果蝇。在正常食物(Normal)饲喂条件下，不同基因型之间没有差别。(ttest，_P<0. 001)。图5 利用感应耦合等离子发射光谱法(ICP-OES)测定果蝇脑部的锌含量，在脑部过表达dZipl (Elav-Gal4 > UAS-dZIPl)会显著促进脑部的锌积累(t_test，P < 0. 01)，而 RNAi 干扰 dZipl (Elav_Gal4 > UAS-dZIPl RNAi 1#)则会降低锌积累(t_test，p < 0. 05)。 数据显示三次重复的平均值士SEM，t test, *P < 0. 05，**P < 0. 01。图6 dZipl表达水平影响A β 42纤维的沉积。硫磺素-S (Thioflavin S，TS)染色会特异性的标识出A β 42在脑部的沉积情况(亮的绿点，A-B)，TS阳性的A β 42沉积在25 天的对照果蝇(Elav-Gal4，左上)很少发现，在Αβ 42果蝇脑部会随着年龄的增长而增加， 过表达dZipl会会加速A β 42的积累(120%增长)，相反的，而抑制dZipl的表达会降低甚至消除A β 42的沉积(C)。标尺，25 μ m。图7 :Zn在果蝇脑的累积与dZipl的表达水平密切相关。Zinquin染色可特异地标记Zn离子，在没有Zinquin处理过的果蝇脑检测不到荧光信号(A-B)，过表达 dZipl (Elav-Gal4 > UAS-A β 42/UAS-dZipl，E-F)导致 Zn 在脑皮层和神经髓比对照A β 42果蝇(Elav-Gal4 > UAS-A β 421, C-D)明显累积。只有微弱的荧光信号在 dZiplRNAi(Elav-Gal4 > UAS-Aβ 42/UAS-dZipIRNAi 1#，G-H)果蝇脑部检测到。标尺， 100 μ m0图8 应用感应耦合等离子发射光谱法(ICP-OES)测定了羽化后20天和30天不同基因型果蝇脑部的锌含量。与对照相比(Elav-Gal4对Elav-Gal4 > UAS-A β 42)，过表达 dZipl (Elav-Gal4 > UAS-Aβ 42/UAS-dZipl)加快了 Zn 在果蝇脑的累积，抑制 dZipl 的表达(Elav-Gal4 > UAS-A β 42/UAS-dZipIRNAi 1#)减缓了 Zn在果蝇脑的累积，这种趋势在30天果蝇脑更为明显。每一柱形图上的数据显示的是该基因型果蝇相比20天对照果蝇脑部Zn增加的百分数。η = 400，指20天的果蝇每一种基因型所测的果蝇数。η = 3400， 指30天的果蝇每一种基因型所测的果蝇数。图9:过表达dZipl和dZipl RNAi均改善了 Aβ 42表达引起的果蝇早期记忆缺陷。与对照(UAS-A β 42)果蝇相比，表达A β 42 (Elav-Gal4 > UAS-A β 42)引起羽化5天的果蝇即出现记忆缺陷。过表达dZIPl(Elav-Gal4 > UAS-Aβ 42/UAS-dZipl)和 dZipIRNAi (Elav-Gal4 > UAS-A β 42/UAS-dZipl RNAi 1#)均显著改善了 A β 42 表达引起的果蝇早期记忆缺陷(t测验广卞< 0. 001)。每一基因型η = 8PIs。所有行为指标数据标准化到对照果蝇，数据代表平均数士SEM。图10 在不表达Αβ 42的情况下，过表达dZipl和dZiplRNAi对早期5天果蝇的记忆无显著影响(Elav-Gal4 > UAS-dZipl 或 Elav_Gal4 > UAS-dZipIRNAi 1# 相对于 Elav-Gal4)，尽管过表达dZIPl使果蝇记忆指数有升高。所有行为指标数据标准化到对照果蝇，数据代表平均数士SEM。图11 过表达dZipl加剧了 A β 42引起的神经退变 (D，Ε，H，脑部皮层和神经髓出现很多空泡)禾Π A β 42沉积(Ε，H)。dZIPlRNAi则减缓了 A β 42引起的神经退变(C，F，I， 脑部皮层和神经髓几乎没有空泡)及Αβ42沉积(F，I，)。标尺，50μπι。图12:不同基因型果蝇脑部的空泡数目。空泡是神经元退变死亡的结果，选择 Αβ 42主要积聚的皮层和神经髓的空泡数目进行计算和比较。过表达dZipl (Elav-Gal4 > UAS-A β 42/UAS-dZipl)显著提高了脑部的空泡数目，而 dZip IRNAi (Elav_Gal4 > UAS-A β 42/UAS-dZipIRNAi 1#)则显著降低了 A β 42表达引起的空泡数目(t测验，**Ρ < 0. 01,***Ρ < 0. 001)。每一基因型选择η = 5个果蝇脑进行统计，数据代表平均数士SEM。
图13 示半定量RT-PCR方法检测羽化5天的不同基因型果蝇脑部dZipl的转录水平，说明在神经系统特异表达dZipl(Elav-Gal4 > UAS-dZIPl)提高了 dZipl表达水平， dZipIRNAi (Elav_Gal4 > UAS-dZipIRNAi 1# 和 Elav_Gal4 > UAS-dZipIRNAi 2#)降低了 dZipl的表达水平，其中dZiplRNAi2#果蝇几乎完全终止了 dZipl的表达。Rp49作为控制基因，保证PCR模版量一致。图14:与对照 Αβ42 果蝇(Elav_Gal4 > UAS-Aβ 42)相比，过表达 dZipl (Elav-Gal4 > UAS-A β 42/UAS-dZipl)的 A β 42 果蝇爬行缺陷显著提早，然而 dZipIRNAi则显著延迟了 Aβ 42果蝇的爬行缺陷的出现，其中dZiplRNAi 2#果蝇效果最显著。ttest, **P < 0. 01，***P < 0. 001，与Αβ 42果蝇相比较。η = 4次独立试验。图15 与对照 Αβ42 果蝇(Elav_Gal4 > UAS-Aβ 42)相比，过表达 dZipl (Elav-Gal4 > UAS-A β 42/UAS-dZipl)的 A β 42 果蠅寿命显著缩短，然而 dZipIRNAi 则显著延长了 Aβ 42果蝇的寿命，其中dZiplRNAi 2#果蝇的寿命延长最显著。η = 4次独立试验。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 实施例1 果蝇dZIPl基因负责脑和全身组织的Zn吸收一、果蝇中人hZipl直系同源基因dZipl的序列分析和比较应用NCBI Blast软件，以人Zip家族基因hZipl的氨基酸序列在GenBank flybase 数据库中进行Blast，结果得到果蠅基因组(Drosophila melanogaster) dZipl (CG9428-PA) 与hZipl氨基酸序列一致性最高(序列一致性=29%, E值=2e-15)。dZipl在果蝇基因组2号染色体上，dZiplORF区有1135bp (其中1018_1094bp之间含一个76bp的Intron)， 编码352aa，预测分子量37836Da。利用TMHMM软件对dZipl蛋白结构跨膜区的预测，显示 dZipl有Zip家族典型的8个TM结构域，在TM3与TM4之间含有一个可变区，位于胞质内 (图 2)。利用MEGA 4. 1软件对人类基因组Zip家族的14个成员(hZipl_14)，果蝇dZipl 以及酵母Zip家族的ZRT1、ZRT2和ZRT3，拟南芥Zip家族的aIRTl进行种系发生树分析(NJ 算法)(图1)，说明果蝇dZipl与人hZipl、3属于直系同源基因，具有相同或相似的功能。二、半定量RT-PCR方法检测dZipl在不同组织的转录水平和对Zn状态的响应DdZipl在不同组织中表达丰度检测利用TRIzol (Invitrogen)试剂分别提取W1118果蝇的脑，肠和其它组织的总 RNA, cDNA 合成应用 Superscript 1 II Reverse Transcriptase (Invitrogen) i式齐[J盒(按照试剂盒操作规程)。采用半定量RT-PCR检测dZipl在不同组织的表达幅度，其中rp49 作为控制保证模板量一致。所用引物如下rp49，5’ -TACAGGCCCAAGATCGTGAA-3，(正向) 和 5，-TCTCCTTGCGCTTCTTGGA-3，(反向)；dZipl，5，-ATTATCCTCGCCCTTTC GC-3，(正向) (Forward)和 5’-TCACCCTCCGCTTCGTCAG-3’(反向)。结果表明，dZipl 在果蝇脑(泳道 1)， 肠(泳道3)和其它组织(泳道2)均有表达，但丰度不一，在脑部转录水平较低(图3，泳道 1-3)。2) dZipl对Zn状态的响应
分别饲喂W1118果蝇Zn限制食物(添加200μΜ EDTA)，Zn过量食物(添加 ImMZnSO4)和正常食物，24h后，分别提取三种食物喂养的果蝇脑的总RNA，进行反转录 CDNA0采用半定量RT-PCR检测dZipl在果蝇脑不同组织的表达幅度。结果表明，在缺Zn条件下诱导果蝇脑dZipl增强表达(图3，泳道6)，在Zn过量条件下降低了果蝇脑dZipl的表达(图3，泳道5)。说明果蝇脑部通过调控dZipl的表达水平来维持脑部Zn的离子的平衡。总RNA的提取，cDNA反转录的方法，及所用引物同上1)。三、dZipl过表达和RNAi转基因果蝇品系的获得及转录水平检测l)pUAST-dZipl 和 pWIZ-dZipIRNAi 载体的构建以果蝇(Drosophila melanogaster)野生型wlll8品系基因组DNA为模版，通过PCR分离克隆dZipl (CG9428-RA)，并经过酶切、连接、转化导入大肠杆菌DH5 α感受态细胞。通过菌落PCR，质粒酶切鉴定和测序鉴定来获得阳性克隆。具体实验操作步骤参见 《分子克隆》和《精编分子生物学实验指南》。所用过表达载体为PUAST质粒，插入位点为 EcoR I/Bgl II ;RNAi干扰载体为pWIZ，插入位点为Xba I.构建pWIZ RNAi载体时，为防止载体单酶切自连，酶切产物均经碱性磷酸酶(CIP)处理，使载体5’端去磷酸化，防止载体自身环化。构建 pUAST-dZipl 所用上游引物为5，-CCGAATTC AAGATGAGCGCTACCGC-3，， 下游引物为 5，-GGA AGATCTC TAGGAACAGGTTAGGCTG-3，。构建 pWIZ-dZip IRNAi 载体所用上游引物为5，-GGG TCTAGA ATGAGCGCTACCGC-3，；下游引物为 5，-GG TCTAGA CCACACAGTGCTCACAG-3’，深黑字体为酶切位点。2)pUAST-dZipl和pWIZ-dZipIRNAi转基因果蝇品系的获得 以W1118野生型果蝇为受体，应用显微注射技术，通过P-element介导的方法向果蝇新生卵转化 pUAST-dZipl 以及 pWIZ-dZiplRNAi 质粒(Rubin and Spradling，1982)。通过与带平衡标记的W1118/Cyo杂交，判断目的基因插入的果蝇基因组染色体位置。3)转基因果蝇品系dZipl转录水平检测为检测不同基因型果蝇全身dZipl的转录丰度，pUAST-dZipl和pWIZ-dZipIRNAi 转基因果蝇品系分别与Actin-GaW/cyo转基因果蝇品系杂交，选择羽化后5天的后代 Actin-Gal4 > UAS-dZipl，Actin_Gal4 > UAS-dZipIRNAi 1# 和 Actin_Gal4 > +/+ 转基因果蝇，进行全身总RNA提取和半定量RT-PCR检测(同实施例2 1)，结果显示，应用Actin-GaW 启动子，Actin-Gal4 > UAS-dZipl转基因果蝇(泳道9)比对照Actin_Gal4 > +/+转基因果蝇(泳道7)的dZipl转录水平显著提高，Actin-Gal4 > UAS-dZipIRNAi 1#转基因果蝇 (泳道8)的dZipl转录水平则明显降低。为检测不同基因型果蝇在脑部的dZipl转录丰度，pUAST-dZipl和 pffIZ-dZipIRNAi转基因果蝇品系分别与Elav-Gal4转基因果蝇品系杂交，选择羽化后 5 天的后代 Elav-Gal4 > UAS-dZipl, Elav_Gal4 > UAS-dZipIRNAi 1#， Elav_Gal4 > UAS-dZiplRNAi2#和Elav-Gal4 > +/+转基因果蝇，每一基因型解剖5个果蝇脑，2个重复， 进行总RNA提取和半定量RT-PCR检测(同实施例2:1)，rp49作为控制基因，保证PCR模版量一致。结果显示(图13):在神经系统特异表达dZipl显著提高了 dZipl表达水平， dZipIRNAi (Elav_Gal4 > UAS-dZipIRNAi 1# 和 Elav_Gal4 > UAS-dZipIRNAi 2#)降低了 dZipl的表达水平，其中dZiplRNAi2#果蝇几乎完全抑制了 dZipl的表达。四、dZipl过表达和RNAi转基因果蝇品系对Zn胁迫反应检测
羽化后3-5天的不同基因型的雌蝇和雄蝇置于含2. 5mM ZnSO4的食物上培养，每一培养管放20-25只果蝇，每一基因型设3次重复，对照饲喂正常食物，每隔24h记录死亡的果蝇数目。结果显示(图4)，在富Zn饲喂条件下雌果蝇(A)和雄果蝇(B)分别培养6天和3天，全身过表达dZipl果蝇的死亡率显著高于对照aCtin-Gal4果蝇，而dZiplRNAi果蝇的死亡率显著低于对照aCtin-Gal4果蝇。在正常食物(Normal)饲喂条件下，不同基因型之间没有差别。说明，过表达dZipl使果蝇吸收过多的Zn，对Zn敏感，而dZiplRNAi能减少对Zn的吸收，因而相对增强了抵抗Zn胁迫的能力。五、dZipl在果蝇神经系统特异过表达和RNAi对脑部Zn水平的影响分别收集羽化后3-5天的过表达dZIPl (Elav_Gal4 > UAS-dZipl)，RNAi干扰 dZipl (Elav-Gal4 > UAS-dZipIRNAi 1#)果蝇及对照组果蝇(Elav_Gal4 > +/+)。切取果蝇头部，用浓硝酸进行硝解处理后，用感应耦合等离子发射光谱法(ICP-OES)测定果蝇脑部的锌含量，实验设三次重复。结果显示(图5)，在脑部过表达dZipl会显著促进脑部的锌积累(t-test，P < 0.01),M RNAi 干扰 dZipl 则会降低锌积累(t-test，ρ < 0. 05)。说明通过遗传调控dZipl在脑部的表达水平，可影响脑部Zn离子水平。实施例2 在果蝇神经系统特异调控dZipl的表达水平可显著影响脑部A β淀粉样蛋白的沉积硫磺素-S (Thioflavin S，TS)染色会特异性的标识出A β纤维，在本实验用来检测Αβ 42纤维在果蝇脑的沉积情况。具体操作如下，果蝇脑首先在4%的多聚甲醛和2% 的Triton-XlOO溶液中固定2h，然后转移到含50%乙醇的0. 25% TS溶液中过夜。然后用 50%乙醇洗10分钟1次，用PBS洗3次，每次10分钟。之后，滴加focusclear (PacgenBio pharmaceuticals公司)，盖上盖玻片。片子用Zeiss LSM 510共聚焦激光显微镜观察，用 LSM 510分析软件进行数据分析。在果蝇脑蘑菇体区域的TS阳性沉积被统计和分析。结果显示(图6)，dZipl表达水平影响Aβ 42纤维的沉积。TS阳性的Aβ 42沉积在25天的对照果蝇(Elav-Gal4，左上)很少发现，在Αβ 42果蝇脑部会随着年龄的增长而增加，过表达dZipl会加速A β 42的积累(120%增长)，相反的，而抑制dZipl的表达会降低甚至消除 A β 42的沉积(C)0实施例3 果蝇脑部A β淀粉样蛋白沉积的改变与调控dZipl表达水平引起的Zn 平衡变化密切相关一、Zinquin染色实时检测dZipl在果蝇神经系统特异过表达和RNAi引起脑部Zn 累积情况由于Zinquin染色可特异地标记Zn离子，本实验利用该技术来实时检测dZipl 表达水平的不同对果蝇脑吸收Zn的影响。具体操作如下羽化10天的果蝇转移到含 4mMZnCl2的食物中培养，分别在40h和72h解剖果蝇脑，在25 μ M zinquin(Sigma)溶液中37°C培养30分钟。然后，用PBS溶液洗3次，每次5分钟。处理后的果蝇脑在荧光显微镜(Nikon, Diaphot 300)下观察和拍照。结果表明(图7)，过表达dZipl (Elav-Gal4 > UAS-Λβ 42/UAS-dZipl，E-F)导致Zn在脑皮层和神经髓比对照A β 42果蝇(Elav_Gal4 > UAS-A β 421，C-D)明显累积。只有微弱 的荧光信号在 dZiplRNAi (Elav_Gal4 > UAS-A β 42/ UAS-dZipIRNAi 1#，G-H)果蝇脑部检测到。说明，dZipl过表达促进了 Zn在脑部的累积，其主要累积部位与A β纤维主要沉积部位相一致，从而也证实了 Zn水平的增加促使了 A β蛋白的积聚与沉积。二、dZipIRNAi延缓了 A β 42果蝇脑部Zn累积进程

分别收集羽化后20天和30天的过表达dZipl (Elav_Gal4 > UAS-A β 42/ UAS-dZIPl) (Elav-Gal4 > UAS-dZipl)，RNAi 干扰 dZip 1 (Εlav-Gal4 > UAS-A β 42/ UAS-dZipIRNAi 1#)果蝇及对照组果蝇(Elav_Gal4 > UAS-A β 42 和 Elav_Gal4 > +/+)。切取果蝇头部，用浓硝酸进行硝解处理后，用感应耦合等离子发射光谱法(ICP-OES)测定果蝇脑部的锌含量。羽化20天的果蝇，每一基因型测400头，羽化30天的果蝇，每一基因型测300头。各基因型果蝇脑的Zn含量均标准化到20天的Elav-Gal4 > +/+果蝇，结果显示(图 8)，与对照相比(Elav-Gal4 对 EIav-Ga 14 > UAS-A β 42)，过表达 dZipl 加快了 Zn 在果蝇脑的累积，抑制dZipl的表达减缓了 Zn在果蝇脑的累积，这种趋势在30天果蝇脑更为明显。实施例4 过表达dZipl和dZiplRNAi均改善了 Aβ 42表达引起的果蝇早期记忆缺陷利用巴甫洛夫嗅觉相关记忆的理论进行果蝇记忆行为的检测，训练和检测程序参照(Tully and Quinn, 1985 ；Tully,et al.，1994 ;Yin，et al.，1994)。每一次训练，100 只果蝇为一组，顺序暴露在辛醇(OCT)或甲基环己醇(MCH)两种气味中各60s，其间暴露在新鲜空气中45s。当果蝇暴露在第1种气味时接受电击(15s的脉冲，间隔3. 5s,60V) (CS+)， 但是在暴露在第2种气味时不接受电击(CS-)。为了测量果蝇的“瞬时记忆(也称学习)”， 果蝇在训练后立即转移到T-迷宫进行两种气味的强迫选择2分钟，期间果蝇被捕捉到各自的T-迷宫臂上，被麻醉和记数。从T-迷宫果蝇的分布可计算出表现指数(PI)。相应的一组果蝇被训练和检测，分别用OCT作为CS+和MCH作为CS+。从这两组果蝇得到的Pis最终被平均(η = 1)和乘100。PI = 0代表50 50的分布，而PI = 100代表100%回避被电击的气味。结果显示1)过表达dZipl和dZiplRNAi均改善了 Αβ42表达引起的果蝇早期记忆缺陷。与对照(UAS-Ai342)果蝇相比，表达Ai3 42(ElaV-Gal4 >UAS-Ai3 42)引起羽化5天的果蝇即出现记忆缺陷。过表达dZIPl (Elav-Gal4 > UAS-Aβ 42/UAS-dZipl)禾口 dZipIRNAi (Elav_Gal4 > UAS-A β 42/UAS-dZipIRNAi 1#)均显著改善了 A β 42 表达引起的果蝇早期记忆缺陷(t测验广卞<0.001)(图9) ；2)不表达A β 42的情况下，过表达dZipl 和dZiplRNAi对早期5天果蝇的记忆无显著影响(Elav-Gal4 > UAS-dZipl或Elav_Gal4 > UAS-dZipIRNAi 1#相对于Elav-Gal4)，尽管过表达dZipl使果蝇记忆指数有升高(图10)。 说明dZiplRNAi对Αβ 42果蝇学习记忆的改善是通过减少了 Zn，因而，避免了 Zn与Αβ42 强的互作引起的。实施例5 过表达dZIPl和dZIPlRNAi对A β 42果蝇神经退变的影响通过对不同基因型果蝇脑石蜡切片进行组化免疫和苏木精-伊红染色，研究了过表达dZipl和dZiplRNAi对Αβ 42果蝇脑部A β 42蛋白积聚和神经退变的影响。果蝇脑部的空泡是由于Αβ 42沉积引起的脑神经原细胞死亡，因而空泡大小和数量可以作为果蝇脑神经退变严重程度的标志。具体操作如下一、果蝇脑组织的石蜡切片制作1)固定收集对照组及处理组果蝇，麻醉后将其放入果蝇包埋夹中。室温条件下， 将果蝇放入Carnoy固定液(无水乙醇三氯甲烷；冰醋酸=6 3 1)中，4°C冰箱中过夜。2)脱水果蝇在无水乙醇中洗两次，每次30分钟； 在干无水乙醇中洗60分钟；在苯甲酸甲酯中浸泡过夜。3)透蜡在58°C恒温箱中放入预先预备好的苯甲酸甲酯与石蜡1 1的混合液中 60分钟；随后投入熔化了的各杯石蜡中，重复8次，每次20分钟。4)包埋将果蝇夹放入事先做好的包埋盒中，调整位置，放入熔化的石蜡中，冷凝成块，放入4°C冰箱过夜。5)切片对蜡块进行修正，并固定在木块上，在切片机上切6微米厚的连续切片。 将切片转移到经过APES (3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷)处理过的载玻片上进行展片，待石蜡切片完全展开后，调整切片位置，去掉多余的水，并在40°C温箱中烤片。二、苏木精_伊红染色法观察果蝇脑结构(1)脱蜡切片在室温二甲苯中脱蜡3次，每次15分钟。(2)复水切片依次经100%、95%、85%、70%、50%酒精、蒸馏水，各级为3分钟。(3)染色苏木精染液染色3-5分钟，蒸馏水充分冲洗多余染液，0. 5%盐酸酒精 (70%酒精配制)分色片刻。镜检控制，约数10秒钟，蒸馏水冲洗；伊红染液染色约数十秒。(4)脱水及透明切片依次经70%、85%、95%、100%酒精脱水，各级为2分钟；二甲苯中透明2次，共约10分钟。(5)封片擦去切片周围多余二甲苯，迅速滴加适量中性树脂，加盖玻片封固。三、免疫组化方法检测A β 42蛋白在果蝇脑部的沉积石蜡切片脱蜡至水后，蒸馏水洗2分钟Χ3。将切片放入盛有抗原修复液(IOmM柠檬酸钠，ΡΗ6. 6)的容器中煮沸15分钟，冷却至室温，用PBS洗1分钟X3。免疫组化使用抗生物素_生物素_过氧化物酶复合物法(VECTASTAIN ABC试剂盒，VectorLaboratories Inc. USA)。A β 42 — 抗(Promega)用 1 500 稀释度，二抗用 1 200 稀释度， DAB(Sigma-Aldrich)法进行显色。光学显微镜下观察不同基因型果蝇脑结构和A β 42沉积，统计脑部空泡数目。结果显示，过表达dZipl加剧了 Αβ42引起的神经退变(图11D，E，H，脑部皮层和神经髓出现很多空泡)和Αβ42沉积(图11Ε，Η)。平均每个果蝇脑部有20个空泡(图12，t测验，#Ρ < 0. 001)。dZipIRNAi则减缓了 Aβ 42引起的神经退变(图11C，F，I，脑部皮层和神经髓几乎没有空泡)及Αβ 42沉积(图12F，I，)。平均每个果蝇脑部有4-5个空泡(图12，t 测验，**P <0.01),而对照A β 42果蝇脑平均每个有12个空泡。实施例6 过表达dZipl和dZiplRNAi对Αβ 42果蝇爬行能力和寿命的影响一、果蝇爬行能力检测不同基因型的果蝇羽化后置于正常食物管中培养，每管20只，每2-3天换一次新食物。每隔5天对果蝇的爬行能力进行检测。检测参照Iijima et al. (2004)的方法，每基因型约20只果蝇置于无食物的透明塑料培养管中，轻拍管使果蝇至管底，然后迅速置于红光灯下(Kodak，GBX-2,安全灯滤膜)记数18秒后爬到顶部的果蝇数目。每次有4组重复，该试验重复三次。结果显示(图14)，与对照Αβ 42果蝇相比，过表达dZipl的Αβ 42 果蝇爬行缺陷显著提早，在羽化后15天即出现显著的运动障碍。与正常Elav-Gal4果蝇相比，Aβ 42果蝇在羽化后30天出现显著的爬行障碍，然而dZiplRNAi果蝇则显著延迟了Aβ 42果蝇的爬行缺陷的出现，其中dZiplRNAi 2#果蝇效果最显著，在羽化后50天仍与正常Elav-Gal4果蝇爬行能力相当。 二、果蝇寿命的检测不同基因型的果蝇羽化后置于正常食物管中培养，每管20-23只，每2-3天换一次新食物。同时对记录每管果蝇的死亡数目，每一基因型设3-4个重复，试验重复4 次。图15示其中一次的代表，数据为3个重复的平均值。与对照A β 42果蝇相比，过表达 dZipl的A β 42果蝇寿命显著缩短，然而dZiplRNAi则显著延长了 A β 42果蝇的寿命，其中 dZipIRNAi 2#果蝇的寿命延长最显著，比Αβ 42果蝇的半寿命延长了近33%。
权利要求
1.一种阿尔茨海默症的靶位蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包括如SEQ IDNo. 3或 SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列。
2.一种阿尔茨海默症的靶位基因hZip，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的靶位基因hZip，其特征在于，所述基因包括如SEQIDNo. 4或 SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列。
4.包括权利要求2所述靶位基因hZip的载体。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为包含所述靶位基因hZip的正义载体或RNAi干扰载体。
6.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为UAST-hZipRNAi0
7.权利要求1所述阿尔茨海默症的靶位蛋白质在制备用于治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。
8.权利要求2所述的阿尔茨海默症的靶位基因hZip在治疗用于治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。
9.权利要求4所述的载体在治疗用于治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种阿尔茨海默症的靶位蛋白质及其编码基因和应用。本发明发现可用于治疗人类神经退行性疾，特别是阿尔茨海默症的靶位基因Zip1，通过RNAi干扰Zip1的表达可以显著改善或延缓阿尔茨海默病人的病症。根据本发明的人阿尔茨海默症的靶位蛋白质包括如SEQ ID No.3或5所示的氨基酸序列，所述基因包括如SEQ ID No.4或6所示的核苷酸序列。根据本发明的靶位基因，通过RNAi干扰可以用于提高AD病人的早期认知能力，减缓或阻抑Aβ蛋白在脑部的沉积及其引起的神经退变，改善运动能力和延长寿命。该发明有望为治疗阿尔兹海默病的提供一新的治疗策略和关键靶位。
文档编号C07K14/47GK102174099SQ20111003166
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月28日 优先权日2011年1月28日
发明者周兵, 王磊, 范强旺, 郎明林 申请人:河北农业大学