专利名称：抗阿尔茨海默症转基因果蝇模型及其在药物筛选中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药及生物领域，具体地说，本发明涉及一种研究阿尔茨海默病(AD) 致病基因APP在体内的剪切作用及其产物β -淀粉样蛋在发病过程中的分子机制以及筛选治疗AD的新药物的新型果蝇模型。
背景技术：
阿尔茨海默症(Alzheimer，s disease,AD)是一种中枢神经系统退行性疾病。近年来已成为仅次于血管病、癌症和脑卒中的第四大杀手。根据世界卫生组织的统计，目前全球阿尔茨海默症患病人数估计在1，800万左右。阿尔茨海默症病人临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。AD的组织病理学表现主要为老年斑(senil印laques，SP)、神经原纤维缠结 (neurofibrillary tangles, NFI1s)，以及由凋亡引起的区域性神经细胞死亡等。其中淀粉样蛋白斑的主要成分是β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Αβ)。阿尔茨海默病的发病机制尚未十分清楚，目前主要有3种假说β淀粉样蛋白级联假说、Tau蛋白假说和血管源性假说。 其中，β淀粉样蛋白级联假说占主导地位，并且研究的较为成熟。β-淀粉样蛋白由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)经过β 分泌酶(0-secretase，BACE)和γ分泌酶(y-secretase)顺序剪切产生。脑内A β来源于其前体物质β淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)。从APP代谢为β 淀粉样蛋白肽过程分两步首先，分泌酶在Αβ的N末端裂解ΑΡΡ，产生可溶的分泌性的APP衍生物APPS-β和贯穿膜成分的C末端片段。C末端片段进一步由Y-分泌酶裂解为Αβ。在某些病理条件下，APP主要经β-分泌酶和Y-分泌酶顺序剪切产生过多的A β， 导致AD病。Y-分泌酶在Αβ产生中起非常重要作用，决定了产生的Αβ42在其中所占的比例。现在认为，此酶至少由presenilin、nicastrin、APHl和Pen2共4种跨膜蛋白组成。 Presenilin即早老蛋白，是Y _分泌酶的催化亚基，现已发现编码早老蛋白1的基因上的一百多个突变都能引起家族性老年痴呆，其致病机制很可能是因为突变体改变Y-分泌酶活性，增加A β 42产生的比例。在过去的几十年里，人们通过转基因小鼠模型成功的在动物身上模拟了多种神经退行性疾病，这使得人们对这些疾病以及治疗都有了深刻的理解。但是由于大多数应用于研究AD的转基因小鼠模型需要耗费大量的时间和金钱，严重的影响了研究的进展。从1918年发现利用果蝇模型研究黑色素沉着细胞瘤以来，人类利用果蝇模型已经在肿瘤、神经变性病、睡眠障碍、糖尿病、肥胖症等的研究方面取得重大突破。新的果蝇模型已用来研究遗传性痉挛性截瘫(Hereditary spastic paraplegia，HSP)、脊髓小脑型共济失调(Spinocerebellar ataxia, SCA)、白血病、PDGF/VEGF受体分子(PVR)基因等，而更多人类遗传及变性疾病都可以利用果蝇得到复制。转基因果蝇模型在研究以AD为代表的变性疾病方面具有许多独到的优势。首先在已知的人类714个遗传性疾病的致病基因中果蝇具有548个同源基因，如Amyloid percursor protein like (APPL)禾口 Presenilin (AD)、huntingtin (Huntington’ s disease, HD，亨廷顿氏病)等。除了具有大量的同源基因外，果蝇的神经退行性疾病模型与人类神经退行性疾病还有许多相似的表型，如迟发性(late onest)、进程性(progressive)、神经系统的高毒性。果蝇体内有一种与人类APP同源性的类似物-类淀粉前体蛋白类似物 (amyloide precursor protein like, APPL)，Luo 实验证实，敲除了 APPL 基因的果蝇在行为学表型方面的缺陷可以在转入了 APPL基因后有所改善。APPL基因突变的表达可以弥补大鼠行为学测试方面的不足，而同样也可以观察到APP基因突变后突触变性，轴突转运和细胞凋亡的改变。由于果蝇的生命周期短，使本发明人能够在很短的时间内就可以在果蝇模型上对神经退行性病变的全过程进行研究。由此可见，综合现有的Αβ果蝇模型和果蝇内源PSl蛋白与人的高度相似性等优势，在果蝇体内重建基于APP蛋白的剪切的Αβ的产生过程。这些已经建立的AD果蝇模型，重现了 AD病症的主要病理特征，包括寿命的缩短，行动能力的缺陷和学习记忆的缺陷， 同时可以检测到由于表达Αβ而造成的神经元毒性。Crowther等人证明ΜΚ-801，一种谷氨酸受体的拮抗剂可以延长AD果蝇的寿命。Iijima等人证明阻止Αβ沉积的物质刚果红可以显著的缓解AD果蝇的行为缺陷，及Αβ毒性造成的神经元损伤。因此，本发明人可以在果蝇中研究AD进程中A β和APP及相关分泌酶的相互作用，并进行针对此过程中参与的各种蛋白为靶点的药物筛选研究，进而揭示致病相关基因和阿尔茨海默症之间可能的联系。因此，本领域有必要开发新的适于实用的果蝇模型，从而有利于为AD的研究和治疗提供新的途径。
发明内容
本申请提供一种制备果蝇模型的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)将UAS-APP品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为TM6B/TMII的果蝇；(2)将UAS-BACE品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为Bl/Cyo、3号染色体为BACE/TM6B的果蝇；(3)将步骤(1)和(2)得到的果蝇品系杂交，然后将所得2号染色体为APP/Cyo、3 号染色体为BACE/TM6B的子代果蝇再自交，获得2号染色体为纯合APP/APP、3号染色体为纯合BACE/BACE的可稳定遗传的果蝇；(4)将UAS-BACE ；DPsn品系果蝇与DB品系的果蝇杂交，再与DB品系回交，获得2 号染色体为Bl/Cyo、3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇；(5)将步骤⑴所获得的果蝇与步骤⑷所获得的果蝇杂交，获得2号染色体为 APP/Cyo、3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇；(6)将步骤(5)所获得的果蝇与步骤(3)获得的2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为BACE/TM6B的子代果蝇杂交，获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体发生染色体重组 DPsn-BACE/DPsn-BACE的表现三性状的果蝇；(7)将步骤(6)所得的果蝇与DB杂交，获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为 DPsn-BACE/TM6B 的果蝇；禾口
(8)将步骤(7)所得果蝇自交，获得2号染色体为纯合APP/APP、3号染色体为纯合 DPsn-BACE/DPsn-BACE的可稳定遗传的果蝇，从而制得果蝇模型。在一个实施例中，所述方法还包括(9)将步骤(8)中获得的果蝇与DB杂交，获得子代果蝇与+/+ ；TM6B/TMII杂交后回交一次，所得到子代果蝇的2号染色体为+/+，3号染色体为DPsn-BACE/lFsn-BACE ；所述的果蝇只表达β -分泌酶和早老素蛋白但不表达底物蛋白ΑΡΡ，由此制得双性状果蝇。
在一个实施例中，所述方法还包括(10)将步骤(8)所获得的果蝇与GAL4 (cha)杂交，获得可在胆碱能神经元内特异的表达目标蛋白的子代；或者(11)将步骤⑶所获得的果蝇与GAL4(elav)杂交，获得可在全神经元内特异的表达目标蛋白的子代。本申请提供一种果蝇体细胞或组织，所述组织共表达APP蛋白和β分泌酶(BACE) 且不过表达或过表达果蝇早老素蛋白(Dpsn)。在一个实施例中，所述果蝇体细胞或组织得自采用包括所述步骤(10)或(11)的方法制得的果蝇。在一个实施例中，所述组织选自果蝇的神经组织。在一个实施例中，所述组织选自果蝇的脑组织。本申请提供本文所述果蝇、其体细胞或组织的用途，用于研究底物APP及其剪切酶β-分泌酶和Y-分泌酶的相互作用、中间剪切产物β APP-CTF (C99)和最终产物淀 β-粉样蛋白过量表达相关疾病的病理过程中的作用、或用于研究APP蛋白剪切过程及 β -淀粉样蛋白过量表达相关疾病的相关性、或用于研究APP蛋白剪切过程及β -淀粉样蛋白过量表达在特异的神经元组织内的病理过程。本申请提供本文所述果蝇、其体细胞或组织的用途，用于筛选分泌酶、Y-分泌酶和/或β-淀粉样蛋白在β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病进程中相互作用的药物； 或用于筛选通过调节分泌酶和/或Y-分泌酶的表达及与其相互作用的靶点蛋白来改善淀粉样蛋白过量表达相关疾病的药物。本申请也提供本文所述的果蝇、其体细胞或组织在制备用于治疗β -淀粉样蛋白过量表达相关疾病用的药物中的用途。在一实施例中，所述的β -淀粉样蛋白过量表达相关疾病是神经退行性疾病。在一实施例中，所述神经退行性疾病是阿尔茨海默症。本申请提供一种筛选改善β -淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质的方法， 所述的方法包括(1)将候选物质与表达β-分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白的体系接触；(2)检测候选物质对β-分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白的影响；其中，若所述候选物质可降低β-分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白表达或活性， 则表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质。在一优选例中，上述步骤(2)中，若所述候选物质可降低β-分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白的表达或活性，且不完全抑制β-分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白的表达， 则表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质。
在另一优选例中，所述方法还包括在特异的大脑组织区域表达目标蛋白，所述候选物质可缓解淀粉样蛋白过量表达的毒性，则表明该候选物质是可用于改善淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质。在另一优选例中，所述方法包括在测试组中，将候选物质加入到表达表达β -分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白的体系中；和/或步骤( 包括检测测试组的体系中β-分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达β -分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白的体系；如果测试组中β-分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白的表达、活性在统计学上低于(优选显著低于，如低10%以上，较佳的低20%以上；更佳的低40%以上)对照组，就表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质。在另一优选例中，所述的体系选自细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、 溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。在另一优选例中，所述方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和 /或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于改善β -淀粉样蛋白过量表达相关疾病有用的物质。本申请还提供一种筛选改善β -淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括按本文所述的制备果蝇模型的方法制备果蝇模型，给予所述果蝇模型候选物质；和检测候选物质对该果蝇模型中β-分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白的影响，或者检测该果蝇模型的行为学；其中，若所述候选物质可降低该果蝇模型中β-分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白表达或活性，则表明该候选物质是可用于改善淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质；或者，若所述候选物质可改变该果蝇模型的行为学、生存率和/或记忆能力，则表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达造成的神经退行性病变症状的潜在物质。在一个实施例中，所述果蝇模型共表达APP蛋白和β分泌酶(BACE)且不过表达或过表达果蝇早老素蛋白(Dpsn)。本申请也包括采用本申请制备方法获得的果蝇模型、其体细胞或组织，以及采用本申请筛选方法筛选得到的物质及其在制备治疗淀粉样蛋白过量表达相关疾病(例如，神经退行性疾病，例如阿尔茨海默症)用的药物中的用途。在本文中，当用于限定制药用途时，“制备”不仅包括将活性成分制成药物，其也可包括药品出厂前的研发、制药等过程。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示建立本发明的果蝇研究模型的具体过程。Ajf UAS-APP品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为APP/Cyo，3号染色体为TM6B/TMII 的果蝇过程。B、将UAS-BACE品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为Bl/Cyo，3号染色体为BACE/TM6B的果蝇过程。C、将A图和B图得到的果蝇品系杂交后，子代果蝇再自交获得2号染色体为纯合APP/APP，3号染色体为纯合BACE/BACE的可稳定遗传的果蝇模型的过程。D、分离UAS-DPsn果蝇，将UAS-BACE/lFsn品系果蝇与DB 品系的果蝇杂交，再与DB回交，获得2号染色体为Bl/Cyo，3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇的过程。E、获得2号染色体为APP/Cyo，3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇的过程。F、获得2 号染色体为APP/Cyo，3号染色体发生染色体重组DPsn-BACE/TM6B的果蝇品系的过程。G、 获得2号染色体为纯合APP/APP，3号染色体为纯合DPsn-BACE/lFsn-BACE的可稳定遗传的果蝇模型的过程。图2显示人源的APP蛋白，β-分泌酶蛋白在果蝇体内表达，果蝇模型的鉴定。Α、 APP蛋白上β-分泌酶和Y-分泌酶的剪切位点示意图。B、人源的ΑΡΡ，β-分泌酶蛋白在果蝇体内表达且能够剪切产生β APP-C端产物。C、AD转基因果蝇体内β-淀粉样蛋白生成的酶联免疫法定量检测结果。D、在果蝇体内可以形成淀粉样蛋白沉淀及免疫荧光检测结果。图3显示AD果蝇行为能力上表现明显的缺陷，而降低β -分泌酶蛋白活性可以一定程度缓解AD果蝇的病症。Α、Κ-Μ曲线观察各种品系的雄性果蝇的生存指标，其中(a)是胆碱能神经元表达，(b)是全神经元表达；β、根据A图中的结果获得的各果蝇的寿命的柱形图；C、爬行实验检测各种果蝇品系的行动能力；其中，行动能力指标反映的是每个平行实验果蝇的爬行速率；D和Ε、降低β-分泌酶蛋白活性可以一定程度提高AD果蝇的生存能力。图4显示安理申和NTI可以显著缓解AD果蝇的行为缺陷。Α、安理申可以显著的延长AD果蝇的寿命，缓解AD果蝇行动能力上的缺陷(胆碱能神经元表达模型)，其中，与溶剂组果蝇相比，安理申可以显著的延长Αβ转基因AD果蝇的寿命。n = 6，*P<0.05。10 μ M 和30 μ M安理申都可以显著的延长Αβ转基因果蝇的寿命，但是对于APP/分泌酶转基因AD 果蝇的效果不明显。与溶剂组果蝇相比，安理申可以显著的缓解Αβ转基因AD果蝇和APP/ 分泌酶转基因AD果蝇的行动能力的缺陷。η = 6，< 0. 05。10 μ M和30 μ M安理申都可以显著的促进A β转基因果蝇和和APP/分泌酶转基因AD果蝇活动能力，30 μ M安理申效果更显著。B、安理申可以显著的延长AD果蝇的寿命，缓解AD果蝇行动能力上的缺陷(全神经元表达模型)，其中，与溶剂组果蝇相比，安理申可以显著的延长Αβ转基因AD果蝇的寿命。η = 6，*Ρ<0. 05。ΙΟμΜ和30μΜ安理申都可以显著的延长Αβ转基因果蝇的寿命，但是对于APP/分泌酶转基因AD果蝇的效果不明显。与溶剂组果蝇相比，安理申可以显著的缓解Αβ转基因AD果蝇和APP/分泌酶转基因AD果蝇的行动能力的缺陷。η = 6，乍 <0.05。IOyM和30μΜ安理申都可以显著的促进Αβ转基因果蝇和和APP/分泌酶转基因AD果蝇活动能力，30 μ M安理申效果更显著。C、NTI可以显著的延长AD果蝇的寿命，缓解AD果蝇行动能力上的缺陷(胆碱能神经元表达模型)，其中，与溶剂组果蝇相比，NTI可以显著的延长A β转基因AD果蝇和APP/分泌酶转基因AD果蝇的寿命。η = 6，*Ρ<0.05。 10 μ M和30 μ M的NTI都可以显著的促进A β转基因果蝇和和APP/分泌酶转基因AD果蝇延长寿命。与溶剂组果蝇相比，NTI可以显著的缓解Αβ转基因AD果蝇和APP/分泌酶转基因AD果蝇的行动能力的缺陷。η = 6，*P < 0. 05。10 μ M和30 μ M的NTI都可以显著的促进A β转基因果蝇和和APP/分泌酶转基因AD果蝇的活动能力，30 μ M的NTI效果更显著。 D、NTI可以显著的延长AD果蝇的寿命，缓解AD果蝇行动能力上的缺陷(全神经元表达模型)，其中，与溶剂组果蝇相比，NTI可以显著的延长A β转基因AD果蝇和APP/分泌酶转基因AD果蝇的寿命。η = 6，*Ρ<0. 05。10 μ M和30 μ M的NTI都可以显著的促进A β转基因果蝇和和APP/分泌酶转基因AD果蝇延长寿命。与溶剂组果蝇相比，NTI可以显著的缓解Αβ转基因AD果蝇和APP/分泌酶转基因AD果蝇的行动能力的缺陷。η = 6，*Ρ<0.05。 10 μ M和30 μ M的NTI都可以显著的促进A β转基因果蝇和和APP/分泌酶转基因AD果蝇的活动能力，30μΜ的NTI效果更显著。Ε、安理申和NTI可以一定程度提高AD果蝇的学习记忆能力。图5显示安理申和NTI不影响外源Αβ的表达，可以一定程度缓解β -淀粉样蛋白沉淀造成的神经元损伤形成的空斑化。Α、免疫蛋白印迹检测安理申和NTI处理后果蝇脑内β-淀粉样蛋白沉积；B、免疫荧光观察安理申和NTI处理后Αβ在各品系的果蝇脑内的表达情况；C、苏木精-伊红染色检测安理申和NTI处理后各品系果蝇脑内神经元损伤空斑化情况。
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，首次开发出了一种新的以果蝇为研究对象的动物模型，所述的果蝇动物模型表达人源的APP蛋白和β-分泌酶蛋白，在果蝇体内重现β-淀粉样蛋白的产生过程及病理特征，从而为神经退行性疾病的研究提供了新的途径。果蝇动物模型为了研究淀粉样蛋白在神经退行性疾病的发生或发展中的作用，本发明人经过广泛的研究，确定淀粉样蛋白前体蛋白APP及其剪切酶形成的完整体系是一个非常重要的影响因素。在此基础上，本发明人进一步开发了适于研究淀粉样蛋白产生过程的动物模型。为了获得合适的动物模型，在动物种类的选择上本发明人作了大量的研究工作， 最终确定以果蝇来制备动物模型。首先，将转基因果蝇用于研究神经退行性疾病，其表现出来的病理症状与在病人身上表现的症状有着惊人的相似；其次，果蝇的遗传背景清晰，基因操作简单，生命周期短，消耗少，这些特点使果蝇成为了研究神经退行性疾病的便利工具； 第三，人源Psn蛋白(参见GenBank登录号ΝΜ_000021.幻与果蝇DPsn蛋白(参见GenBank 登录号ΝΜ_079460. 2)的同源性高，相同性超过50%。人源APP蛋白(参见GenBank登录号ΝΜ_201414. 1)与果蝇APPL蛋白(参见GenBank登录号ΝΜ_057278. 3)的同源性也很高，相同性达到40%，说明了它们的保守性，可见利用果蝇研究可以准确地反映人类的实际情况，具有良好的借鉴意义。上述特点使得果蝇成为研究β-淀粉样蛋白产生过程的调节， 以及筛选新的神经退行性疾病(如AD)治疗药物的有利工具。在确定了动物模型后，本发明人进一步确定了建立模型的方案，即制备表达APP 及剪切酶的、在体的重现APP的剪切过程及生成β-淀粉样蛋白沉淀，(Αβ形成的老年斑是神经退行性疾病的标志)，又是分泌酶蛋白表达异常的模型以观察调节分泌酶蛋白的异常对于A β产生的影响，以及观察APP蛋白及其产物β APP-C端产物(C99和C83)，β -淀粉样蛋白的异常对于神经退行性疾病(如AD疾病)的发生和发展的影响。为了实现该方案，本发明人利用现有技术中已知的果蝇品系，通过GAL4/UAS转基因体系以及平衡致死体系等，经过多代杂交获得稳定的、可遗传的亲本果蝇品系。一种果蝇品系的2号染色体为 APP/APP，3号染色体为BACE/BACE ；另一种果蝇品系的2号染色体为APP/APP，3号染色体为 DPsn-BACE/lFsn-BACE。本发明人最终获得了适于研究神经退行性疾病(如AD)的两种果蝇模型，一种果蝇品系的2号染色体为APP/APP，3号染色体为BACE/BACE ；APP经过BACE的剪切产物βΑΡΡ-C端产物可以通过果蝇内源的DPsn进一步剪切产生β-淀粉样蛋白 ’另一种果蝇品系的2号染色体为ΑΡΡ/ΑΡΡ，3号染色体为DPsn-BACE/lFsn-BACE，对比第一种果蝇模型具有更显著的病理表型。本发明人通过行为学实验和生存实验发现，两种果蝇模型在生存及行为能力上，以及学习记忆能力(此症状病理表现与AD病人的症状相符)明显有别于以前的AD果蝇模型。以往的果蝇模型主要是毒性模型，通过在果蝇眼睛内表达看Αβ的毒性作用。本申请的APP/BACE果蝇模型明显不同于以往的Αβ过表达的模型(仅仅是毒性模型)，本模型可以同时模拟Αβ的产生过程及Αβ的毒性作用，不仅能够真实的反映AD病理特征，而且可以进行有效地行为学指标检测(之前眼睛表达的模型不能做行为检测)，这些指标可以作为药物处理后与AD病人相关的指标进行高效的筛选。此外，研究表明AD的发病过程中胆碱能受体有非常重要的作用，前者胆碱能表达模型可以用作靶向胆碱能神经元的药物筛选和机制的研究，后者全神经元表达模型可以在果蝇体内重现AD神经退行性病变的过程。而采用本申请的果蝇模型进行的行为学检测是建立在胆碱能神经元和全神经元表达的基础上。如本文所用，各基因标记解释如下“Cyo” 位于果蝇的2号染色体上，为果蝇的卷翅标记物，带有该标记的纯合致死， 杂合子果蝇表现为卷翅，不能飞行，不带有该标记的果蝇表现为正常直翅。“TM6B” 位于果蝇的3号染色体上，带有该标记的纯合子果蝇表现为死亡，杂合子果蝇表现为第一胸节两侧形成多且短的毛簇，不带有该标记的果蝇表现为第一胸节两侧为正常的2根长的刚毛。"TMII"位于果蝇的3号染色体上，带有该标记的纯合子果蝇表现为死亡，杂合子果蝇表现为平衡棒末端长有两根短毛，不带有该标记的果蝇表现为第一胸节两侧为平衡棒末端无毛。“Bi” 位于果蝇的2号染色体上，带有该标记的纯合子果蝇表现为死亡，杂合子果蝇表现为胸节短毛，不带有该标记的果蝇表现为胸节刚毛正常。"Elavcl55"为全神经元表达驱动GAL4，具有红眼筛选标记。“UAS-APP“在UAS下为APP表达基因，具有红眼筛选标记。“UAS-BACE“在UAS下为BACE表达基因，具有红眼筛选标记。“X” 表示果蝇的一条性染色体，即X染色体。“y” 表示果蝇的一条性染色体，即Y染色体。“ + ” 其连接于基因标记的后面，表示该基因标记存在于果蝇染色体上；或者其单独存在，表示野生型的染色体。“_”:其连接于基因标记的后面，表示该基因标记不存在于果蝇染色体上。本发明还提供了所述的果蝇模型或其体细胞或组织(如脑组织)的用途，用于研
10究淀粉样蛋白过量表达相关疾病中淀粉样蛋白产生过程的相互作用；或用于筛选通过调节(优选降低)分泌酶的表达来改善淀粉样蛋白过量表达相关疾病的药物。对本发明的果蝇模型进行研究发现，对于分泌酶的调节可以显著改变转基因生成 Αβ产生的AD的病理进程。因此，可利用该果蝇模型筛选治疗AD疾病的新型靶点药物。因此，本发明人通过降低或拮抗分泌酶蛋白在AD转基因果蝇中的活性或者表达， 显著的缓解了 AD的病症，证明APP的剪切过程在AD进程中的重要作用以及正常的生理功能中有着至关重要的作用，从而证明它作为筛选药物新靶点的必要性。可如本文所述的方法制备果蝇模型，并可采用本领域常规的技术手段来检测所制备的果蝇是否具有所需的基因型。例如，可如本申请“实验材料和方法”部分所述的方法对所制得的果蝇的基因型进行鉴定。也可采用本申请“实验材料和方法”部分所述的方法来测定本文所述筛选方法中各种酶的表达情况。药物筛选在得知了所述的APP的剪切过程及对于分泌酶蛋白的调节在β -淀粉样蛋白过量表达相关疾病中的作用后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选调节APP剪切过程的物质，所述物质可用于改善淀粉样蛋白过量表达相关疾病。在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选改善β -淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括将候选物质与表达分泌酶蛋白及产物蛋白的体系接触，检测候选物质对分泌酶蛋白及产物蛋白的影响；若所述候选物质可降低分泌酶的活性蛋白的表达或活性，缓解产物的毒性，则表明该候选物质是可用于改善淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质。更优选地，若所述候选物质可降低分泌酶蛋白的表达或活性，且不完全抑制其表达，则表明该候选物质是可用于改善淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质优选的，在观察时，可同时设置不加入候选物质但表达分泌酶蛋白的体系， 从而可更清晰地分析蛋白表达状况。在本发明中，所述的体系包括(但不限于)溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。所述的体系中可含有APP蛋白和分泌酶蛋白，用于在其中加入候选物质，观察候选物质对分泌酶蛋白的影响；或者，所述的体系中可同时含有分泌酶蛋白以及产物Αβ蛋白，用于在其中加入候选物质，同时观察候选物质对于分泌酶蛋白以及Αβ蛋白的影响。为了进一步选择和确定对于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病真正有用的物质，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验。在另一种方法中，可如前文所述使用采用本申请所述的方法制备得到的果蝇模型、通过检测果蝇模型的行为学、生存率和/或记忆能力的变化或改变来筛选可用于改善
淀粉样蛋白过量表达造成的神经退行性病变症状的潜在物质。通常，对于果蝇模型的行为学的变化或改变，如果较溶剂对照组AD果蝇的爬行能力显著性提高5%以上(效果佳)、 10%以上(效果较佳)、20%以上(效果极佳)，则认为该候选物质为可用于改善淀粉样蛋白过量表达造成的神经退行性病变症状的潜在物质；对于生存率，如果较溶剂对照组 AD果蝇的生存率显著性提高5%以上(效果佳)、10%以上(效果较佳)、20%以上(效果极佳)，则认为该候选物质为可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达造成的神经退行性病变症状的潜在物质；对于学习能力，如果较溶剂对照组AD果蝇的学习能力显著性改善5%以上(效果佳)、10%以上(效果较佳)、20%以上(效果极佳)，则认为该候选物质为可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达造成的神经退行性病变症状的潜在物质。可对上述单一指标进行检测，也可检测行为学、生存率和学习能力中的任意两种或所有三种。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病确实有用的物质。因此，本发明还包括通过所述的筛选方法获得的物质，所述的物质可用于改善 β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病。本发明的主要优点在于(1)提供了一种用于研究神经退行性疾病(如AD疾病)中Αβ和产生过程中的关键酶蛋白相互作用及以两者作为筛选药物的靶点的果蝇动物模型。将神经退行性疾病疾病中的主要标志即Αβ形成的老年斑及其产生过程作为研究对象，同时可针对机制的研究和未知的神经退行性疾病治疗药物的筛选。(2)所述的动物模型制备成本低廉，具有极可靠的研究价值。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)或William Sullivan等人的《果蝇实验指南》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。本发明中所使用的果蝇品系UAS-A β 1是来自英国剑桥大学D. A. Lomas实验室，果蝇品系UAS-APP，UAS-BACE来自于果蝇遗传及分子生物学数据库Qndiana University)。本发明人在实施例中所使用的一些果蝇带有GAL4-UAS表达系统，其中，UAS-APP, UAS-BACE用于将外源的APP或BACE转入子代果蝇；GAL4 (elavcl55)果蝇用于将UAS所带基因表达于子代果蝇神经元中的elavcl55果蝇系；GAL4(cha)果蝇用于将UAS所带基因表达于子代果蝇胆碱能神经元中的cha果蝇系果蝇品系。实施例中所用DB果蝇(购自中国科学院上海神经所)为平衡子转基因果蝇，其2、3号染色体上插入了带有不同筛选标记(Cyo、 B1、TM6B、TMII)的平衡子，用于果蝇的杂交和稳定遗传。以下将以具体实施例的方式对本发明进行详细的说明。应理解，本发明并不限于这些具体实施方式
。实验材料和实验方法转基因果蝇品系·实验所用的Αβ转基因果蝇模型包括表达野生型Aβ 42低表达的转基因果蝇 (UAS-A β 1)，A β 42高表达的转基因果蝇(UAS-A β 2)和表达arctic突变体A β 42的转基因果蝇(UAS-A β arc)。· APP/BACE转基因果蝇模型包括表达APP蛋白的转基因果蝇(UAS-APP)，共表达 APP和BACE的转基因果蝇(UAS-APP ；BACE)，共转APP、BACE和果蝇的突变基因PSnlL235P的转基因果蝇(UAS-APP ；BACE ；dPSnL235P)。实验用了两种GAL4品系的果蝇，分别是全神经元表达的elaVel55-GAL4和胆碱能神经元表达的cha_GAL4。交配后子一代Fl经基因型和蛋白表达鉴定后用于实验。文中所使用的果蝇品系UAS-Aiiarc是来自英国剑桥大学 Dr. D. A. Lomas实验室，果蝇品系UAS-A β 2由剑桥大学医学研究所Dr. Damian Crowther提供。所有文中用到的转基因果蝇列表参见图表1。表 权利要求
1.一种制备果蝇模型的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)将UAS-APP品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为 APP/Cyo、3号染色体为TM6B/TMII的果蝇；(2)将UAS-BACE品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为Bl/Cyo、3号染色体为BACE/TM6B的果蝇；(3)将步骤(1)和(2)得到的果蝇品系杂交，然后将所得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为BACE/TM6B的子代果蝇再自交，获得2号染色体为纯合APP/APP、3号染色体为纯合 BACE/BACE的可稳定遗传的果蝇；(4)将UAS-BACE；DPsn品系果蝇与DB品系的果蝇杂交，再与DB品系回交，获得2号染色体为Bl/Cyo、3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇；(5)将步骤(1)所获得的果蝇与步骤(4)所获得的果蝇杂交，获得2号染色体为APP/ Cyo,3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇；(6)将步骤(5)所获得的果蝇与步骤(3)获得的2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为BACE/TM6B的子代果蝇杂交，获得2号染色体为APP/Cyo，3号染色体发生染色体重组 DPsn-BACE/DPsn-BACE的表现三性状的果蝇；(7)将步骤(6)所得的果蝇与DB杂交，获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为 DPsn-BACE/TM6B 的果蝇；禾口(8)将步骤(7)所得果蝇自交，获得2号染色体为纯合APP/APP、3号染色体为纯合 DPsn-BACE/DPsn-BACE的可稳定遗传的果蝇，从而制得果蝇模型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括(9)将步骤(8)中获得的果蝇与DB杂交，获得子代果蝇与+/+；TM6B/TMII杂交后回交一次，所得到子代果蝇的2号染色体为+/+，3号染色体为DPsn-BACE/lFsn-BACE ；所述的果蝇只表达β -分泌酶和早老素蛋白但不表达底物蛋白ΑΡΡ。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括(10)将步骤(8)所获得的果蝇与GAL4(cha)杂交，获得可在胆碱能神经元内特异地表达目标蛋白的子代；或者(11)将步骤(8)所获得的果蝇与GAL4(elav)杂交，获得可在全神经元内特异地表达目标蛋白的子代。
4.一种果蝇体细胞或组织，其特征在于，所述组织共表达APP蛋白和β分泌酶(BACE) 且不过表达或过表达果蝇早老素蛋白(Dpsn)。
5.如权利要求4所述的果蝇体细胞或组织，其特征在于，所述组织选自果蝇的神经组织。
6.权利要求1-3中任一项方法所制备得到的果蝇、或权利要求4或5所述的果蝇体细胞或组织的用途，其特征在于，(a)用于研究底物APP及其剪切酶β-分泌酶和Y-分泌酶的相互作用；(b)用于研究中间剪切产物βAPP-CTF(C99)和最终产物淀粉样蛋白过量表达相关疾病的病理过程中的作用；(c)用于研究APP蛋白剪切过程及淀粉样蛋白过量表达相关疾病的相关性；(d)用于研究APP蛋白剪切过程及淀粉样蛋白过量表达在特异的神经元组织内的病理过程；(e)用于筛选分泌酶、Y-分泌酶和/或淀粉样蛋白在淀粉样蛋白过量表达相关疾病进程中相互作用的药物；(f)用于筛选通过调节分泌酶和/或Y-分泌酶的表达及与其相互作用的靶点蛋白来改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的药物；或(g)用于制备用于治疗淀粉样蛋白过量表达相关疾病用的药物。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病是神经退行性疾病。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病是阿尔茨海默症。
9.一种筛选改善淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质的方法，其特征在于， 所述的方法包括(1)将候选物质与表达分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白的体系接触；(2)检测候选物质对分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白的影响；其中，若所述候选物质可降低分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白表达或活性，则表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质。
10.一种筛选改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质的方法，其特征在于， 所述方法包括如权利要求1-3中任一项所述的方法制备果蝇模型；给予所述果蝇模型候选物质；和检测候选物质对该果蝇模型中分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白的影响，或者检测该果蝇模型的行为学；其中，若所述候选物质可降低该果蝇模型中分泌酶蛋白或Y-分泌酶组分蛋白表达或活性，则表明该候选物质是可用于改善淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质；或者，若所述候选物质可改变该果蝇模型的行为学、生存率和/或记忆能力，则表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达造成的神经退行性病变症状的潜在物质。
全文摘要
本发明涉及筛选阿尔茨海默病治疗药物的模型的建立及应用，目的是提供于针对阿尔兹海默病症的发病进程的分子通路的研究，和进行药物筛选的转基因果蝇模型。本发明通过将现有的转基因果蝇连续杂交获得稳定可遗传的新型果蝇品系。该新型的疾病模型可以模拟阿尔兹海默病症主要致病基因在体内的产生和代谢过程，重现疾病的发病过程，并通过与病症密切相关的各种指标，包括生存曲线、行动能力、学习记忆指数以及体内实验证明该果蝇模型在各方面明显有别于其他阿尔茨海默病果蝇。
文档编号C12Q1/02GK102265806SQ20111012325
公开日2011年12月7日 申请日期2011年5月12日 优先权日2010年5月13日
发明者刘佳, 裴钢, 赵简 申请人:中国科学院上海生命科学研究院