养血清脑制剂在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用的制作方法

养血清脑制剂在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本申请公开了一种中药组合物用于治疗阿尔茨海默氏(老年痴呆)中应用；具体公开了该中药组合物可以显著清除早中期阿尔茨海默脑内老年斑的作用，该作用的主要机理为该中药组合物清除脑内Aβ蛋白、促进APP的生理性α切割、促进了的可溶性神经营养性sAPPα蛋白的生成、促进APP的生理性α切割、抑制致病性γ分泌酶早老素PS1。
【专利说明】养血清脑制剂在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用

【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种中药组合物制剂的新用途，特别涉及养血清脑制剂在制备治疗阿 尔茨海默症（老年痴呆）的药物中的应用。

【背景技术】：
[0002] 养血清脑颗粒是天津天士力制药股份有限公司研制的现代中药制剂，并于1996 年获得国家新药证书，并于1999年被列入国家基本药物目录，2000年被列入国家医保药品 目录。养血清脑颗粒是由当归、川芎、白芍、钩藤、鸡血藤、熟地黄、决明子、夏枯草、细辛、延 胡索和珍珠母11味中药，经现代高科技手段提取后，加入适当辅料，经混合制粒等制剂过 程制成的一种颗粒剂。该制剂具有有效成分溶出快，生物利用度高等优点。养血清脑颗粒 具有养血平肝，活血通络的功效，可用于血虚肝亢所致的头痛、眩晕眼花、心烦易怒、失眠多 梦等病症，在临床上具有显著的疗效。
[0003] 养血清脑制剂为现有技术，中国专利93100050. 5描述了其配方及制备方法，该专 利描述的配方还可以根据制剂学常规技术制备成不同的剂型，如片剂，胶囊，口服液等。
[0004] 阿尔茨海默症（Alzheimer disease，AD)，也称为老年痴呆症，是一种起病隐匿的 进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损 害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。65岁以前 发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。
[0005] 目前治疗阿尔茨海默症的药物包括：多奈哌齐（donepezil)，利斯的 明（Rivastigmine),加兰他敏（Galantamine),石杉碱甲（Huperzine A)，美金刚 (Memantine),司来吉兰（Selegiline),维生素 E，褪黑素，银杏提取物（gingko bilobi)，批 拉西坦（piracetam脑复康）、茴拉西坦（aniracetam阿尼西坦，三乐喜）、萘非西坦等。
[0006] 本发明经过研究，意外的发现养血清脑制剂具有治疗阿尔茨海默症的作用。


【发明内容】
：
[0007] 本发明提供一种中药组合物的新用途，特别涉及养血清脑制剂的新的医药用途。 具体的，本发明提供一种中药组合物在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。所述应用 在于中药组合物可以用于清除阿尔茨海默脑内老年斑。
[0008] 本发明所述中药组合物是由如下重量百分的药材制备而成：当归6. 75%、川芎 6. 75%、白芍5. 4%、钩藤13. 5 %、鸡血藤13. 5 %、熟地黄5. 4%、决明子13. 5 %、夏枯草 13. 5%、细辛1. 34%、延胡索6. 75%和珍珠母13. 5%。
[0009] 制备工艺为：药材经前序处理一水提一浓缩一乙醇沉淀一回收乙醇一浓缩成膏一 混合制剂。
[0010] 所述制剂包括任何一种可服用的剂型，优选口服制剂，如：颗粒剂，丸剂，片剂，胶 囊，口服液。
[0011] 本发明所述的应用，在于该中药组合物使记忆认知能力显著提高。
[0012] 本发明所述的应用，在于该中药组合物能够提高大脑皮层及海马组织中脑源性神 经生长因子、神经生长因子及其受体TrkA的表达，改善海马神经元超微结构的异常。
[0013] 本发明所述的应用，在于该中药组合物能够增加大脑皮层总抗氧化能力及GSH含 量，提高SOD、GSH - px活性，减少MDA含量。
[0014] 本发明所述的应用，在于该中药组合物能够提高大脑皮层及海马突触素及突触后 致密物95的表达，改善海马突触结构的异常。
[0015] 本发明所述的应用，在于该中药组合物能够提高大脑皮层及海马组织中乙酰胆碱 的表达，提高海马胆碱乙酰转移酶及大脑皮质Ml胆碱受体的表达。
[0016] 本发明所述的应用，在于该中药组合物用于清除阿尔茨海默脑内老年斑。
[0017] 本发明所述的应用，在于该中药组合物能够清除脑内Αβ蛋白，降低脑内Αβ蛋白 的生成。
[0018] 本发明所述的应用，在于所述应用在于该中药组合物能够抑制致病性Y分泌酶 早老素 PSl的表达水平抑制APP的病理性切割，促进APP发生生理性α剪切的作用。
[0019] 本发明所述该中药组合物的优选提取方法为：
[0020] 取权利要求1中所述的中药组合物处方量的各药材备用：
[0021] ⑴提取物1的制备：当归、川；、延胡索、决明子加乙醇加热回流提取，滤过，除 杂,回收乙醇并浓缩,备用；
[0022] (2)提取物2的制备：白芍加乙醇加热回流提取，滤过，回收乙醇并浓缩，备用；
[0023] (3)提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加水煎煮，滤过， 浓缩，加乙醇静置，滤过，回收乙醇并浓缩，备用；
[0024] (4)制剂的制备：取以上3种提取物，加入适量辅料，制剂，即得。
[0025] 另一优选的制备方法为：
[0026] (1)提取物1的制备：当归、川弯、延胡索、决明子加入3?6倍量50?80%乙醇 加热回流提取2?3次，第一次0. 5?2. 5小时，第二、三次0. 5?2小时，滤过，除杂，回收 乙醇并浓缩至相对密度1. 250?1. 350 (70?80°C )，备用；
[0027] (2)提取物2的制备：白芍加入3?6倍量50?80%乙醇，浸渍，加热回流提取 2?3次，第一次0. 5?2. 5小时，第二、三次0. 5?2小时，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密 度 L 10 ?L 35 (55 ?65°C )，备用；
[0028] (3)提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入4?10倍量 水煎煮2?3次，第一次0. 5?3小时，第二、三次1?3小时，滤过，浓缩至相对密度1. 06? 1. 10(75?85°C )，加乙醇使含醇量为60?85%，静置12?24小时，滤过，回收乙醇，浓缩 至相对密度L 270?L 350 (75?85°C )，备用；
[0029] (4)制剂的制备：取以上提取物，加入适量辅料，制剂，即得。
[0030] 最优选的制备方法为：
[0031] (1)提取物1的制备：当归、川；、延胡索、决明子加入4倍量70%乙醇加热回流 提取2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至相对密度1. 300? 1.310(74?76°〇，备用；
[0032] (2)提取物2的制备：白芍加入4倍量60%乙醇，浸渍，加热回流提取2次，第一次 2小时，第二次1小时，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度1. 23?1. 33 (65°C )，备用；
[0033] (3)提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入5倍量水 煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，浓缩至相对密度1. 06?1. 10 (80°C )，加乙 醇使含醇量为65?70%，静置12?24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1. 320? 1. 325(79 ?81°C )，备用；
[0034] (4)制剂的制备：取以上提取物，加入适量辅料，制剂，即得。
[0035] 本发明所述应用是经过实验观察获得的，其使用了该中药组合物制剂中的一种， 即天士力制药股份有限公司生产的"养血清脑颗粒"作为实验药品，任何与养血清脑颗粒具 有相同处方经提取得到的提取物均具有与养血清脑颗粒相同的用途。
[0036] 实验结果如下：
[0037] 实验一、养血清脑颗粒对轻中度阿尔茨海默症模型鼠脑内β -淀粉样斑块的清除 作用和记忆认知能力改善作用研究
[0038] 摘要APPswe/PSldE9双转基因小鼠是国际公认的阿尔茨海默症（Alzheimer，s Disease，AD)模型鼠，6月龄APPswe/PSldE9转基因脑内开始出现了老年斑，模拟人类中轻 度阿尔茨海默症。4月龄APPswe/PSIdE9双转基因阿尔茨海默症模型小鼠连续60天，口服养 血清脑颗粒48g生药/kg (高剂量）和16g生药/kg (低剂量），或对照药物安理申I. 03mg/ kg至小鼠6月龄，发现口服养血清脑颗粒一个月和二个月后，小鼠记忆认知能力显著提高， 且作用效果优于阳性药物安理申组。通过脑组织切片的刚果红染色和免疫组织化学染色实 验证明养血清脑颗粒清除早中期阿尔茨海默症模型鼠大脑β-淀粉样斑块（老年斑）的显 著作用，从小鼠大脑海马区和皮质区β_淀粉样斑块（老年斑）的个数、覆盖面积和着色程 度方面，养血清脑颗粒对脑内老年斑的清除率达60-90%，显著高于阳性药物安理申组。人 淀粉样蛋白前体APP(β-amyloid precursor protein)的异常剪切是阿尔茨海默症发病的 关键，进一步通过转基因小鼠脑内APP的关键剪切酶和剪切产物的检测，证明养血清脑颗 粒通过提高脑内APP的生理性切割途径并抑制APP病理性切割途径，从而降低了 β -淀粉 样斑块在脑内的形成和沉积。本研究充分证明养血清脑颗粒对轻中度阿尔茨海默症有很好 的治疗效果。
[0039] 1实验目的
[0040] 养血清脑颗粒是天士力集团有限公司生产的中药复方制剂，临床上主要用于治疗 头痛，改善慢性脑缺血。在长期临床观察中，发现该药还有一定的改善阿尔茨海默症的作 用。本实验室进行了该药对早中期APPsWe/PSldE9双转基因阿尔茨海默症模型小鼠记忆、 认知能力影响，特别是针对阿尔茨海默症特征性病变-β淀粉样蛋白Αβ在脑内的沉积， 利用不溶性Αβ的特异染色、淀粉蛋白识别的刚果红染色等手段，研究了养血清脑颗粒对 早中期APPs We/PSldE9双转基因阿尔茨海默症模型小鼠脑内Αβ老年斑的清除作用，并通 过蛋白剪切途径的研究揭示其作用靶点和机制，为养血清脑颗粒用于治疗轻中度阿尔茨海 默症提供实验依据。
[0041] 2实验材料
[0042] 2. 1受试药品及配制
[0043] 2. L 1受试药物：养血清脑颗粒浸膏（简称养血清脑），黑褐色浸膏，由天士力药业 集团提供，批号=20120514,出膏率13%，相当于每克浸膏含7. 7g生药，用生理盐水配制成 2. 4g、0. Sg生药/ml浓度的溶液，供小鼠灌胃给药用（文中剂量按生药量计），给药体积为 20ml/kg。小鼠用药剂量为高浓度48g生药/kg，低浓度16g生药/kg。
[0044] 阳性对照安理申，市售，每片5mg，卫材（中国）有限公司，批号：111030A，临用时 用生理盐水按0. 〇515mg/ml制成混悬液，供小鼠灌胃给药用，给药体积为20ml/kg。小鼠用 药剂量为安理申l.〇3mg/kg。
[0045] 2. 2实验动物与基因型鉴定
[0046] 实验动物APPSWe/PSldE9双转基因 AD小鼠购自南京大学模式动物研究所。 APPsWe/PSldE9双转基因小鼠是国际公认的阿尔茨海默症模型鼠。如图1所示，APPswe/ PSldE9双转基因小鼠转入了人的瑞典型突变APPswe和第9外显子缺失突变的PSldE92个 基因，可表达人的突变型APP分子，异常剪切产生过量的A β 42多肽，在脑内形成A β斑块 及其他AD病变过程中的组织病理变化，出现AD相应的行为学异常改变。据报道该品系4-5 月龄小鼠时开始在杏仁体和海马出现一些嗜刚果红的斑块（老年斑初期），6月龄开始在大 脑皮质、海马和杏仁体形成大量淀粉样斑块，模拟人类中轻度阿尔茨海默症。
[0047] 我们对用于药物测试的APPswe/PSldE9双转基因 AD小鼠进行了基因型鉴 定。取鼠尾尾尖，加入裂解液和蛋白激酶K10mg/ml，56°C隔夜消化鼠尾。加入酚氯仿 去除蛋白，异丙醇沉淀DNA，70 %冰乙醇洗涤干燥获得鼠尾DNA。采用APPswe引物： 5' -GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3' 和 5' -CTGACTGGTGAGCTGGTCCAAGAC-3' 进行鉴定 APPswe 基因的PCR反应。反应条件：94°C 30sec，69°C 60sec，72°C 60sec，30循环。经PCR扩增，转 基因鼠中出现APP基因特异条带，大小为350bp，而背景鼠无条带产生。利用PCR方法对所 有实验鼠进行了基因型鉴定，保证了所有实验鼠为阳性纯合子的转基因鼠，如图1-1所示。
[0048] 图l-lAPPswe/PSldE9转基因鼠的基因型鉴定
[0049] 2. 3实验试剂及配制
[0050] 2. 3. 1 试剂
[0051] 多聚甲醒（Sigma)、戊巴比妥钠（Genview)、刚果红、苏木精、氧化萊（Sigma)、DAB 显色试剂盒（北京鼎国）、鼠兔通用型免疫二抗（Proteintech)，浓氨水、无水乙醇、浓盐 酸、甘油、甲醇、柠檬酸、柠檬酸三钠、二甲苯（北京化工）。TEMED、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰 胺、Tris、Gly、考马斯亮蓝 R250、BSA(Sigma)、Triton X-100 (Genview)、蛋白质标准分子量 (北京全式金）、Tween-20 (BBI)，兔抗鼠 β-Actin抗体（武汉博士德）、HRP标记山羊抗兔 IgG (北京全式金）、ECL光化学试剂盒（碧云天）。
[0052] 刚果红染色液与苏木精染色液：取0. 5g刚果红粉末和20ml甘油加至80ml甲醇 中，配制成0.2%刚果红染色液。取20g硫酸铝钾溶于200ml蒸馏水，KKTC溶解。取苏木精 Ig溶于IOml无水乙醇，加至硫酸铝钾水溶液中煮沸，加入0. 5g氧化汞，继续加热并搅拌至 溶液为深紫色，立即冷却过滤，配制成苏木精染色液。
[0053] 2. 4实验主要仪器
[0054] Y型迷宫系统（RD1102-YM)，垂直电泳仪和电源系统（北京六一厂），半干转膜 仪（BIO-RAD)。DP70正置显微镜和摄影系统（OLYMPUS)，应用显微镜图像处理软件DP Controller米集图片。
[0055] 3实验方法
[0056] 3. 1实验分组及给药
[0057] 实验动物APPswe/PSldE9双转基因 AD小鼠随机分为生理盐水对照组、养血低浓度 组、养血高浓度组和安理申组，雌雄各半，各组16只，在实验过程中，生理盐水组和安理申 组各有2只死亡，每组14-16只，体重20-40g。常规饲养，自由饮水，4月龄APPswe/PSldE9 转基因鼠连续灌胃给药，给药容积每25g体重灌胃0. 5ml。灌胃给药至6月龄。
[0058] 表1试验分组及给药量
[0059]

【权利要求】
1. 一种中药组合物在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用，其中所述中药组合物由 如下重量配比的药物制备而成：当归6. 75%、川芎6. 75%、白芍5. 4%、钩藤13. 5%、鸡血藤 13. 5%、熟地黄5. 4%、决明子13. 5%、夏枯草13. 5%、细辛1. 34%、延胡索6. 75%和珍珠母 13. 5%。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物用于清除阿尔茨海默 脑内老年斑。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物能够清除脑内AP蛋 白，降低脑内A0蛋白的生成。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物能够抑制致病性Y分 泌酶早老素 PS1的表达水平抑制APP的病理性切割，促进APP发生生理性a剪切的作用。
5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物使记忆认知能力显著 提1?。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物能够提高大脑皮层及 海马组织中脑源性神经生长因子、神经生长因子及其受体TrkA的表达，改善海马神经元超 微结构的异常。
7. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物能够提高大脑皮层及 海马突触素及突触后致密物95的表达，改善海马突触结构的异常。
8. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物能够增加大脑皮层总 抗氧化能力及GSH含量，提高SOD、GSH-px活性，减少MDA含量。
9. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物能够提高大脑皮层及 海马组织中乙酰胆碱的表达，提高海马胆碱乙酰转移酶及大脑皮质Ml胆碱受体的表达。
10. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述该组合物选自：颗粒剂，丸剂，片剂，胶 囊，口服液。
【文档编号】A61P25/28GK104435306SQ201410483630
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】吴迺峰 申请人:天士力制药集团股份有限公司