1.一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法,其特征在于:包括
试验材料:玉米单倍体诱导系东诱1号、L7和JY3,为东北农业大学农学院玉米课题组选育,具有R-nj标记;用于创建单倍体的F1杂交种,其母本为转玉米精氨酸酶ZmARG基因玉米HiII的T2代株系,父本为合344;上述常规玉米材料公众可从东北农业大学农学院玉米课题组获得;
试验方法:
材料的种植:采用随机区组设计,3次重复,双行区,行长5m,株距30cm,行宽70cm,每行17株;两地田间管理标准一致,同普通玉米生产田;5米行长,株距30cm,行距70cm;杂交种一次播种,时间为当年4月29日,诱导系分3期播种,时间分别为当年4月29日,5月7日和5月11日;
授粉:用诱导系给F1杂交种授粉,挂牌记录授粉时间,每个诱导系至少授10株;
组织培养的试验流程:
培养基:
(1)筛选培养基:MS液体培养基+100uM ABA;
(2)加倍培养基:MS液体培养基+2mg/L天冬酰胺+1mg/L BAP+0.05%的秋水仙素;
(3)生长培养基:MS固体培养基;
操作方法:
(A)幼穗的消毒
分别在授粉后18d,20d取幼穗,剥去苞叶,在75%乙醇中灭菌8min,0.1%HgCl2消毒6min,无菌水冲洗3次;
(B)幼胚的剥取:
取幼胚,盾片朝下置于培养皿中用筛选培养基浸润的无菌滤纸上,28℃,16h光照/8小时黑暗,培养24h;
(C)单倍体幼胚的加倍:
挑选出盾片无色素沉着的单倍体幼胚,盾片朝上接种到培养皿中用加倍培养基浸润的无菌滤纸上,26℃黑暗培养24h;
(D)幼胚培养:
将幼胚转移至生长培养瓶中,盾片向下,26℃暗培养1周,之后26℃光培养2-3周直至根发育完全;每瓶接种15个左右;
(E)移栽:
将小苗移栽至土壤基质中,温室内培养,根据叶鞘颜色鉴别单倍体植株,直至成熟,严格自交,收获种子;
(F)双单倍体的PCR检测:
采用CTAB小量法提取玉米幼苗叶片的总DNA;由于ZmARG基因为玉米内源基因,根据启动子Ubi序列和目的基因序列设计引物,引物ARG-F位于启动子Ubi序列内部,引物ARG-R位于目的基因序列内部,产物大小为775bp;筛选标记基因为抗除草剂草甘膦基因,产物大小为522bp;引物序列如下:
ARG-F:5’-CGCCCTTCTTTGGTGAT-3’
ARG-R:5’-CCCTGCCTTCATACGCT-3’
PCR反应程序为,94℃5min,94℃30s,60℃30s,72℃1min,72℃8min,32个循环;1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;
数据统计方法:
单倍体的诱导率=单倍体幼胚数/接种幼胚数*100%;加倍率=结实株数/再生苗数*100%;采用Excel 2010对试验数据进行初步整理,使用统计分析软件SPSS Statistics 17.0中独立样本T检验和方差分析程序进一步分析。
2.根据权利要求1所述的快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法,其特征在于:所述步骤(E)中的叶鞘颜色鉴别单倍体植株的叶鞘颜色为绿色叶鞘。
3.根据权利要求1所述的快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法,其特征在于:所述步骤(E)中自交时,如果散粉困难,需要用针挑破花药释放花粉。