专利名称：转基因玉米bt176及其衍生品种的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物品种的检测方法，具体涉及转基因玉米BT176及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
国际农业生物技术应用服务组织近期发表的《2010年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势》报告显示，由于转基因作物带来的巨大益处，过去15年内大约有I亿人次的农民做出种植决定。自转基因作物投入商业化种植15年来,全球转基因作物种植面积累计已经超过10亿公顷。2010年,全球29个国家的1540万农民种植了共I. 48亿公顷的转基因作物。自1996年至2010年，全球转基因作物的种植面积增加了 87倍。种植转基因作物排名前十位的国家种植面积首次均超过了 100万公顷。这些国家按照作物种植面积的大小排列分别是美国(6680万公顷)、巴西(2540万公顷)、阿根廷(2290万公顷)、印度(940万公顷)、加拿大(880万公顷)、中国(350万公顷)、巴拉圭(260万公顷)、巴基斯坦(240万公顷)、南非(220万公顷)和乌拉圭(110万公顷)。目前，世界各国已进行田间试验的转基因作物超过5000种，批准商品化的转基因作物有160多种，包括玉米、大豆、油菜、番茄、马铃薯、甜椒、木瓜、甜菜、烟草、水稻等。转基因玉米作为目前世界上最主要的转基因作物之一，占全世界转基因作物种植面积的30%以上，仅次于转基因大豆。BT176玉米是先正达公司开发的抗虫且耐草铵膦除草剂的转基因玉米品种，自1995年在美国首次准许无限制种植以来，Btl76玉米已经在许多国家和地区大面积种植并作为食品和饲料广泛应用。随后日本(1996)、加拿大(1996)、阿根廷及欧盟各成员国(1997)也先后准许无限制种植，Btl76玉米的种植面积不断扩大。同时，美国(1995)、加拿大(1995)、日本(1996)及英国、丹麦、荷兰、瑞士和阿根廷等国分别批准BT176玉米作为食物或饲料来源并可上市销售。从世界范围看，转基因玉米的推广已经带来了巨大的社会和经济效益。然而转基因玉米在带来巨大社会和经济效益的同时也存在许多问题，主要集中在转基因食品的安全性以及对生态环境的安全性方面，包括对人和动物健康的风险，对生态环境与农业的风险，对非目标生物的风险。针对第一种风险，1993年，联合国经济发展与合作组织(OECO)提出了食品安全性评估的“实质等同性”原则。如果准基因作物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。最早提出对转基因食品进行标识管理的是欧盟，1998年，欧盟在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1%的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到 0. 9%。日本，澳大利亚，新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，域值从I 5%不等。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年I月5日公布了农业转基因生物安全评价，标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。
为了能够对转基因作物及其产品做出综合评价，除了需要各国政府和国际机构制定科学的安全评价体系以及严格的管理法规外，建立有效的方法体系对转基因作物进行检测也很重要，这是对转基因作物进行安全性评价和实施监管的基础，也是农产品国际贸易健康发展的重要保障。转基因产品的检测要求方法要快速，准确，灵敏，并且还得考虑适应大样品量，目标基因种类多等特点。因此，目前转基因作物的检测主要是检测样品是否含有外源蛋白质(基因表达产物)和是否含有外源基因(DNA)。转基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫原理的酶联免疫吸附法(ELISA)试纸条检测、Western杂交等方法检测，主 要从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用与目的蛋白(抗原)特异性结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号，但是这种方法要求高质量高稳定性的抗体，否则因准确性不够，只能作为辅助检测手段。转基因作物的核酸检测方法主要有两种核酸分子杂交技术(Sourthernblot) ,PCR检测技术。其中PCR检测方法是最主要,最准确地检测转基因作物的方法，包括定性PCR方法，符合PCR方法，巢式PCR方法，竞争性定量PCR方法，荧光定量PCR方法等等。目前，国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。通过聚合酶的作用，在体外快速特异地扩增目的片段，使微量、特定目的DNA片段在几小时内迅速扩增到百万倍，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后很容易观察，因而具有快速灵敏等优点。然而，PCR方法反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；所需PCR仪价格在5万元左右，扩增时间2 3小时，扩增结果的电泳时间需要I小时左右；电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性，且难以实行现场检测。所以，在科学研究和生产实践中均需要一种快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的转基因作物检测方法。环介导等温基因扩增技术(Loop-MediatedIsothermal Amplification,以下简称LAMP法)是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将LAMP法应用于快速检测转基因玉米BT176及其衍生品种的试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种转基因玉米BT176及其衍生品种的LAMP检测引物组。本发明的另一个目的在于提供一种转基因玉米BT176及其衍生品种的LAMP检测试剂盒。本发明的另一个目的在于提供一种基于上述检测引物组和检测试剂盒的转基因玉米BT176及其衍生品种的恒温基因扩增检测方法(LAMP)。本发明所采用的技术方案如下
转基因玉米BT176及其衍生品种的LAMP检测引物组，包括外引物I和外引物2、内引物I和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示
外引物 I TGGACTTCAGCCTGCCG (SEQ ID No 1)；外引物 2 GTGGGAGGGAGAACTCCG (SEQ ID No :2)；
内引物 I :AGGCCATTGATGGCGTGCATTCCTGCCCGTCACCGA (SEQ ID No :3);
内引物 2 :AAGCCTTGGCCGACCGTTTCTCTGGGCGTGGTATCGACTT (SEQ ID No :4)。转基因玉米BT176及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，包括以下成分 (1)引物液含有上述的引物组，浓度分别为4 6iiM外引物1、4 6iiM外引物2，32 ~ 48 u M内引物1、32 ~ 48 u M内引物2 ；
(2)反应液含有IOmMdNTPUOXThermoPol反应缓冲液、150mM MgS04水溶液，三者的体积比是7 9 :4 6 :2 ;
(3)DNA聚合酶浓度为7 9U/iU ;
(4)对照阳性对照为转基因玉米BT176的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。优选的，所述引物液中含有5iiM外引物l、5iiM外引物2，40iiM内引物U40uM内引物2。优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/ill。优选的，所述反应液中，IOmM dNTP : 10XThermoPol反应缓冲液150mM MgS04的体积比为8 5 :2。本发明的转基因玉米BT176及其衍生品种的LAMP检测试剂盒中还可以含有显色齐U，所述显色剂为荧光染料SYBRGreen I。利用以上所述的LAMP检测试剂盒检测转基因玉米BT176及其衍生品种的方法，包括如下步骤
(1)待检样品DNA的提取采用CTAB法提取纯化样品DNA；
(2)恒温基因扩增反应在PCR管中配制反应体系引物液Iyl，反应液12.5iU，DNA聚合酶Iu 1，待检DNA 2 5 yl，用灭菌去离子水补齐到25iU ;设置阳性对照反应时，用转基因玉米BT176的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于63 65°C反应60 90min，并在80°C持续2min ；
(3)结果判断通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。
在试剂盒中含有显色剂的情况下，在(2)得到的产物中加入I 2iU显色剂，混匀，根据显色结果来判断扩增结果。其中，CTAB法提取转基因玉米BT176 DNA的方法为
(1)取转基因玉米BT176约IOOmg,放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎,液氮反复加入3 4次，磨碎成粉末为止；
(2)加入I.5ml预热至65°C的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样，65°C保育30min，期间不停颠倒混匀；
(3)约12000g离心lOmin。转移上清至一新离心管,加入I倍体积的苯酹氯仿异戍醇(25:24:1)，充分混合，约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；
(4)加入I倍体积的氯仿异戊醇(24:1)，充分混合，约12000g离心15min。转移上清
至一新离心管中；
(5)加入2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000g离心15min，弃上清；加入350 ill氯化钠溶液溶解沉淀；12000g离心lOmin，转移上清至一新离心管；
(6)加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min，12000g离心15min，弃上清，加入500 u 170%乙醇溶液，并颠倒离心管数次，12000g离心lOmin，弃上清；
(7)干燥DNA沉淀，加100UlTE缓冲液溶解DNA。本发明基于环介导等温扩增技术(LAMP法)，根据靶基因设计的四条引物能特异性识别靶基因序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物。采用4条特异 性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63 65°C对核酸进行扩增反应，反应需在恒温条件下进行，反应时间依据模板DNA质量变化,一般为90min或更少,在60 90min的短时间内扩增效率可以达到IO9 101°个拷贝数。加入模板DNA，在63 65°C反应60 90min后,在80°C保藏2min,终止反应。这项技术的优点是不需要热循环,且由于扩增是在恒温条件下进行，因此不需要PCR仪等昂贵仪器。在反应中，在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中Mg离子结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等有益效果
(1)快速高效整个扩增只用60 90min即可完成，扩增产量可达IO9 101°个拷贝；
(2)操作简便不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；
(3)高特异性本发明根据转基因玉米BT176的外源基因与内源基因结合处设计了四条特异性引物，应用上述四条引物，扩增靶序列的6个区域，具有很强的品系特异性，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
(4)高灵敏度最低检测极限可达到10个拷贝；
(5)鉴定简便可通过观察观察加入SYBRGreen I颜色变化或者是否存在焦磷酸镁沉淀来判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
图I是实施例I的检测结果图(1-4 :待检样品；5 :阳性对照；6 :阴性对照)；
图2是实施例2的检测结果图(1、2 :待检样品；3 :阴性对照，4 :阳性对照)；
图3是实施例3的检测结果图(1-6依次为5%、0. 5%、0. 1%、005%、0. 01%, 0. 005%的样品DNA，7 :阴性对照8 :阳性对照)；
图4是实施例4的检测结果图(1-20依次为转基因玉米BT176、BTlU Event98140、59122、M0N810、M0N88017、M0N89034、M0N863、GA21、MIR604，转基因大豆 M0N89788，转基因水稻BT63，转基因土豆EH92-527-1，转基因油菜T45，转基因棉花GHB614，非转基因玉米、水稻、小麦、油菜、棉花)。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。如无特殊说明，以下实施例中的“％”均指质量百分比。
实施例I含显色剂的试剂盒及检测方法
转基因玉米BT176及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，包括引物液、反应液、DNA聚合酶、对照和显色剂
(1)引物液:含有5iiM外引物l、5iiM外引物2，40ii M内引物l、40yM内引物2，四条引物为
外引物 I :TGGACTTCAGCCTGCCG (SEQ ID No. I)
外引物 2 GTGGGAGGGAGAACTCCG (SEQ ID No. 2)
内引物 I :AGGCCATTGATGGCGTGCATTCCTGCCCGTCACCGA (SEQ ID No. 3)
内引物 2 :AAGCCTTGGCCGACCGTTTCTCTGGGCGTGGTATCGACTT (SEQ ID No. 4)
(2)反应液含有IOmMdNTP、10XThermoPol反应缓冲液、150mM MgS04水溶液，三者的体积比是8:5:2;
(3)DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，浓度为8U/yl ;
(4)对照阳性对照为浓度为5%的转基因玉米BT176的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
(5)显色剂荧光染料IX SYBR Green I。用上述试剂盒按以下方法对待测玉米品种种子进行检测
(1)待检样品DNA的提取采用CTAB法提取纯化待测样品DNA；
(2)恒温基因扩增反应在200ulPCR管配制反应体系引物液I iil，反应液12. 5u I,DNA聚合酶I yl，待检DNA 2iU，用灭菌去离子水补齐到25iU ;设置阳性对照反应时，用浓度为5%的转基因玉米BT176的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，于65°C反应60min，并在80。。持续2min ；
(3)结果判断在上述反应管中加入2iU显色剂，混匀，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。本实施例中，阴性对照显现橙色，阳性对照显现绿色，待测样品1、2的PCR管显绿色(图I中管1，2)，表明待测玉米种子样品1、2中含有或全部为转基因玉米BT176及其衍生品种，含有转基因玉米BT176成分，待测样品3、4的PCR管显橙色(图I中管3，4 )，表明待测样品3、4中不含转基因玉米BT176成分。参照EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中的引物 Btl76 F:GGCCGTGAACGAGCTGTT (SEQ ID No. 5)，Btl76 R: GGGAAGAAGCCTACATGTTTTCTAA (SEQ ID吣.6)和探针财176 Probe: FAM-AGCAACCAGATCGGCCGACACC-TAMRA (SEQ ID No. 7)进行荧光定量PCR检验，检验结果与上述LAMP方法结果相一致。实施例2不含显色剂的试剂盒及其检测方法
试剂盒中除缺少实施例I中的显色剂外，其余同实施例I。用上述试剂盒按以下方法对待测玉米品种进行检测
(1)待检样品DNA的提取采用CTAB法提取纯化待测样品DNA；
(2)恒温基因扩增反应在200ulPCR管配制反应体系引物液I iil，反应液12. 5u I,DNA聚合酶I yl，待检DNA 2iU，用灭菌去离子水补齐到25iU ;设置阳性对照反应时，用浓度为5%的转基因玉米BT176的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，于65°C反应60min,并在80。。持续2min ； (3)结果判断将反应管放置在浊度仪中按(2)中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，如果出现沉淀则为阳性，无沉淀则为阴性。本实施例中，阴性对照无沉淀，阳性对照产生沉淀，待测样品I的PCR管出现沉淀(图2管1)，表明待检玉米种子样品I中含有或全部为转基因玉米BT176及其衍生品种，含有转基因玉米BT176成分。待测样品2的PCR管没有出现沉淀(图2管2)，表明待检样品2中不含转基因玉米BT176成分。参照EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中的引物 Btl76 F:GGCCGTGAACGAGCTGTT (SEQ ID No. 5)，Btl76 R: GGGAAGAAGCCTACATGTTTTCTAA (SEQ ID吣.6)和探针财176 Probe: FAM-AGCAACCAGATCGGCCGACACC-TAMRA (SEQ ID No. 7)进行荧光定量PCR检验，检验结果与上述LAMP方法结果相一致。实施例3 PCR反应与本发明检测方法灵敏度的比较
按下列配方制备转基因玉米BT176及其衍生品种的LAMP检测试剂盒
(1)引物液:含有5iiM外引物l、5iiM外引物2，40ii M内引物l、40yM内引物2，四条引物为
外引物 I TGGACTTCAGCCTGCCG (SEQ ID No :1)
外引物 2 GTGGGAGGGAGAACTCCG (SEQ ID No :2)
内引物 I :AGGCCATTGATGGCGTGCATTCCTGCCCGTCACCGA (SEQ ID No :3)
内引物 2 :AAGCCTTGGCCGACCGTTTCTCTGGGCGTGGTATCGACTT (SEQ ID No :4)
(2)反应液含有IOmMdNTP、10XThermoPol反应缓冲液、150mM MgS04水溶液，三者的体积比是8:5:2;
(3)DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，浓度为8U/yl ;
(4)对照阳性对照为浓度为5%的转基因玉米BT176的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
(5)显色剂荧光染料IX SYBR Green I。用上述试剂盒按以下方法对确定为转基因玉米BT176的待测样品进行检测
(1)待检样品DNA的提取采用CTAB法提取纯化待测样品DNA，分别稀释成5%、0.5%、0. 1%、0. 05%、0. 01%, 0. 005% 的样品 DNA ；
(2)恒温基因扩增反应在200ulPCR管配制反应体系引物液I iil，反应液12. 5u I,DNA聚合酶I yl，待检DNA 2iU，用灭菌去离子水补齐到25iU ;设置阳性对照反应时，用浓度为5%的转基因玉米BT176的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于65°C反应60min，并在80°C持续2min ；
(3)结果判断将反应管放置在浊度仪中按(2)中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，如果出现沉淀则有扩增，无沉淀则无扩增。也可以在(2)中得到产物中加入I U I显色剂，混匀，肉眼观察。无扩增反应的管子呈现黄色，有扩增反应的管子变成绿色。本实施例中，阳性对照、5%、0. 5%、0. 1%、0. 05%、0. 01%,0. 005%均出现沉淀显示为有扩增，阴性对照无沉淀，即无扩增；加入显色剂后，阳性对照、5%、0. 5%、0. 1%、0. 05%、0. 01%、0. 005%的PCR管显绿色，阴性对照管子呈现黄色(见图3)。PCR反应引物采用本方法反应中的外引物I和外引物2。PCR反应为25 体系，10XPCR Buffer (PCR 反应缓冲液，Promega 公司)2. 5 u I, IOmM dNTPs (Promega 公司)0. 5iU，上、下游引物分别对应外引物I和外引物2，各0. 5iU，Taq酶(5U/iU ,Promega公司)0. 5iil，DNA模板liil，用灭菌去离子水补至25iU。反应程序为95°C预变性5min，95°C变性30s，58 °C退火30s，72 °C延伸30s，72 °C延伸7min。PCR产物取10 与2%琼脂糖凝胶电泳，100V电压下40min，通过凝胶成像分析仪观察结果，对应条带分别为M，DL600 DNA Marker (DNA分子量标准，最大DNA片段为600碱基对)；I，阳性对照；2，5% ; 3,0. 5% ；4，0. 1% ； 5,0. 05% ； 6,0.01%； 7,0. 005% ； 8，阴性对照。其中 PCR 方法的灵敏度为0. 05%,而6，7显示为阴性结果。由两种方法比较可以看出，本发明的试剂盒的灵敏度的结果可以达到0.005%的浓度，而PCR方法的灵敏度为0. 05%，而0. 01%或以下显示为阴性结果；经比对，本发明的试剂盒及方法灵敏度明显高于PCR方法的敏感度，能检测出更低含量的样品。实施例4特异性实验
用实施例I的鉴定方法分别对分离纯化的转基因玉米BT176、BT11、Event98140、59122、M0N810、M0N88017、M0N89034、M0N863、GA21、MIR604，转基因大豆 M0N89788，转基因水稻BT63，转基因土豆EH92-527-1，转基因油菜T45，转基因棉花GHB614，非转基因玉米、水稻、小麦、油菜、棉花进行鉴定，同时参照EU Reference Laboratoryfor GM Food and Feed 中的引物 Btl76 F: GGCCGTGAACGAGCTGTT (SEQ ID No. 5)，Btl76 R: GGGAAGAAGCCTACATGTTTTCTAA (SEQ ID No. 6)和探针 Btl76 Probe:FAM-AGCAACCAGATCGGCCGACACC-TAMRA (SEQ ID No. 7)进行荧光定量 PCR 检验。鉴定结果显示转基因玉米BT11、Event98140、59122、M0N810、M0N88017、M0N89034、M0N863、GA21、MIR604,转基因大豆 M0N89788，转基因水稻 BT63，转基因土豆EH92-527-1，转基因油菜T45，转基因棉花GHB614，非转基因玉米、水稻、小麦、油菜、棉花反应管均为橙色，即无扩增；转基因玉米BT176的反应管为绿色，即有扩增(见图4)。本结果与 EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中的突光定量 PCR 反应结果相一致，显示出良好的特异性。
权利要求
1.转基因玉米BT176及其衍生品种的LAMP检测引物组，包括外引物I和外引物2、内引物I和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示外引物 I TGGACTTCAGCCTGCCG (SEQ ID No :1);外引物 2 GTGGGAGGGAGAACTCCG (SEQ ID No :2);内引物 I :AGGCCATTGATGGCGTGCATTCCTGCCCGTCACCGA (SEQ ID No :3);内引物 2 :AAGCCTTGGCCGACCGTTTCTCTGGGCGTGGTATCGACTT (SEQ ID No :4)。
2.转基因玉米BT176及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，包括以下成分 (1)引物液含有权利要求I所述的引物组，浓度分别为4 6μ M外引物I、4 6 μ M 外引物2,32 48μΜ内引物1、32 48μΜ内引物2 ； (2)反应液含有IOmMdNTP、10XThermoPol反应缓冲液、150mM MgS04水溶液，三者的体积比是7 9 :4 6 :2 ; (3)DNA聚合酶浓度为7 9υ/μ I ; (4)对照阳性对照为转基因玉米ΒΤ176的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
3.根据权利要求2所述的转基因玉米ΒΤ176及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述引物液中含有5μΜ外引物1、5μΜ外引物2，40μΜ内引物1、40μΜ内引物2。
4.根据权利要求2所述的转基因玉米ΒΤ176及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/ μ I。
5.根据权利要求2所述的转基因玉米ΒΤ176及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述反应液中，IOmM dNTP : 10 X ThermoPol反应缓冲液150mM MgS04的体积比为8 5 2o
6.利用权利要求2 5任一项所述的试剂盒检测转基因玉米ΒΤ176及其衍生品种的方法，包括如下步骤 (1)待检样品DNA的提取采用CTAB法提取纯化样品DNA； (2)恒温基因扩增反应在PCR管中配制反应体系引物液Iμ 1，反应液12. 5 μ 1，DNA聚合酶I μ 1，待检DNA 2 5μ 1，用灭菌去离子水补齐到25 μ I ;设置阳性对照反应时，用转基因玉米ΒΤ176的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于63 65°C反应60 90min，并在80°C持续2min ； (3)结果判断通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。
7.根据权利要求2 5任一项所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于还含有显色剂，所述显色剂为荧光染料SYBRGreen I。
8.利用权利要求7所述的试剂盒检测转基因玉米BT176及其衍生品种的方法，包括如下步骤 (1)待检样品DNA的提取采用CTAB法提取纯化样品DNA； (2)恒温基因扩增反应在200ulPCR管配制反应体系引物液I μ 1，反应液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待检DNA 2 5 μ 1，用灭菌去离子水补齐到25 μ I ;设置阳性对照反应时，用转基因玉米ΒΤ176的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于63 6 5°C反应60 90min，并在80°C持续2min ；(3)结果判断在上述反应管中加入I 2μ I显色剂，混匀，根据显色结果来判断扩增结果。
全文摘要
本发明公开了一种转基因玉米BT176及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法。检测引物组包括四条特异性引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照；试剂盒还可以有显色剂。其检测方法是通过提取待检玉米品种的DNA、采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109～1010个拷贝，其鉴定采用加入SYBRGreenI观察颜色变化或者利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化判断扩增与否，确定待检玉米品种是否含有或为转基因玉米BT176及其衍生品种。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
文档编号C12N15/11GK102634592SQ20121012880
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年1月16日
发明者刘静宇, 姚明河, 易敏英, 石磊, 肖艳文, 袁忠 申请人:广州迪澳生物科技有限公司