专利名称：制备光学活性的芳基-2-丙酸的方法
技术领域：
本发明涉及通过对相应的消旋酰胺进行对映选择的水解来制备通式为
的具有光学活性的芳基-2-丙酸的方法。
在通式(Ⅰ)中，Ar表示被取代的单环芳基或多环芳基，或表示被取代的杂环芳基。
具体来说，本发明涉及到制备芳基-2丙酸的对映体S，该母体具有消炎症性能，例如，具有治疗作用的芳基-2-丙酸中可以列举有酮苯丙酸(Kétoprofène)、甲氧基甲基萘乙酸(naproxène)、异丁苯丙酸(l′ibuprofène)、舒洛芬(suprofène)、非诺洛芬(fénoprofène)、苯恶洛芬(bénoxaprofène)、carprofène、cicloprofène、pirprofène、氟比洛芬(flurbiprofène)和氟洛芬(fluprofène)。
再具体地说，本发明涉及(苯酰-3-苯基)-2丙酸〔酮苯丙酸S(+)〕的对映体S(+)的制备。
现在已知用微生物通过对芳基-2-丙烷进行立体选择的氧化来制备芳基-2-丙酸的对映体S，其中微生物选自真菌和酵母(EP-A-205215)。或者用源出于非细胞或微生物(EP-A-227078)的脂肪酶通过对消旋酯进行立体有规性的水解来制备芳基-2-丙酸的对映体S。
同时还知道(FR-7901803/2447359)，用含有普通氰化酶和立体有规性的酰胺酶的剂通过对α-氨基腈进行生物水解或者用含有立体有规性的酰胺酶L的剂通过对α-氨基酰胺进行生物水解来制取具有光学作用的α-氨基酸。所用的这些剂均是具有立体有规性的酰胺酶L的细菌或源出于细菌的无细胞制剂。它们是由含有普通酰胺酶的菌株突变得到的。水解α-氨基腈或α-氨基酰胺就会生成L的α-氨基酸和D的α-氨基酰胺的混合物;D的α-氨基酰胺可以用D的α-氨基酸，借助于具有普通酰胺酶和无消旋酶的剂进行水解。
现在业已发现，而且成为本发明的目的是消旋的芳基-2-丙酰胺可以用S形的通式(Ⅰ)的芳基-2-丙酸，即根据可以用α-苯基丙酸，S对消旋α-苯基丙酰胺有选择性地进行水解的性能，借助于所选的微生物或酶进行水解。
在合适的介质内，将剂与消旋α-苯基丙酰胺进行接触，直至转变成20%的产品，然后再测量对映母体的多余部分，从而完成能对消旋芳基-2-丙酰胺进行水解的剂的选择。在这些情况下，选择所用的剂以便在对映体余量高于65%的条件下，使消旋α-苯基丙酰胺水解于α-苯基丙酸S中。
较合适的微生物可以列举有;属于短杆菌属或棒状杆菌属、特别是短杆细菌R312(CBS717，73)以及棒状杆细菌N771(FERMP4445)或棒状杆细菌N774(FERMP4446)属的菌株。使用这些细菌可以得到具有高于90%的异构对映体S(+)余量的芳基-2-丙酸。
应当注意的是，在这些微生物中，已在专利FR7901803/2447359和刊物“生物化学工程进展”，Vol，14，P，1-32(1980)中叙述过的短杆细菌R312，由于具有非立体有规性的普通酰胺酶，因而可以对消旋芳基-2-丙酰胺进行立体有规性的水解，而它的具有立体有规性的酰胺酶L的突变体A4并不对消旋-芳基-2-丙酰胺进行立体有规性的水解。
必须注意的是，在欧洲专利EP0187680中描述过的棒状杆细菌N771和棒状杆细菌N774，可以使乳腈水解于乳酸D.L中。而且还可以使α-氨基-苯基丙腈水解于D，L-苯基丙酸中，而不存在立体选择性。
本发明的方法是在水溶介质或者均匀或不均匀的氢化有机介质中来实施的，所选择的温度和PH条件视微生物以及酶的性能而定，同时搅动细胞或微生物的细胞提取物与消旋芳基-2-丙酰胺的悬浮物。
本方法生成了芳基-2-丙酸S和芳基-2-丙酰胺R的混合物，芳基-2-丙酰胺可以根据已有技术，消旋成消旋芳基-2-丙酰胺，而消旋芳基-2-丙酰胺可以在上述条件下重新用芳基-2-丙酸S进行水解。
例如，可以用氢氧化铵加热到80至160℃的温度条件下来对芳基-2-丙酰胺进行消旋。
当所用的微生物具有使腈进行水解的特性，同时也有使α-苯基丙酰胺进行对映选择性水解的特性时，就可以获得来自消旋芳基-2-丙腈或来自消旋芳基-2-丙酰胺的芳基-2-丙酸S。
本发明方法尤其适于制备来自消旋(苯酰-3-苯基)-2-丙酰胺以及来自消旋(苯酰-3-苯基)-2-丙腈的酮苯丙酸S(+)。
下面给出的非限定的实例，进一步说明如何实施本发明。
实例1
a).将短杆细菌株R312(CBS717，73)放在搅动的小玻璃瓶内的介质中在28℃下培养14小时，介质的组份如下-葡萄糖10g-(NH4)2SO45g-KH2PO41.01g-Na2HPO4·12H2O 1.64g-K2HPO40.82g-CaCl2·2H2O 0.012g-ZnCl20.0012g-FeSO4·7H2O 0.0012g-MnSO4·H2O 0.0012g-MgSO4·7H2O 0.5g-盐酸硫胺素0.002g-加入适量水直至 1000cm3将这些予先培养物用来接种具有相同组份但进一步含有浓度为20mM的N-甲基-乙酰胺的培养介质。在搅动的小玻璃瓶中于28℃下进行24小时的培养，然后通过离心作用将所得到的生物量进行分离，接着再用9克/升的氯化物溶液清洗两遍。
b).将含有13mg呈干燥状的短杆细菌R312的细胞离心沉淀物用2cm3的PH＝7的磷酸盐缓冲液(50mM)进行悬浮。然后再添加25mg消旋苯基-2-丙腈(190微摩尔)。在25℃下搅拌24小时以后，通过添加23cm3乙腈-盐酸N混合物(容量比90-10)使反应混合物得到稀释。再离心法除去细菌。由高性能的液体色谱法(CLHP)来测定残存物组份。
残存组分含有119微摩尔的苯基-2-丙酰胺62微摩尔的苯基-2-丙酸。
为促进水相或有机相的分离，再添加氯化钠。在对有机相进行干燥蒸发以后，再用20cm3的氯仿-钠碱0.1N的混合物(容量比1-1)将剩余物回收。
将碱性相进行酸化，然后用氯仿提取出来。
旋光率的测量表明异构对映体S(+)的余量为100%。
在将苯基-2-丙酸用R(+)α-甲基苄胺进行衍生以后，CLHP分析表明对映体的余量为96.4%。
实施2a).将棒状杆细菌株N771(FERMP4445)放在搅动的小玻璃瓶内的介质中，在28℃下培养14小时。介质的组份为-酵母提取物3g-麦芽提取物3g-细胞胨5g-葡萄糖10g-FeSO4·7H2O 0.1g-水加至1升通过添加具有灭菌作用的钠碱把介质的PH值调到7.5。
将这些予先培养物用来接种培养1/40相同组分的介质，其中按每升加入5cm3的比例，将酮苯丙酸腈的乙腈溶液(0.2g/cm3)加入到该介质中。
在搅动小玻璃瓶中，在28℃下培养24小时以后，用离心法将生物量进行分离，然后用9克/升的氯化钠水溶液将其清洗两遍。
b).将含有72mg呈干燥状的棒状杆细菌N771的细胞离心沉淀物用2cm3的PH＝7的磷酸盐缓冲液(50mM)进行悬浮。然后加入25mg消旋苯基-2-丙酰胺(167微摩尔)，接着再在25℃下搅拌24小时。再按照实例1的条件处理该反应混合物。
残存组分含有110微摩尔的苯基-2-丙酰胺34微摩尔的苯基-2-丙酸。
旋光率的测量表明，苯基-2-丙酸的异构对映体S(+)的余量以及用R(+)α-甲基苄胺衍生后的对映体的余量分别为100%和95%。
实例3将含有13mg、呈干燥状的短杆细菌R312细胞的离心沉淀物(在实例1a)的条件下获得的)放在2cm3PH＝7的磷酸盐缓冲剂(50mM)中进行悬浮。再加入25mg消旋苯基-2-丙酰胺(167微摩尔)。然后在25℃下搅拌24小时。再根据实例1的条件将反应混合物进行处理。
残存物包含95.2微摩尔的苯基-2-丙酰胺56.1微摩尔的苯基-2-丙酸。
用旋光率测量后可知，苯基-2-丙酸的异构对映体S(+)的余量和用R(+)α-甲基苄胺衍生以后的苯基-2-丙酸的对映体的余量分别为99%和95%。
实例4
将含有66mg呈干燥状的短杆细菌R312细胞的离心沉淀物(按实例1a)的条件所得的)放在2cm3PH＝7的磷酸钾缓冲液(50mM)内进行悬浮。然后加入25.9mg消旋(苯酰-3-苯基)-2-丙酰胺(102微摩尔)。在25℃下搅拌72小时。然后添加23cm3的乙腈-盐酸N(容量比90-10)的混合物使反应混合物得到稀释。再通过离心去除细菌。由高性能液体色谱法分析的残存物含有46微摩尔的酮苯丙酸59微摩尔的酮苯丙酸酰胺。
为促进水相和有机相的分离再添加氯化钠。在对有机相进行干燥蒸发后，用20cm3氯仿-钠碱0.1N(容量比1-1)的混合物将剩余物回收。
将碱性相酸化以后再用氯仿将其提取。用R(+)α-甲基苄胺使酮苯丙酸衍生以后。通过对两个非对映异构体的混合物的高性能液体色谱法分析，表明酮苯丙酸的对映体S(+)的余量为93%。
实例5将含有180mg、在实例2a)条件下获得的呈干燥状的棒状细菌N771细胞的沉淀物放在2cm3PH＝7的磷酸钾(50mM)缓冲剂中进行悬浮。再添加25.3mg消旋酮苯丙酸酰胺(100微摩尔)。在25℃下搅拌48小时，接着再添加23cm3乙腈-盐酸N(容量比90-10)的混合物。用离心法除去细菌。用高性能液体色谱法分析的残存物含有76.03微摩尔酮苯丙酸酰胺24.7微摩尔酮苯丙酸。
添加几mg的氯化钠，使水相和有机相分离。有机相经干燥蒸发后，用20cm3氯仿-钠碱0.1N(容量比1-1)的混合物将剩余物回收。在将水相酸化以后再用氯仿将其提取。用R(+)α-甲基苄胺将酮苯丙酸衍生以后，通过对两个非对映异构体的混合物的高性能液体色谱法分析，表明酮苯丙酸的对映体S(+)的余量为74%。
实例6将在实例1a)中得到的、含有24mg呈干燥状的短杆细菌R312细胞的离心沉淀物放在2cm3、PH＝7的磷酸钾缓冲剂(50mM)中进行悬浮。再添加23.5mg消旋(苯酰-3-苯基)-2-丙腈(酮苯丙酸腈)，即100微摩尔。在25℃下搅拌65小时以后，再加进23cm3乙腈-盐酸N(容量比90-10)的混合物。用离心法将细菌除去。用高性能液体色谱法分析的残存组分含有2.2微摩尔的酮苯丙酸腈53微摩尔的酮苯丙酸酰胺44.7微摩尔的酮苯丙酸。
添加几mg氯化钠，使水相和有机相分离。有机相进行干燥蒸发以后，再用20cm3氯仿-钠碱0.1N(容量比1-1)的混合物将剩余物回收。滗析后将有机相进行干燥蒸发。将含有酮苯丙酸酰胺的剩余物(13.5mg)在2cm3氯仿中进行稀释。通过对该溶液的旋光率测量，表明酮苯丙酸酰胺的对映体R(-)的余量为84%。
在水相、碱性相被酸化以后，用氯仿将其提取出来。在用R(+)α-甲基苄胺将酮苯丙酸衍生以后，通过对两种非对映异构体的混合物的高性能液体光谱分析，表明酮苯丙酸的对映体S(+)的余量为96%。
实例7按照用以制取棒状细菌N771细胞的沉淀物的实例2a)所述的条件制备棒状杆细菌N774(FERMP4446)的细胞沉淀物。
然后将含176mg，呈干燥状细胞的细胞沉淀物放在2cm3PH＝7的磷酸钾(50mM)缓冲剂中进行悬浮。再加入25.3mg消旋酮苯丙酸酰胺(100微摩尔)。尔后在25℃下搅拌48小时，再按实例1的条件将反应混合物进行处理。
对反应混合物的分析表明，该混合物含有78.6微摩尔的酮苯丙酸酰胺22.4微摩尔的酮苯丙酸。
衍生以后测定的异构酮苯丙酸对映体S(+)的余量为95%。
实例8将20mg具有光学活性的纯酮苯丙酸酰胺(79微摩尔)加入到5cm3的消毒蒸锅内。该蒸锅中含有1cm3、含量为28%(P/V)的氨水。在将蒸锅盖好以后，再将其放到150℃的炉子中维持2小时。在再次冷却后，将蒸锅内的所盛物倒到5cm3的水中。通过添加1N盐酸将pH值调到1。再用氯仿把水相提取出来。尔后用硫酸钠将氯仿相进行干燥。过滤后经浓缩使体积变成2cm3。
该氯仿溶液的旋光率为零。
CLHP分析表明，该溶液含有72.2微摩尔的酮苯丙酸酰胺和4.1微摩尔的酮苯丙酸。
权利要求
1.制备通式为
的芳基-2-丙酸对映体S的方法，其中Ar表示被取代的单环或多环芳基、或是被取代的杂环芳基，其特征在于在微生物或来自所选微生物的酶存在的条件下，根据其能使消旋α-苯基丙酸S对消旋α-苯基丙酰胺进行选择水解，并具有高于65%的对映体余量的性能对相应的可以就地制备的消旋芳基-2-丙酰胺，进行对映选择的水解，然后将芳基-2-丙酸S与芳基-2-丙酰胺R进行分离。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于微生物选自短杆细菌和棒状杆细菌。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于微生物选自短杆细菌R312(CBS717-73)、棒状杆细菌N771(FERM4445)和棒状杆细菌N774(FERM 4446)。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于微生物具有氰化酶作用，同时也具有用α-苯基丙酸S对消旋α-苯基丙酰胺进行有选择地对映水解的性能。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于直接用芳基-2-丙酸S对消旋芳基-2-丙腈进行水解。
6.根据权利要求4或5的方法，其特征在于微生物选自短杆细菌和棒状杆细菌。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于微生物选自短杆细菌R312(CBS 771，73)、棒状杆细菌N771(FERMP 4445)和棒状杆细菌N774(FERM P 4446)。
8.根据权利要求1至7中之一的方法用于制备(苯酰-3-苯基)-2-丙酸S(+)。
全文摘要
在微生物或所选用的酶存在的条件下，根据其可使α-苯基丙酸S对α-苯基丙酰胺进行有选择地水解的性能，可以通过相应的消旋芳基-2-丙酰胺有选择地进行对映选择水解来制备芳基-2-丙酸的方法。
文档编号C12P41/00GK1035847SQ8910154
公开日1989年9月27日 申请日期1989年1月25日 优先权日1988年1月27日
发明者塞雷拉尤·伊迪丝, 彼得·多米尼奇 申请人:罗纳·布朗克制药公司