利用蛋壳多肽的方法

专利名称：利用蛋壳多肽的方法
技术领域：
本申请要求2008年7月10日提交的美国临时专利申请No. 61/079，619的优先权， 其全文通过引用并入本文。
背景技术：
在一生中，旧骨不断地被吸收骨的破骨细胞清除，并被由成骨细胞生成的新骨所 取代。这一循环称为骨重建循环(bone-remodeling cycle)，其通常在很大程度上受到调 节，也就是说，破骨细胞和成骨细胞的作用相关联，使得在稳定状态下当骨被重吸收时有相 同量的骨被形成。骨重建循环发生于骨表面的特定区域。由骨中合适的前体细胞生成的破骨细胞重 吸收骨的一部分，随后通过成骨细胞的活性产生新骨。成骨细胞合成骨基质的胶原前体，并 且调节其矿化。认为成骨细胞在骨重建循环中满足骨骼生长和基质需要并调节其维持和机 械功能的动态活性受到多种因素(例如激素、生长因子、物理活性以及其他刺激)的影响。 认为成骨细胞具有甲状旁腺激素和雌激素的受体。破骨细胞和成骨细胞之间具有代谢协同 作用。破骨细胞粘附于发生重吸收的骨表面，并认为其被来源于成骨细胞的信号所活化。 但是，成骨细胞还可以被来源于破骨细胞的信号(例如，所释放的Ca)所活化。因此，为了 相互刺激并产生新骨，双方均是活化的十分重要。例如，当用双膦酸盐治疗骨质疏松症患者 时，患者的破骨细胞减少。当接收来自剩余破骨细胞的较少信号时，尚不确定成骨细胞的长 期活性如何。对于人体来说，利用活性成骨细胞和活性破骨细胞形成新骨是十分关键的。骨重建循环一个或者多个阶段的不平衡(例如，骨形成和骨重吸收之间的平衡丧 失)可以导致骨重建障碍或代谢型骨病，例如骨质疏松症和佩吉特病。这些疾病中的一些 是由于骨重建循环的一半(例如破骨细胞或成骨细胞)相对于另一半的过度活性引起的。 例如在骨质疏松症中，成骨细胞活性相对降低，其可引起骨密度和骨量的减少。骨质疏松症 是最常见的代谢型骨病，其可以是原发性疾病，或可以是另一种疾病或其他疾病的继发性 疾病。骨质疏松症通常以骨密度减少为特征。骨变薄变弱使得轻微外伤导致骨折的机率增 加。蛋壳是一种包含约95-98 %碳酸钙、1-2%微量矿物质(包括Mg等)和约 1-2%有机化合物(例如蛋白质和胶原)的生物材料。之前，市售禽蛋壳制剂(又称为 Putamen Ovi (PO)或者Biomin)已经用作治疗骨质疏松症的口服药物(Ru印ρ的美国专利 Nos. 6，344，217和7，011，853 ；美国专利No. 5，045，323)。这些制剂需要经过加热过程(高 压灭菌、干热灭菌)。而在用热处理蛋壳的过程中，这些制剂的有机化合物减少或甚至完全 被破坏。但是，已经表明经高压灭菌的蛋壳粉对骨细胞有刺激作用，但是在天然蛋壳中哪种 物质作为活性成分并发挥刺激作用仍未知。需要鉴定对骨细胞有刺激作用的蛋壳组分，以 及这些组分在治疗骨病、骨损伤和响应于刺激成骨细胞活性之其他病症中的用途。

发明内容
在一个实施方案中，刺激成骨细胞活性的方法包括使成骨细胞与包含来自蛋壳之 多肽提取物的组合物相接触，其中所述多肽提取物分离自硬蛋壳组织、软蛋壳组织或其组合。在另一个实施方案中，在有此需要的个体中刺激成骨和/或骨诱导活性的方法包 括对所述个体施用包含来自蛋壳之多肽提取物的组合物，其中所述多肽提取物分离自硬蛋 壳组织、软蛋壳组织或其组合。在另一个实施方案中，在有此需要的个体中刺激血细胞生成的方法包括对所述个 体施用包含来自蛋壳之多肽提取物的组合物，其中所述多肽提取物分离自硬蛋壳组织、软 蛋壳组织或其组合。在另一个实施方案中，在有此需要的个体中刺激软骨形成和/或分化的方法包括 对所述个体施用包含来自蛋壳之多肽提取物的组合物，其中所述多肽提取物分离自硬蛋壳 组织、软蛋壳组织或其组合。在另一个实施方案中，在有此需要的个体中刺激成纤维细胞的方法包括对所述个 体施用包含来自蛋壳之多肽提取物的组合物，其中所述多肽提取物分离自硬蛋壳组织、软 蛋壳组织或其组合。本文还包括用1至25wt%的SDS和任选地1至60%体积/体积的乙酸处理硬蛋 壳组织之方法的产物。本文还包括用包含2至IOM尿素且pH值为7. 0-9. 0的溶液处理软蛋壳组织之方 法的产物。


先参考以下附图，其中图1是硬蛋壳和软蛋壳多肽的示例性纯化及其用途的图。图2显示成骨细胞的增殖。柱1-对照(无添加物)；柱2-P0-I (于137°C高压灭 菌)；柱3-P0-II (标准高压灭菌)；柱4-HA-硬蛋壳多肽0.5g/l[HA=透明质酸]；柱5-硬 蛋壳-多肽(低浓度0. 005g/l)；柱6-硬蛋壳-多肽(高浓度0. 5g/l)。图3显示成骨细胞的增殖。柱1-对照(无添加物)；柱2-P0-I (于137°C高压灭 菌)；柱3-P0-II (标准高压灭菌)；柱4-HA-硬蛋壳多肽0.5g/l[HA=透明质酸]；柱5-硬 蛋壳-多肽(低浓度0.005g/l)；柱6-硬蛋壳-多肽(高浓度0.5g/l)；柱7-P0-0 (于113°C 高压灭菌)。图4显示对于3种不同的蛋白样品A、B、C、B+C而言，利用库尔特计数器系统测定 的培养5天后细胞的数量。图5显示在匪If培养基(作为对照)和添加有蛋白样品A、B、C、B+C的培养基中 培养5天后成骨细胞的中位细胞大小。图6显示在添加有蛋白样品A、B、C、B+C的培养基中和MMlf (作为对照)中培养5 天后中位细胞大小的柱状图。图7显示细胞增殖的柱状图。在添加有蛋白样品A、B、C、B+C的培养基中和 MMlf (作为对照)中培养的原代牛成骨细胞样细胞的细胞/图像。图8显示在所用的培养基MMlf (作为对照)、添加有蛋白样品A的培养基和添加有蛋白样品B的培养基中培养4周后的钙浓度(g/L)。通过下文的详细描述、附图和所附权利要求，本领域技术人员将知晓和理解上述 及其他特征。发明详述本文中鉴定了鸡蛋壳的活性组分，其在体外研究中显示对造骨细胞(bone building cell)(成骨细胞)具有刺激作用。该物质是从蛋壳中提取的一种或多种多肽。 本文已发现，包含蛋壳多肽的组合物刺激成骨细胞，并因此具有骨诱导和/或成骨特性、血 细胞生成特性以及软骨形成和/或分化特性。本文中所用的来自蛋壳的多肽提取物是来自 蛋壳硬壳组织、软壳组织或二者兼有的提取物，其包含大于95wt%、特别是大于99. 5wt% 的蛋壳多肽。在一个实施方案中，所述多肽提取物是脱矿化提取物。提取后，所述多肽制 备物含有矿物质(矿物质盐)，例如乙酸钙。提取后，可以利用超滤法使提取物脱矿化(脱 盐)，从而对溶液进行完全纯化。脱矿化后，可将提取物经冷冻干燥， 然后成为纯物质。在一个实施方案中，所述蛋壳是鸡蛋壳，即来自原鸡(Gallus gallus)的蛋壳。 在另一些实施方案中，所述蛋壳来自鹅(Anser anser)、鸭(Anas platyrhynchos)或鸵鸟 (Struthio camelus)。在另一个实施方案中，所述蛋壳是新鲜蛋壳。在本文中，新鲜蛋壳定义为来自未经 热(例如煮、蒸汽加热或高压灭菌)处理/加工之蛋的壳。该特征使本发明的蛋壳制备品 与利用加热/蒸汽来加工蛋壳的现有技术区别开来。不受理论限制，相信市售蛋壳制备品 (例如puamen ovi, Biomin)具有比新鲜蛋壳提取物低得多的多肽浓度。在另一些实施方 案中，所述蛋壳是经煮、蒸汽/加热的。新鲜蛋壳可以来自未受精或已受精的蛋。已出乎意料地发现包含蛋壳多肽的组合物具有骨诱导/成骨特性，即刺激骨形 成。在一个实施方案中，将所述包含蛋壳多肽的组合物施用于需要治疗骨病(例如骨质疏 松症、骨质减少症、成骨不全症、佩吉特病、骨折等)的个体。还出乎意料地发现包含蛋壳多肽的组合物具有血细胞生成特性，即刺激血细胞生 成。在一个实施方案中，将所述包含蛋壳多肽的组合物施用于需要治疗贫血以及相关的骨 髓和血液病症的个体。还出乎意料地发现包含蛋壳多肽的组合物具有软骨形成和/或分化特性。在一个 实施方案中，将所述包含蛋壳多肽的组合物施用于需要修复软骨的个体。在一个实施方案中，所述包含蛋壳多肽的组合物以粉末、糊剂、注射溶液、或者用 于骨内注射或局部施用(例如用作骨移植物或者骨刺激剂用于椎体后凸成形术、脊椎成形 术、骨折部位或者骨或关节缺陷中)之溶液或糊剂的形式存在。前述组合物可以用于在骨 或软骨损伤或缺陷部位对骨和/或软骨进行修复。所述蛋壳多肽任选地与胶原海绵、透明 质酸凝胶、碳酸钙、β -磷酸三钙(TCP)、磷酸钙(羟磷灰石)、骨引导可降解材料例如多聚物 (聚乳酸、聚乙醇酸))、生长因子、或者包含一种或多种上述试剂的组合一起施用。示例性 的生长因子包括骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、 胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)，以及包含一种或多种上述生长因 子的组合。在另一个实施方案中，包含蛋壳多肽的组合物以口服、鼻内或可注射组合物的形式全身施用。用于口服施用的组合物包括例如片剂、胶囊和软胶囊。全身性施用适用于治疗 骨质疏松症、骨质减少症和诸如以下的骨病佩吉特病、成骨不全症、骨软化症、骨石化症、 奥斯古德-施莱特病、骨痛退化症(Algodystrophy)、反射性交感神经营养不良综合征(复 杂性区域疼痛综合征)、暂时性骨质疏松、无血管性坏死、骨坏死、骨软骨病变、溶骨性病变、 骨肿瘤和骨折。所述蛋壳多肽任选地与钙、镁、磷、氟、双膦酸盐、雌激素、维生素(例如维生 素A、D、E、K、C、B)、甲状旁腺激素(PTH)、微量矿物质(例如锌、锰)、大豆类黄酮化合物或 者包含一种或多种前述药剂之组合一起施用。在一个实施方案中，当用作造血物质时，全身性施用适用于治疗贫血和其他血液 病症。所述蛋壳多肽任选地与细胞因子、糖蛋白生长因子、集落刺激因子(CSF)(例如粒细 胞-巨噬细胞CSF (GM-CSF)、粒细胞CSF (G-CSF)和巨噬细胞CSF (M-CSF))、红细胞生成素以 及包含一种或多种上述药剂之组合一起施用。在一个实施方案中，利用包含蛋壳多肽的组合物(例如以表面组合物(topical composition)的形式)刺激成纤维细胞。成纤维细胞位于真皮层，其产生细胞外基质组分 (例如胶原)和多种细胞因子，所述细胞因子反过来增强角化细胞的增殖和迁移。角化细胞 位于表皮层，形成抵御外界环境的屏障。所述包含蛋壳多肽的组合物可以用于表面，例如用 于治疗皮肤屏障和角化症以及减少皮肤衰老和/或皱纹的组合物。可将蛋壳多肽包埋进磷 脂酰胆碱脂质体或者纳米颗粒中。刺激成骨细胞形成的蛋壳组分是蛋壳的多肽级分，即来自蛋壳的多肽提取物。本 文中所用的术语多肽意指以肽键相连接的多个氨基酸，其包括蛋白质、蛋白质片段和肽。蛋 壳多肽是从蛋壳中提取的多肽或其片段。优选地，所述片段能够刺激成骨细胞的活性。根据 所用的提取蛋壳多肽的技术，至少一部分多肽与其天然状态的多肽相比分子量可降低。不 受理论的限制，相信提取硬蛋壳多肽所需的相对严格的步骤导致所分离多肽的平均分子量 降低，即至少一部分多肽在提取过程中发生降解。术语硬蛋壳组织包括蛋壳的钙化层，即含有栅状层和乳头层的硬蛋壳。术语软蛋 壳组织包括蛋壳内膜和外膜，也称为蛋壳内侧(蛋内)的膜层。在一个实施方案中，当加工(清洗、灭菌)蛋壳时，其应当尽可能保持天然状态，即 保留有机化合物(蛋白、胶原)，并且当用加热处理(例如高压灭菌)时不使其变性。可以 通过将蛋壳放入经氧-臭氧饱和的水中5-25分钟来对蛋壳进行清洗和消毒。出乎意料地 是，经氧化/臭氧化的水并不使蛋壳的有机化合物变性。用经臭氧化水清洗后，可以利用真 空干燥器使湿蛋壳温和地干燥。在一个实施方案中，通过使硬蛋壳组织与包含1至25wt% SDS的水性还原缓冲液 相接触来提取硬蛋壳多肽。在另一个实施方案中，所述还原缓冲液还包含1至60%体积/ 体积的乙酸。在另一个实施方案中，利用1至60%体积/体积的乙酸溶液提取硬蛋壳多肽。 在一个实施方案中，所述乙酸溶液还包含1至25wt%的EDTA。在一个实施方案中，所述硬蛋壳提取物包含Ovocleidin、Ovocalyxin和/或丛生 蛋白(Clusterin)。在另一个实施方案中，所述硬蛋壳提取物包含Ovocleidin-116、丛生蛋 白_(硫酸化糖蛋白2)、0VOCleidin-17、0VOCalyXin-32活性片段，或者包含一种或多种上 述物质的活性级分。所述活性级分是能够刺激成骨细胞活性的级分。在一个实施方案中，通过使软蛋壳组织与包含2至10M尿素且pH值为7.0-9.0的溶液相接触来提取软蛋壳多肽。在一个实施方案中，所述缓冲液包含25mM Tris/HCl(pH 8. 9)、2M 尿素。在一个实施方案中，所述软蛋壳多肽提取物包含卵白蛋白、卵转铁蛋白前体、 78kDa多肽(卵转铁蛋白家族)、105kDa多肽(卵转铁蛋白家族)、卵白蛋白相关多肽Y、 52kDa多肽(卵抑制剂，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白)、卵类粘蛋白前体、与卵白蛋白相关蛋白Y 类似的SERPINB11、卵糖蛋白前体、溶菌酶C前体、28kDa多肽、卵粘蛋白α亚基、!fep21蛋白 前体、0vocleidin-17、164kDa多肽、丛生蛋白49多肽、卵固蛋白(Ovostatin)前体、18kDa 多肽、8kDa多肽、35kDa多肽、34kDa多肽、α -1 (XI型)胶原同工型、ΝΤ-3生长因子受体的 α -KT同工型、半胱氨酸蛋白酶抑制剂前体、其活性片段，或者包含一种或多种上述物质的 活性级分。所述活性级分是能够刺激成骨细胞活性的级分。在一个实施方案中，所述硬蛋壳多肽提取物、软蛋壳多肽提取物或者二者是硬或 软蛋壳多肽总提取物。所述总提取物意指包含可从组织中分离之全部多肽重量的大于 90wt%、特别地大于95wt%、更特别地大于98wt%的提取物。总多肽提取物可包含降解形 式的多肽级分，只要所述总提取物包含上述量的多肽。在一个实施方案中，施用包含经纯化重组蛋壳多肽的组合物(而不是蛋壳多肽提 取物)。在一个实施方案中，所述组合物包含经纯化重组Ovocleidin和/或经纯化重组丛 生蛋白。可将适于表达蛋壳多肽的多核苷酸可以插入到一个或多个重组表达载体中。术语 “重组表达载体”指质粒、病毒或者本领域已知的通过插入或掺入基因序列而进行操作的其 他工具。本文中术语“质粒”通常按照本领域技术人员熟悉的标准命名规则以小写字母P在 前命名，和/或后面是大写字母和/或数字。质粒是市售的、可不受限制地公开获得的，或 者可通过众所周知的已公开方法通过常规应用由可获得的质粒来构建。有多种质粒以及其 他克隆和表达载体是众所周知并且易于获得的，或者本领域普通技术人员可以容易地构建 适用的、任意数量的其他质粒。可将这些载体转化到合适的宿主细胞中，以形成用于生产多 肽的宿主细胞载体系统。在一个实施方案中，利用在利什曼原虫(Leishmania tarentolae)中表达的真核 蛋白表达系统表达重组蛋白。单细胞动基体原生动物利什曼原虫分离自摩尔壁虎(Moorish gecko)毛里塔尼亚 壁虎(Tarentola mauritanica)，其对哺乳动物是非致病性的(生物安全等级1)，是市售真 核蛋白表达系统LEXSY(Jena Bioscience)的蛋白产生宿主。可将适于表达蛋壳多肽的多核苷酸插入到适于在细菌、酵母、昆虫、两栖动物、或 哺乳动物、或者其他原核或真核细胞中表达的载体中，所述载体还包含在细菌、酵母、昆虫、 两栖动物或哺乳动物中表达核酸所必需的调控元件，所述调控元件与编码多肽的核酸分子 有效连接。“有效连接”指相邻位置，其中所述组件处于允许其以其预期方式发挥作用的关 系中。与编码序列有效连接之表达控制序列的连接使得可实现编码序列在与表达控制序列 相容条件下的表达。本文中所用术语“表达控制序列”指调节与其有效连接之核酸序列的 表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调节核酸序列的转录以及其翻译(需要时)时， 所述表达控制序列与核酸序列有效连接。因此，表达控制序列可以包括合适的启动子、增强 子、转录终止子、蛋白编码基因前面的起始密码子(即atg)、内含子剪接信号(如果存在内含子)、保持允许mRNA正确翻译的基因的正确读码框、以及终止密码子。术语“控制序列” 旨在至少包括其存在可以影响表达的元件，并且还可以包括其存在是有利的附加元件，例 如前导序列和融合伴侣序列。表达控制序列可以包括启动子。“启动子”意指足以指导转 录的最小序列。还可以包括足以向启动子依赖性可控制基因表达赋予细胞类型特异性、组 织特异性，或者可被外部信号或试剂诱导的启动子元件，所述元件可位于基因的5’或3’区 域。组成型和诱导型启动子均包括在内。可以通过本领域技术人员熟知的常规技术，利用表达载体或其他DNA进行宿主细 胞的转化。“转化”意指在掺入新DNA(即细胞外源性DNA)后在细胞中诱导的永久性或瞬时 性基因变化。当细胞是哺乳细胞时，永久性基因变化通常通过将DNA引入细胞基因组中来 实现。“经转化的细胞”或“宿主细胞”是指已通过重组DNA技术将编码本发明之蛋壳多肽 或其片段的DNA分子引入其中(或引入其祖先中)的细胞(例如原核或真核细胞)。蛋壳多肽还可以设计为提供附加序列，例如添加有助于通过柱上捕获或利用抗体 而进行纯化之附加C末端或者N末端氨基酸的编码序列。这样的标签包括例如能够进行镍 柱上多肽之纯化的组氨酸富集标签。这些基因修饰技术和合适的附加序列是分子生物学领 域内所熟知的。蛋壳蛋白、多肽、或多肽衍生物可通过本领域中已知的方法进行纯化。这些方法包 括但不限于体积排阻色谱、硫酸铵分级、离子交换色谱、亲和色谱、结晶、电聚焦、制备型凝 胶电泳、以及包含一种或多种上述方法之组合。经分离和纯化的蛋壳的制备物的纯度为约 50 %至约99. 9 %，优选大于或等于约80 %，更优选大于或等于约85 %，更优选大于或等于 约90%，特别优选大于或等于约95%。可以通过本领域已知的方法(例如SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳)评估纯度。包含蛋壳多肽的组合物包括例如固体、半固体和液体剂型，例如片剂、丸剂、粉末、 液体溶液或混悬液、栓剂以及注射溶液和输注溶液。剂型取决于所预期的施用和治疗应用 形式，并可由本领域技术人员选择。施用方式包括口服、胃肠外、皮下、静脉内、病灶内或表 面施用。在一个实施方案中，将组合物施用于需要进行骨或软骨再生或修复的治疗部位附 近。在一个实施方案中，包含蛋壳多肽的组合物还包含赋形剂。可加入赋形剂以利于 生产、增强稳定性、控制释放、增强产品特性、增加生物利用度、增强患者接受性等。药用赋 形剂包括粘合剂、崩解齐 、润滑齐 、助流齐 、压缩助齐 、色素、甜味齐 、防腐剂、助悬齐 、分散 剂、成膜剂、调味剂、印刷油墨等。粘合剂使成分共同保持在剂型中。示例性粘合剂包括聚 乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素和羟乙基纤维素，以及包含 一种或多种上述粘合剂的组合。当潮湿时，崩解剂膨胀，使得药片崩开。示例性崩解剂包括 吸水膨胀物质，例如低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羟 基乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠；离子交换树脂；微晶纤维素；淀粉和预胶 化淀粉、福尔马林-酪蛋白；以及包含一种或多种上述吸水膨胀物质的组合。润滑剂例如辅 助粉末材料的加工过程。示例性润滑剂包括硬脂酸钙、山嵛酸甘油酯、硬脂酸钙、矿物油、聚 乙二醇、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸、滑石、植物油、硬脂酸锌，以及包含上述一种或多种润滑 剂的组合。助流剂包括例如二氧化硅。在表面应用的实施方案中，载体以适于局部应用于皮肤的形式存在，包括例如溶液、胶体分散液、乳液(水包油或油包水)、混悬液、乳膏、乳液、凝胶、泡沫、摩斯(mousse)、 喷雾剂、香波(shampoo)等。适于表面应用的组合物还包括例如混悬于合适基质或载体中 的纳米颗粒或脂质体载体。其中至少最小程度上溶解有蛋壳多肽的可药用液态载体适于表 面应用。其他可以是合适的制备方法包括将组合物应用于聚乙烯醇海绵上。治疗的剂量和持续时间取决于多种因素，包括疾病类型、患者年龄、患者体重等。 基于能够达到在体外模型、体内模型和临床试验中显示有效的浓度来选择初始剂量水平， 最高至最大耐受水平。可由专业临床医生根据上述因素，利用标准药理学方法来确定针对 特定患者的特定组合物的剂量和治疗持续时间。通过分析血液或体液水平或者在相关组织 中的水平或者监视患者体内的疾病状态来对治疗效果进行监控。专业临床医生将基于这些 检测所反映的对治疗之响应来调整治疗的剂量和持续时间。在一个实施方案中，对于口服 施用来说，施用5至IOOOmg蛋壳多肽，特别是50至150mg蛋壳多肽。本发明将通过以下非限定性实施例来进一步举例说明。实施例1 蛋壳制备购买市售新鲜鸡蛋，打开，倒出除去鸡蛋内容物。随后将蛋壳分成两种不同的组 织，包含钙化层的硬组织(具有栅状层和乳头层的硬蛋壳)以及包含蛋壳内膜和蛋壳外膜 (膜层)的软组织。使用几种不同的多肽提取方法，对于蛋壳的硬组织使用4种方法，对于软组织使 用1种方法。实施例2 硬蛋壳组织多肽提取方法1将硬蛋壳组织用水清洗，在研钵中捣碎，得到白色粉末。将粉末干燥过夜。随后， 将1. 77g粉末溶于700 μ 1含有蛋白酶抑制剂的还原性SDS缓冲液(15%甘油、25mM TRIS/ HCl (pH 7. 5),2% SDSU % DTT)中，并搅拌1.5小时。接着加入700 μ 1还原性SDS缓冲液， 并再搅拌1小时。随后，将混合物加热到95°C 5分钟，并进行超声浴处理10分钟。重复该 方法3次。随后，将样品孵育过夜。第二天，将混合物于13，OOOXg离心5分钟。小心地移 去上清液，并利用3kDa超滤作用浓缩至130 μ 1。为了沉淀多肽，用1. 2ml冰冻丙酮稀释样 品，并于4°C孵育过夜。随后将沉淀溶于50μ 1 3倍还原性SDS缓冲液中，并进行SDS-PAGE。实施例3 硬蛋壳组织多肽提取方法2 将硬蛋壳组织用水清洗，在研钵中捣碎，得到白色粉末。将粉末干燥过夜。随后，将 1. Og该粉末溶于300 μ 1 3倍还原性SDS缓冲液和300ml 10%乙酸中，搅拌过夜。第二天， 将混合物于13，OOOXg离心5分钟，随后加入400 μ 13倍SDS还原性缓冲液，并搅拌30分 钟。随后，将混合物加热到95°C 5分钟，进行超声浴处理10分钟，以13，OOOXg离心5分钟。 小心地移去上清液，并利用3kDa超滤作用浓缩至20 μ 1。再进行一次离心步骤(13，OOOXg, 5分钟)后，将上清液用于SDS-PAGE。实施例4 硬蛋壳组织多肽提取方法3将0. 8mg硬蛋壳组织粉末溶于700 μ 1 5% EDTA中，并在温和振荡下于4°C孵育30 分钟。随后加入1300μ1 10%乙酸。将混合物孵育过夜。第二天，将混合物于14，000 Xg 离心5分钟。小心地移去上清液，并用250ml 5%乙酸钠缓冲液(pH 8.5)透析4X30分钟。 随后将溶液冷冻干燥，得到白色粉末。实施例5:硬蛋壳组织
将硬蛋壳组织用水清洗，在研钵中捣碎，得到白色粉末。将粉末干燥过夜。随后， 将IOOg粉末溶于35ml 50%乙酸中，并搅拌过夜。第二天，加入50ml 50%乙酸，并再搅拌 4小时。随后加入IOml水，孵育过夜。第二天加入IOml水，将混合物于14，OOOXg离心5 分钟。小心地移去上清液，并进行冷冻干燥，得到白色粉末。实施例6 软蛋壳组织多肽提取方法由2个新鲜鸡蛋制备蛋壳膜(软组织)并从钙化层中完全移除。用PBS彻底清洗 蛋壳膜。随后将其冷冻于_80°C。在下面的方案中，将两个样品分开，但进行相同的处理。 将其在研钵中捣碎，但是由于其具有类似纸的稠度，改用剪子将其剪成小片。随后将其溶于 1.5ml缓冲液(25mM Tris/HCl(pH 8.9)，2M尿素)中。加入玻璃珠，用超声仪处理膜(10X5 秒)。随后混合物于室温搅拌1小时。重复该处理3次。随后以13，000 Xg将其离心5分 钟。小心地移去上清液，用于进行Bradford测定和SDS-PAGE。将上清液进行冷冻干燥，得 到纯的蛋白质粉末。实施例7 利用SDS-PAGE分析硬蛋壳多肽和软蛋壳多肽利用下面的技术分析和鉴定硬蛋壳组织和软蛋壳组织冻干物的多肽。SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)利用SDS-PAGE分离蛋壳多 肽。将样品在还原性样品缓冲液中稀释和加热，并点样于4-20%的SDS-PAGE凝胶(BioRad) 上。随后使凝胶在约150Vh下运行。随后用高度敏感的荧光染料Sypro Ruby对一些凝胶 进行染色，用荧光扫描仪(Fuji FLA 3000)扫描，并用考马斯亮蓝复染。其余凝胶用银进行 染色。依照前述的不同方法制备硬蛋壳组织，点样于SDS-PAGE(4-20%，BioRad)，并用 银进行染色。只有一块凝胶显示出直接冻干的多肽。在将样品点样于SDS-PAGE前，通过 Bradford测定法测定多肽浓度，得出多肽的量在3_6mg/ml之间。对于硬蛋壳多肽制备品而言，利用4种不同的制备品，在SDS-PAGE凝胶上均未见 清晰的多肽条带，尽管Bradford测定显示较高的多肽浓度。不受理论的限制，相信样品中 存在的多肽过少，以致于不能在SDS-PAGE上检测到。与硬蛋壳多肽相反，软蛋壳组织(蛋壳膜)多肽样品显示出所提取多肽的良好分布。实施例8 利用纳级-LC-ESI-MSMS分析硬蛋壳多肽和软蛋壳多肽纳级-LC-ESI-MSMS在多维液相色谱系统(Ettan MDLC, GEHealthcare)中进行 一维纳级液相色谱(lD-nano-LC)分离。将多肽点样于RPC捕获柱上(点样缓冲液0. 甲酸；捕获柱C18P印Map 100，珠大小5 μ m，内径300 μ m，长5mm，LC包装)，流速为每分钟 6μ1，并随后以120分钟的线性梯度(Α:0.1%甲酸；B:84%ACN和0.1%甲酸)U 260nl/ min的流速通过分析柱(C18P印Map 100，珠大小3 μ m，内径75 μ m，长15cm, LC Packings) 进行分离。所述梯度如下:0-30% B 80分钟，30-60% B 30分钟，60-100% B 10分钟。在与纳级-LC系统在线相连的线性离子阱质谱仪(Thermo LTQ, Thermo Electron) 上进行质谱。对于电喷雾电离而言，使用末端涂布的Silica Tip(FS-360-50-15-D-20)和 1. 4kV的针电压。MS方法包括一次全MS扫描(质量范围300-2000m/z)和3次数据依赖 性MS/MS事件(35%碰撞能量)组合的循环。动态排除设定为30s。用碘乙酰胺将10 μ 1蛋壳软组织多肽提取物还原、烷基化，并用胰蛋白酶于37°C消化过夜。将10 μ 1样品用于进行纳级-LC-ESIMSMS。随后利用MASCOT软件在IPI鸡数据 库和Decoy-IPI鸡数据库中搜索MSMS谱。这对于观察哪个命中结果(hit)是显著性的以 及何时达到显著性临界值(第一次随机命中结果出现的时刻)具有优势。该步骤比依赖于 数据库大小、修正数量和其他因素的单一 Mascot分数要精确得多。蛋壳软组织(蛋壳膜)多肽的LC-ESI-MSMS的MASCOT搜索结果1.卵白蛋白 SEQ ID NO 1 (gi | 45383974 | ref | NP_990592. 1)2.卵转铁蛋白 SEQ ID NO 2 (gi | 7578511 emb | CAA26040. 11)3. 78KDa蛋白质组蛋白-精氨酸N-甲基转移酶PRMT7 SEQ ID NO 27(gi|82233719|sp|Q5ZIB9. 1)4. 78KDa蛋白质蛋白质-谷氨酰胺Y _谷氨酰转移酶SEQ ID NO 28(gi|62903517|sp|Q01841. 3)5.78KDa 蛋白质 L印recan 样 1 SEQ ID NO 29 (gi | 48374055 | ref | NP_001001530. 1)6. 105KDa 蛋白 质伴肌动蛋白(nebul in) SEQ ID NO: 20 (gi111559266|dbjIBAB18735. 1)7.卵白蛋白相关蛋白 Y SEQ ID NO 4 (gi 1118086485 | ref | XP_418984. 2)8. 52KDa 蛋白质卵抑制剂(ovoinhibitor)SEQ ID NO 19 (gi | 71895337 | ref | ΝΡ_0 01025783. 1)9.卵类粘蛋白 SEQ ID NO :3(gi 1162952006 | ref | NP_001106132. 1)10.卵白蛋白相关蛋白SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白，或骨粘连蛋白 (Osteonectin))SEQ ID NO 32 (gi|548972|sp|P36377. 11)11.卵糖蛋白(Ovoglycoprotein)SEQ ID NO 5 (gi | 45383093 | ref | NP_989872. 1)12.溶菌酶 C SEQ ID NO 6 (gi | 45384212 | ref | NP_990612. 1)13. 28kDA 蛋白质载脂蛋白前体 SEQ ID NO 33 (gi | 211146 | gb |AAA48592. 11)a.载脂蛋白 SEQ ID NO 34 (gi | 211154 | gb | AAA48595. 1)14.卵粘蛋白 α SEQ ID NO :7 (gi 112583679 | dbj | ΒΑΒ21488. 1)15. H印-21 蛋白 SEQ ID NO 8 (gi | 453831311 ref | NP_989852. 1)16. Ovocleidin 17 SEQ ID NO :9 (gi11087046|gb|AAB35101. 1)a. SEQ ID NO10(gi|32699622|sp|Q9PRS8. 2)b.SEQ ID NO :11 (gi | 31615312 |pdb 11GZ2 | A)17. 164KDa 蛋白质 M-蛋白，横纹肌 SEQ ID NO 21 (gi | 547919 | sp | Q02173. 1)18. 49KDa 蛋白质丛生蛋白 SEQ ID NO 12 (gi | 45382467 | ref | NP_990231. 1)19.卵固蛋白 SEQ ID NO 13 (gi 11683350 | gb | AH004621. 1)20. 18KDa蛋白质胰岛素样生长因子II SEQ ID NO 22 (giI 226693533|sp|P33717. 2)21. 8KDa 蛋白质胰岛素样生长因子 1 SEQ ID NO 23 (gi | 521386711 ref | NP_00100 4384. 1)22. *KDA 蛋白质 fowlicidin-1 SEQ ID NO 24 (gi | 242346718 | gb | ACS92527. 1)23. 3^(Da 蛋白质 WD 重复结构域 82 假基因 1 SEQ ID NO 25 (gi | 57524933 | ref | NP_001006135. 1)24. 34KDa蛋白质磺基转移酶家族胞质蛋白(cytosolic) IB成员ISEQ ID NO: 26 (giI 57013083|sp|Q8JG30. 1)25.卵粘蛋白 β SEQ ID NO :30 (gi | 48147235 | dbj | BAD22545. 1)26.NTF-3 蛋白(Neurotropin-3) SEQ ID NO 15 (gi | 6175082 | sp | Q91044. 2)27. XI 型胶原 SEQ ID NO 14 (gi | 63249 | emb | CAA23688. 1)28.半胱氨酸蛋白酶抑制剂 SEQ ID NO 16 (gi 1118195 | sp | P01038. 2)29. Gallinacin-Il SEQ ID NO 31 (gi | 82173548 | sp | Q6IV20. 1)硬蛋壳多肽1. Ovocleidin-116 SEQ ID NO 18 (gi|453830411ref|NP_989900. 1)2.丛生蛋白 49kDa SEQ ID NO 12 (gi | 45382467 | ref | NP_990231. 1)a. SEQ ID NO 35 (gi | 4325105 | gb | AAD17257. 11)3.0vocleidin-17 SEQ ID NO 11 (gi|31615312|pdb11GZ2)4. 0vocalyxin-32 SEQ ID NO 17 (gi|78100756|sp|Q90YI1. 1)实施例9 蛋壳多肽对成骨细胞活件的刺激作用测试了多肽冻干物(与经高压灭菌的蛋壳相比)对成骨细胞(骨形成细胞)的作用。在3种不同的温度和/或时间周期下对蛋壳粉末进行高压灭菌(PO)。此外，从新 鲜蛋壳和冻干蛋壳中提取并分离蛋壳多肽。形成了 6组，用于细胞培养研究1.对照(无添加物)2. 0_1(于1371高压灭菌)3. PO-II (于121°C标准高压灭菌)4.拟-硬蛋壳多肽0.58/1 [HA=透明质酸]5.硬蛋壳-多肽(低浓度0. 005g/l)6.硬蛋壳-多肽(高浓度0. 5g/l)7. PO-O (于 113 °C 高压灭菌)对于所有5个测试组和1个对照组而言，用成骨细胞进行5天的增殖研究。一周 和两周后，利用光学显微镜进行另外的形态学比较。此外，2周后对I型胶原、骨粘连蛋白、 骨桥蛋白和骨钙蛋白的表达进行检查和评估。在5小时后以及1、2、3、4和5天后测定每个视野中的细胞计数，以研究所添加物 质对牛成骨细胞增殖的影响。利用光学显微镜在100倍放大下进行每天计数。4周龄成骨 细胞的增殖结果(取决于培养时间)显示于图1和2。图2和3显示，取决于所添加的物质，在各细胞群体之间细胞计数的增加显著不 同。培养5小时后，添加PO Mod. I,PO Mod. II、HA+硬蛋壳多肽0. 5g/l的条带在未经处理 培养基的范围内。与此相反，对于硬蛋壳多肽0. 005g/l和HA+硬蛋壳多肽0. 5g/l而言， 发现其细胞计数略有增加。在第1天，与PO Mod. 11、撤+硬蛋壳多肽0.58/1和培养基相 比，硬蛋壳多肽0.5g/l的条带显示细胞计数显著增加(p<0.05)。相比而言，与硬蛋壳多 肽0. 005g/l和PO Mod. I相比，仅有细胞计数较高的趋势。至第5天，用硬蛋壳多肽0. 5g/ 1处理之细胞培养基中的细胞计数增加了 7倍。除硬蛋壳多肽0. 005g/l外，新鲜硬蛋壳多肽0. 5g/l的细胞计数在第2、3、4和5天的时间时明显超过了所有其他样品(ρ < 0. 001)。 未经处理培养基中的细胞计数持续增长至第5天。在添加有HA+硬蛋壳多肽0.5g/l的样 品中，在第3天至第5天期间仅观察到细胞计数有极少增加。与两个Putamen Ovi(PO)制备品相比，PO Mod. I的细胞计数明显高于PO Mod. II 的细胞计数。所研究物质PO Mod. I,POII Mod. II、硬蛋壳多肽0. 005g/l、硬蛋壳多肽0. 5g/ 1、HA+硬蛋壳多肽0. 5g/l和培养基的平均值、标准偏差和显著性水平。以用硬蛋壳多肽 0. 5g/l处理的细胞培养基作为参考，用于举例说明增殖的统计学显著性。测试组PO-O与其余显著不同。尽管对于增殖结果来说，其具有比对照更好的趋 势，但是与于137°C高压灭菌的样品相比较差。在增殖期中，含有较高硬蛋壳多肽浓度和经较低温度高压灭菌之PO的细胞增殖 和分化最为强烈。用透明质酸和硬蛋壳多肽以及经高温高压灭菌之PO进行的替代并没有 使细胞增殖或分化有任何显著增加。对骨特异性基质蛋白的合成研究表明，对于较高硬蛋 壳多肽浓度和经较低温度高压灭菌之PO而言，I型胶原和骨桥蛋白的表达增加。对生物矿 化作用的分析表明，单独的硬蛋壳多肽以及其与透明质酸之组合均导致其产生比任何一种 PO制备品明显更高的生物矿化作用和分化作用。结果表明，所添加的物质P0、硬蛋壳多肽和透明质酸对骨细胞反应因素具有决定 性影响。特别是第一次表明了新鲜蛋壳多肽的高潜能。本文中已表明蛋壳多肽(例如新鲜蛋壳多肽)可以刺激骨细胞生长并活化其代 谢。利用蛋壳多肽是一种刺激骨形成细胞和治疗骨质疏松症及其他骨病的新作用模式。与 抑制破骨细胞的双膦酸盐不同，蛋壳多肽显著刺激成骨细胞并轻微刺激破骨细胞。这使得 这两种协同性骨细胞(成骨细胞和破骨细胞)的代谢水平较高，其中对成骨细胞的影响较 大。另一个优势是没有已知的与施用蛋壳多肽相关的副作用或不良事件。骨用新鲜蛋壳多 肽处理比用双膦酸盐处理生长得更快。实施例10 细胞增殖测定在本实施例以及后面的实施例中，使用下列样品样品A 新鲜蛋壳的蛋壳提取物(多种蛋白)0. 5g/L样品B :0vocleidin-16 和 Ovocleidin-117 0. 5g/L样品C 丛生蛋白(硫酸化糖蛋白2)和0vocalyxin-32 0. 5g/L进行细胞增殖测定，以研究3种不同的未知蛋白样品(A、B、C和B+C，以不含蛋白 作为对照)在体外对原代牛成骨细胞细胞增殖的影响。对于细胞增殖测定，将牛成骨细胞 样细胞在添加有不同蛋白样品A、B、C和B+C的匪If培养基中培养4周。在不同培养基中 培养5小时和5天后，成骨细胞样细胞的光学显微镜观察结果表明，培养基中从5小时至5 天增加的细胞数目与所使用的培养基/添加蛋白无关(数据未显示)。细胞在亚汇合时接 种，培养5小时后表现出其大致立方形细胞的典型表型。培养5天后，细胞接近达到汇合，并 且部分开始表现出其典型的鹅卵石样外观。当细胞仍然处于亚汇合状态且单个细胞周围有 较大空间时，成骨细胞样细胞的大小和形状不同，并且表型从立方形/圆形至纺缍状变化。图4显示利用库尔特计数系统测定的培养5天后细胞的数目。样品A和B显示比 对照培养基(MMlf)低的细胞增殖结果(约25%)，而样品C和B+C显示较高的细胞数目。 添加有蛋白样品C的培养基产生了 2倍于添加有样品A或B之培养基的细胞。这些结果也与其他手工细胞计数方法所得到的结果相一致。除分析细胞数目外，还可通过库尔特计数系统检测细胞大小的偏离情况。图5显 示在匪If培养基(作为对照)以及添加有蛋白样品A、B、C和B+C的培养基中培养5天后 成骨细胞的平均细胞大小。如图6显示，与培养基无关，培养5天后原代成骨细胞样细胞的细胞大小大于 17 μ m0但是也可以看出区别，添加有蛋白样品C和B+C的培养基产生了与对照细胞(在 MMlf培养基中)相比较小的细胞。而在添加有蛋白样品A的培养基中培养的成骨细胞样细 胞的细胞大小是18. 77 μ m,比MMlf中的高得多。蛋白样品B似乎也使得细胞大小增加，但 是小于蛋白样品A。为了研究所添加的蛋白样品对细胞增殖的影响，将细胞培养于不同的培养基中并 测定细胞的数目。分别培养5小时、1天、2天、3天、4天和5天后，通过利用相差光学显微镜 对图像不同区域内的细胞进行计数来计算细胞/图像。利用软件程序Image J进行分析。 5天的培养时间中所测定之细胞数量(细胞/图像)的平均值显示于图7中。标准偏差和 P值列于下面表ι中。培养5小时后，细胞数目的平均值全部在相同范围内。第1天时，在所有所用培 养基中的细胞数目均增加。可以观察到在经添加的培养基中细胞较多的微弱趋势(P> 0. 05)。培养5小时后，经添加的培养基中所计数细胞的平均值与MMlf培养基中细胞的平 均值大致相等。1天后，在MMlf中和添加有样品A之MMlf中培养的细胞的细胞数目的增加 略高于其他培养基。添加有样品C的培养基显示最低的增加量，其细胞数目仅增加7%，而 在MMlf中则增加32%。在2天和3天后，所有培养基均显示细胞数目大量增加。添加有 蛋白C(380%)和添加有样品B+C(320%)的培养基分别显示出从第2天至第3天细胞数 目增加的最高值。5天后，MMlf和添加有样品B的培养基显示细胞数目少量增加。相比而 言，添加有样品A的培养基中细胞数目增加较多，这不能得到库尔特计数仪结果的支持。分 别添加有样品C和样品B+C之培养基中的细胞增长与用作对照的MMlf培养基明显不同，对 于样品C而言具有高显著性(ρ < 0. 01)，对于样品B+C而言差异最显著(ρ < 0. 001)。表1被测蛋白A、B、C、B+C和匪If培养基(作为对照)对细胞增殖影响的平均值、 标准偏差和P值概览。显著性最高的数值标为红色(P < 0. 5 =显著，P <0.01 =高度显 著，ρ < 0. 001 =最显著)
权利要求
1.一种刺激成骨细胞活性的方法，包括使成骨细胞与包含来自蛋壳之多肽提取物的组 合物相接触，其中所述多肽提取物分离自硬蛋壳组织、软蛋壳组织或其组合。
2.权利要求1的方法，其中所述蛋壳是新鲜蛋壳。
3.权利要求1的方法，其中所述蛋壳来自已受精或未受精的蛋。
4.权利要求1的方法，其中所述来自硬蛋壳组织的多肽提取物通过用l-25wt%的SDS 和任选地1-60%体积/体积的乙酸处理硬蛋壳组织来分离。
5.权利要求4的方法，其中所述来自硬蛋壳组织的多肽提取物包含Ovocleidin、 Ovocalyxin或丛生蛋白。
6.权利要求1的方法，其中所述来自软蛋壳组织的多肽提取物通过用包含2至IOM尿 素且PH值为7. 0-9. 0的溶液处理软蛋壳组织来分离。
7.权利要求6的方法，其中所述来自软蛋壳组织的多肽提取物包含卵白蛋白、卵转铁 蛋白前体、78kDa多肽(卵转铁蛋白家族)、l(^kDa多肽(卵转铁蛋白家族)、卵白蛋白相 关多肽Y、52kDa多肽(卵抑制剂，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白)、卵类粘蛋白前体、与卵白蛋白 相关蛋白Y类似的SERPINB11、卵糖蛋白前体、溶菌酶C前体、28kDa多肽、卵粘蛋白α亚 基、H印21蛋白前体、0vocleidin-17、164kDa多肽、丛生蛋白49多肽、卵固蛋白前体、WkDa 多肽、8kDa多肽、35kDa多肽、34kDa多肽、α -1 (XI型)胶原同工型、ΝΤ-3生长因子受体的 α -KT同工型、半胱氨酸蛋白酶抑制剂前体、SPARC多肽，它们的活性片段，或者包含一种或 多种上述物质的活性级分。
8.权利要求1的方法，其中所述成骨细胞位于哺乳动物对象的损伤部位，并且其中接 触包括通过注射施用至所述损伤部位。
9.权利要求1的方法，其中所述来自蛋壳的多肽提取物以0.0001g/L至2g/L的浓度存在。
10.权利要求1的方法，其中所述来自蛋壳的多肽提取物以0.005g/L至0. 5g/L的浓度 存在。
11.权利要求1的方法，其中所述成骨细胞存在于离体培养物中。
12.权利要求1的方法，其中使成骨细胞接触包括将所述组合物施用于需要修复软骨 的个体。
13.权利要求1的方法，其中使成骨细胞接触包括骨内注射或局部施用。
14.权利要求13的方法，其中所述骨内注射或局部施用用于椎体后凸成形术、脊椎成 形术、骨折部位或者骨或关节缺陷中。
15.一种在有此需要的个体中刺激成骨和/或骨诱导活性的方法，其包括对该个体施 用包含来自蛋壳的多肽提取物的组合物，其中所述多肽提取物分离自硬蛋壳组织、软蛋壳 组织或其组合。
16.权利要求15的方法，其中所述蛋壳是新鲜蛋壳。
17.权利要求15的方法，其中所述蛋壳来自已受精或未受精的蛋。
18.权利要求15的方法，其中所述来自硬蛋壳组织的多肽提取物通过用包含l-25wt% 的SDS和任选地1-60%体积/体积的乙酸的溶液处理硬蛋壳组织来分离。
19.权利要求18的方法，其中所述来自硬蛋壳组织的多肽提取物包含Ovocleidin、 Ovocalyxin或丛生蛋白。
20.权利要求15的方法，其中所述来自软蛋壳组织的多肽提取物通过用包含2至IOM 尿素且PH值为7. 0-9. 0的溶液处理软蛋壳组织来分离。
21.权利要求20的方法，其中所述来自软蛋壳组织的多肽提取物包含卵白蛋白、卵转 铁蛋白前体、78kDa多肽(卵转铁蛋白家族)、105kDa多肽(卵转铁蛋白家族)、卵白蛋白相 关多肽Y、52kDa多肽(卵抑制剂，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白)、卵类粘蛋白前体、与卵白蛋白 相关多蛋白Y类似的SERPINB11、卵糖蛋白前体、溶菌酶C前体、28kDa多肽、卵粘蛋白α亚 基、H印21蛋白前体、0vocleidin-17、164kDa多肽、丛生蛋白49多肽、卵固蛋白前体、WkDa 多肽、8kDa多肽、35kDa多肽、34kDa多肽、α -1 (XI型)胶原同工型、ΝΤ-3生长因子受体的 α -KT同工型、半胱氨酸蛋白酶抑制剂前体、SPARC多肽，它们的活性片段，或者包含一种或 者多种上述物质的活性级分。
22.权利要求15的方法，其中所述个体需要治疗骨病。
23.权利要求22的方法，其中所述骨病是骨质疏松症、骨质减少症、成骨不全症、或佩 吉特病、骨软化症、骨石化症、奥斯古德-施莱特病、骨痛退化症、反射性交感神经营养不良 综合征(复杂性区域疼痛综合征)、暂时性骨质疏松、无血管性坏死、骨坏死、骨软骨病变、 溶骨性病变、骨肿瘤或者骨折。
24.权利要求15的方法，其中所述施用包括口服、静脉内、肌内或鼻内施用。
25.权利要求15的方法，其中所述个体需要修复软骨。
26.一种在有此需要的个体中刺激血细胞生成的方法，包括对所述个体施用包含来自 蛋壳之多肽提取物的组合物，其中所述多肽提取物分离自硬蛋壳组织、软蛋壳组织或其组 合
27.权利要求沈的方法，其中所述个体需要治疗贫血以及相关的骨髓和血液疾病。
28.一种在有此需要的个体中刺激软骨形成和/或分化的方法，包括对该个体施用包 含来自蛋壳之多肽提取物的组合物，其中所述多肽提取物分离自硬蛋壳组织、软蛋壳组织 或其组合。
29.一种在有此需要的个体中刺激成纤维细胞的方法，其包括对所述个体施用包含来 自蛋壳之多肽提取物的组合物，其中所述多肽提取物分离自硬蛋壳组织、软蛋壳组织或其组合。
30.用1至25wt%的SDS和任选地1至60%体积/体积的乙酸处理硬蛋壳组织之方法 的产物。
31.权利要求30的产物，包含Ovocleidin、Ovocalyxin或丛生蛋白。
32.用包含2至IOM尿素且pH值为7.0-9. 0的溶液处理软蛋壳组织之方法的产物。
全文摘要
本文中鉴定了鸡蛋壳的活性组分，其在离体研究中显示出对造骨细胞(成骨细胞)具有刺激作用。该物质是从蛋壳分离的多肽混合物。本文中已发现，包含蛋壳多肽的组合物刺激成骨细胞，并且具有骨诱导/成骨特性、血细胞生成特性以及软骨生成或分化特性。该蛋壳多肽提取物可以局部或者全身施用。
文档编号A61K35/54GK102149394SQ200980135310
公开日2011年8月10日 申请日期2009年7月10日 优先权日2008年7月10日
发明者伊兰·埃利亚斯 申请人:伊兰·埃利亚斯