人体免疫缺陷病毒(hiv)蛋白的表达的制作方法

专利名称：人体免疫缺陷病毒(hiv)蛋白的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及由CD-4(sCD-4)可溶蛋白衍生的HIV结合蛋白的制造方法，更具体地说涉及用于HIV结合蛋白在大肠杆菌、链霉菌和酵母中表达的载体的构建。
人体T细胞糖蛋白CD-4(以前有时称为“T4”)是若干非多形T淋巴细胞表面受体蛋白中的一种，这类蛋白与T细胞和靶细胞之间的有效中介作用有关。
人们已经知道人体CD-4(T-4)受体的cDNA序列(Maddon，et.al.，Cell，42∶93，1985)。CD-4前体蛋白的完整序列其长度达458个氨基酸，包括公认的23个氨基酸的分泌前导部分，372个氨基酸的表面(V-V)，23个氨基酸的跨膜和40个氨基酸的细胞原生质结构区。该表面结构区有四个区，有限对应(20～30%)于免疫球蛋白可变(V)和接合(J)区。在表面结构区的五个内含子-外显子界面中有四个界面位于V-J这些区域接合部位附近。
人体免疫缺陷病毒(HIV)即获得性免疫缺陷综合症(爱滋病AIDS)的病因剂对CD-4淋巴细胞具有显著的亲和性。病毒与CD-4的结合由病毒被膜的gp120糖蛋白起中介作用。CD-4蛋白是由溶解HIV感染的细胞与抗env抗体共沉淀得到的，与此相反，gp120可以与抗CD-4单克隆抗体共沉淀，因此可以说明病毒与CD-4的结合由病毒被膜的gp120糖蛋白起中介作用。
近来有许多科学研究工作者报导了他们采用在哺乳动物细胞体系中表达的CD-4衍生物对关于CD-4和爱滋病感染之间相互作用的发现。
Deen等(Nature，331∶82，1988)报导了sCD-4在若干细胞环境中的分离和表达。sCD-4是缺失CD-4跨膜和细胞原生质结构区的CD-4可溶衍生物。用中国仓鼠卵巢(CHO)dfhr缺失细胞系业已证明被表达的sCD-4保留着CD-4在细胞表面上的结构和生物学特征、与HIVgp110被膜蛋白的结合，并且能够抑制CD-4淋巴细胞的结合。
Trauneker等(Nature，331∶84，1988)报导了采用sCD-4抑制病毒对靶细胞的粘附。给出的数据说明，采用sCD-4的重组形式能够抑制HIV的体外感染。
Fisher等(Nature，331∶76，1988)报导了sCD-4从CHO的纯化并可用作病毒复制和病毒诱导细胞融合的有效抑制剂。
Hussey等(Nature，33∶78，1988)报导了将baculo病毒表达系统用于产生sCD-4，并已发现通过与gp120表达细胞能够抑制病毒诱导细胞的融合(合胞体的形成)和HIV的感染。此外，还证明sCD-4蛋白似乎并无抑制Ⅱ型特异T细胞的作用。
Smith等(Science，238∶1704，1987)还报导了将CHO哺乳动物细胞体系用于产生sCD-4。他们报导了在CHO细胞蛋白结合并抑制HIV-1在体外的感染。数据说明sCD-4能够用作治疗爱滋病感染的基础。
但是，仍然需要用于表达sCD-4蛋白的细菌和低等真核体系。
本发明在于发现HIV与CD-4蛋白的结合作用能在大肠杆菌中表达，并且发现这种HIV结合蛋白能够分泌到发酵培养基中。因此，具体地说，本发明就是指大肠杆菌表达载体，包括通过操作使HIV结合蛋白与调节单位相连接。
本发明还发现HIV与CD-4蛋白的结合作用能在链霉菌中表达，并且发现这种HIV结合蛋白能够分泌到发酵培养基中。因此，具体地说，本发明系指链霉菌表达载体，包括通过操作使HIV结合蛋白与调节单位相连接。
本发明还发现HIV与CD-4蛋白的结合作用能在酵母中表达。因此，具体地说，本发明系指酵母表达载体，包括通过操作使HIV结合蛋白与调节单位相连接。
本发明还发现OMPA前导序列能够用于从大肠杆菌输出异源蛋白。因此，具体地说，本发明系指用于表达大肠杆菌中被输出蛋白的大肠杆菌表达载体，包括通过操作使DNA编码序列与调节单位相连接，其中DNA编码序列为蛋白X-Y编码，C代表OMPA前导序列，y代表异源蛋白。
根据本发明，由CD-4受体衍生的HIV结合蛋白以可以使用的量用作治疗剂和/或预防药来抑制HIV的初感染和抑制以后的HIV宿主感染的细胞与细胞的传播、用作筛选HIV-淋巴细胞结合的抑制剂;用作CD-4+淋巴细胞功能的抑制剂;或如下所述的其它用途。所有蛋白质具有HIV与CD-4结合的功能。这类蛋白的最佳例子是sCD-4蛋白及其衍生物。sCD-4蛋白是缺失跨膜和CD-4细胞原生质结构区的CD-4的衍生物。介绍sCD-4蛋白的例子见于Deen、Traunecker、Fisher和Hussey(Nature，331∶76-88，1988)以及Smith(Science，238∶1704，1987)等人各自发表的论文。
本文例举的sCD-4蛋白是由Deen等(见上述期刊第83页)报导的SKBsCD-4。下面给出了氨基酸和核苷酸序列。该序列系由Maddon等给出的由CD-4cDNA衍生的5′端未转译区和前导序列(Cell，42∶93，1985)。由CHO细胞表达和分泌的成熟SKBsCD-4的第一个氨基酸是由151-133bp编码的赖氨酸。跨膜区的缺失是由用HpaⅡ在1252bp上限制了CD-4cDNA并且连接了一个衔接物，该衔接物恢复了1253-1257bp并在C端的缬氨酸之后取代了转译终止密码子TAA。由Maddon等报导的成熟CD-4的前3个氨基酸是谷氨酰胺(本文用氨基酸(-)2表示)-甘氨酸(本文用氨基酸(-)1表示)-天冬酰胺(本文作为赖氨酸用氨基酸(+)1表示)。另外，下面所报告的序列与Maddon等所报告的序列相同。
基本上保持着sCD-4的HIV结合亲和性的sCD-4截端及其衍生物也可按本发明表达。最好在这些截端中，蛋白质和多肽包括V1和V2两个区的HIV结合区，该结合区大致是在氨基酸1-182内。关于上述序列中，一个具体例子是本文称之为VIJ4的蛋白质，它具有与氨基酸351-369(-甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸至-苏氨酸-脯氨酸-缬氨酸-C)融合的氨基酸(-)2-104(N-谷氨酰胺-甘氨酸-赖氨酸-至-丙氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-C)。第二个例子是本文称之为VIV2J4的蛋白质，它具有与氨基酸351-369融合的氨基酸(-)2-183(N-谷氨酰胺-甘氨酸-赖氨酸-丙氨酸-丝氨酸-C)。第三个例子是本文称之为YVI的蛋白质，它包括至-赖氨酸-氨基酸(-)9-151(N-丙氨酸-亮氨酸-亮氨酸-至-亮氨酸-谷氨酸-亮氨酸-C)。第四个例子是本文称之为SKBYsCD-4，它具有氨基酸(-)9-369。均以OKT4A结合为基础的这些HIV结合蛋白中，每一个HIV结合蛋白都具有HIV与sCD-4蛋白结合的特性，尤其是SKBsCD-4，更具体地说都具有HIV与sCD-4的V1和V2区结合的结构区，尤其是SKBsCD-4。
除了本文中特别例举的这些蛋白外，本领域的专业人员能够很容易为其他sCD-4衍生物构建DNA编码序列。这些衍生物基本上仍保持着HIV与sCD-4蛋白的结合功能，也即蛋白与HIVenv蛋白gp120的结合没有明显的反作用。例如，专业人员能够构建仅仅具有V1区(约为氨基酸1-94)的衍生物，或构建仅仅具有CD-4的V1区的一部分。尤其是专业人员还能构建本文例举的蛋白质衍生物，例如由一个或少数氨基酸的缺失、增加或取代所形成的不同的衍生物。
另外，杂交蛋白即转译融合可以在sCD-4蛋白如蛋白载体、另一抗原或其他sCD-4分子间构建，以制备多sCD-4分子。还有一种则可通过人工合成将sCD-4缺失突变体结合成载体分子。
sCD-4分子对HIV的亲和性可用具有已知亲和性的sCD-4分子或用能识别诸如OKT-4和OKT-4A一类CD-4受体的抗体通过竞争性蛋白结合测定予以证明。本发明有用的sCD-4蛋白可用下述实施例所示OKT4A有选择的从条件培养基沉淀得到。CD-4、及其片段和衍生物在表达后可用化学方法制备，或表达前用遗传方法通过对前导序列和/或胞外结构区编码序列的操作进行制备。
sCD-4或由其衍生的HIV结合蛋白的DNA编码序列的获得，例如可通过用已知DNA序列人工合成基因，通过以序列为基础的常规克隆技术，以及用蛋白质检测进行再分离，即由CD-4表达细胞系的cDNA克隆转染和由抗蛋白抗体进行鉴定(参阅Maddon，etal.，同上)。
带有特殊sCD-4蛋白编码序列的cDNA克隆可采用寡核苷酸杂交探查物鉴定。该探查物可根据蛋白质的特殊序列设计。在鉴定了带有意义的编码序列的克隆后，蛋白质的编码序列可用核酸内切限制酶切割并插入到克隆和/或表达载体中。在表达载体中，sCD-4蛋白的编码序列通过操作连接到转录、转译和编码序列处理所需的调节功能上。
在大肠杆菌中实施本发明时，编码HIV结合蛋白(例如sCD-4或其衍生物)的DNA编码序列通过操作与转化大肠杆菌的DNA载体中的调节单位相连接。许多革兰氏阴性细菌表达载体包括这类可利用的调节单位。调节单位包括作用于RNA聚合酶结合和转录的启动子。可调节的即可诱导或去阻遏的启动子为最佳。大量可利用的启动子都可用于异源多肽在大肠杆菌中的表达。这类启动子包括trp启动子和λPL启动子。例见美国专利US-4578355和Courtney等人的论文(Nature，313∶149，1985)。最佳的调节单位包括将HIV结合蛋白输送到或穿过按本发明发现能分泌HIV结合蛋白的细胞膜的前导序列。业已证明将蛋白质输送到大肠杆菌外层膜的前导(leader)就是地衣形芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和青霉素酶基因。参阅Sarvas等论文(J.Bacteriol.，155∶657，1983)。
本文要特别例举的用于外层膜的前导的是多糖A(本文称为OMPA前导或信号)(参阅Movva，etal.，J.Molec.Biol.，143∶317，1980)。OMPA编码序列包括可将HIV结合蛋白分泌到发酵培养基中去的前导序列。现已发现，OMPA前导能够将各种低分子量蛋白质或多肽完全分泌到培养基中。例如用OMPA信号除了获取SKBsCD-4、VIJ4和V1V2J4外，还可获得大量(例如＞1～10mg/I左右)的活性人体转化生长因子-α(TGF-α)、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞间素-1-β(IL-1-β)。
OMPA信号基本上包括下列21个氨基酸N-me+-lys-lys-thr-ala-ile-ala-ile-ala-val-ala-leu-ala-gly-phe-ala-thr-val-ala-gln-ala-c。这种前导DNA编码序列是可以人工合成的，最好使一个或多个限制位点是在插入所需DNA编码序列的C端氨基酸附近，并且终止区是在所需编码序列的下游。下述实施例将会给出人工合成的编码序列。
除了HIV结合蛋白小基因，即编码序列可通过操作与调节单位连接外，用于转化的载体最好至少含有一个表型转化标记基因即遗传选择基因，例如抗菌素抗性基因、色原或补充营养突变的基因。载体还包括自主复制所要求的区段。
用于sCD-4蛋白在大肠杆菌中表达的表达载体的构建在实施例中将详细介绍。将蛋白质置于培养基中表达显然更加适宜。
在链霉菌中实施本发明时，编码HIV结合蛋白(例如sCD-4或其衍生物)的DNA编码序列通过操作与用于链霉菌转化的DNA载体中的调节单位相衔接。调节单位包括作用于RNA聚合酶结合和转录的启动子。可调节的即可诱导或去阻遏的启动子为最佳。大量可利用的启动子都可用于异源多肽在链霉菌中的表达。其包括的例子有链霉菌半乳糖操纵子的半乳糖诱导启动子(Fornwald，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84∶2130，1987)，兰色链霉菌(S.lividans)β-半乳糖苷酶基因的结构启动子(Eckhardt，etal.，J.Bacteriol.，169∶4249，1987;Brawner，etal.，U.S.Patent4717666)和长孢链霉菌(S.longisprus)胰蛋白酶抑制因子基因(欧洲专利申请No.87307260.7)，或短暂调节启动子(如在M，echinosporsa，Baum，etal.，J.Bacteriol.，170∶71，1988)。链霉菌中的转录终止区是由若干链霉菌基因的3′端衍生的，例如在链霉菌半乳糖操纵子末端的终止信号，或在S.fradiae新霉素磷酸转移酶基因末端发现的终止信号(ThompsonandGray，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80∶5190，1983)。链霉菌中蛋白质输出物的序列包括由兰色链霉菌β-半乳糖苷酶基因、兰色链霉菌LEP-10基因(欧洲专利申请No.87307260.7)和长孢链霉菌胰蛋白酶抑制因子基因中分离得到的序列。
将sCD-4基因结合到较大的DNA分子中，包括遗传选择标记基因系统。该遗传选择标记基因系统可以是大量已知标记基因系统中的任意一种，但要使标记基因将可选择的新表型给予已经转化的细胞。包括的例子有链霉菌抗药性基因，如抗硫链丝菌肽核糖体甲基化酶(Thompson，etal.，Gene，20∶51，1982)，新霉素磷酸转移酶(Thompson琫t，al.，同上)。DNA分子也可含有在链霉菌中进行自主复制的序列，例如pIJ101衍生物(Keiser，etal.，Mol.GenGenet.，185∶223，1982)或SLP1衍生的载体(Bibb，etal.，MolGenet.，184∶230，1981)。DNA分子还可含有使基因增殖的标记基基。这类可用于在链霉菌中增殖基因拷贝数的标记基基包括用于抗放射壮观素(Hornemann，etal.，J.Bacteriol.，169-2360，1987)和精氨酸营养缺陷性的基因(AHernbuchner，etal.，MolGen.Genet.195∶134，1984)。
关于起始表达的研究，将在下面实施例中要详细介绍的CD-4编码序列与在位于βgal信号肽切割位点的8个氨基酸下游的βgal信号序列融合。对这种表达载体的链霉菌复制功能是由pIJ101(Keiser，etal.，MolGenGenet.，185∶223，1982)的衍生物质粒pIJ702(Katz，etal.，J.GenMocrobiol.，129∶2903，1983)提供的。所用宿主菌株是野生型兰色链霉菌1326(Bibb，etal.，MolGenGenet.，184∶230，1981)。βgal-sCD-4融合蛋白在培养物上清液和完整细胞中进行检测。其他一系列试验已证明启动子可用来获得sCD-4蛋白更有效的表达。
LTI表达/分泌载体类似于由LTI启动子控制的该基因表达中的βgal系统和由LTI信号肽产生的蛋白质输出物。许多HIV结合蛋白的编码序列已被克隆到包括V1V2J4和V1J4在内的LTI载体中。所有这些蛋白质的编码序列都在位于LTI信号肽切割位点的8个氨基酸下游的位置上被插入。如同βgal融合一样，sCD-4蛋白可通过LTI信号肽输送到培养物上清液中。链霉菌复制功能还可由pIJ101衍生物pIJ 702和pIJ351提供(Keiser等，同上)。
LTI表达系统中SKBsCD-4、VIJ4和V1V2J4的表达开始是在兰色链霉菌1326中进行检查的。在培养物上清液和完整细胞之间，SKBsCD-4和V1V2J4的分布均匀。尽管这些蛋白质的输出并不完全，但是按其在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的移动情况看来，细胞间和细胞外的形状似乎都具有同样的分子量。信号肽是否通过蛋白分解从细胞间除去，尚不清楚。在培养物上清液和完整细胞中，估计SKBsCD-4的最高量达30mg/l。在培养物上清液和完整细胞中，估计V1V2J4的量至少为30mg/l。
在兰色链霉菌中sCD-4表达所遇到的一个问题就是其对蛋白酶活性的易感性。这个问题可通过sCD-4在其他种链霉菌中的表达予以解决，或至少可使问题的严重性显著减轻。例如，sCD-4蛋白可在天兰色链霉菌(S.coelicolor)、长孢链霉菌和白色链霉菌(S.albus)中表达。改换这些宿主可以期望分子的稳定性得到提高。sT4蛋白在长孢链霉菌中的表达也是有利的，因为该宿主将相当少量的蛋白分泌到培养物上清液中，而这有助于纯化处理。
在酵母中实施本发明时，编码HIV结合蛋白(例如sCD-4或其衍生物)的DNA编码序列通过操作与进行酵母转化的DNA载体中的调节单位连接。可用于转化、克隆和表达系统的任何酵母宿主均可使用。这些酵母的具体例子有汉逊氏酵母(Hensenula)、毕赤氏酵母(Pichia)、Kluveromyces酵母、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、假丝酵母(Candida)和Saccharomyces酵母。最佳的酵母宿主是啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
调节单位包括作用于RNA聚合酶结合和转录的启动子。尤以可调节的即可诱导或去阻遏的启动子为最佳。各种有用的启动子都可用于异源多肽在酵母中的表达。这些启动子包括铜诱导的金属硫因基因(CUP1)启动子和糖解基因甘油醛-3-磷酸(酯)脱氢酶(TDH3)和醇脱氢酶(ADH)的结构启动子。酵母中转录终止区是由若干酵母基因(例如异-1-细胞色素C基因(CYC1)中任何基因的3′端衍生的。
将sCD-4基因结合到较大DNA分子中，包括遗传选择标记基因系统。选择标记基因系统可以是大量已知标记基因系统中的任意一种，要使标记基因将可选择的新的表型给予已转化的细胞。酵母基因的例子包括用于生物合成酶的酵母基因，可例举的酶有磷酸核糖氨茴酸异构酶(TRP1)或乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶(URA3)，或异源抗药性基因，例如抗G418或抗benomyl基因(BEN1)。DNA分子也可含在酵母中用于进行自主复制的序列，如2微米环状酵母oti区或染色体自主复制区(ARS)，如ARS1，以及酵母着丝粒(CEN)，如CEN3，这些都可用于质粒的自主复制。
由于已经发现，仅有SKBsCD-4则表达很差，所以作为最佳表达系统来说，将HIV结合蛋白编码序列与稳定表达的编码序列融合;而表达差可能是由于无效转录和转译或蛋白质迅速降解。在任何情况下，都已证明基因融合产物是在相当高的水平进行表达的，并且经切割得到ubiquitin和sCD-4基因产物，而在这种基因融合中，ubiquitin的编码序列将5′与SKBsCD-4编码序列融合。
ubiquitinDNA编码序列可采用常规基因克隆技术，从酵母或其他真核细胞包括哺乳动物细胞中分离得到。另外，也可采用已知常规技术合成。用于说明本发明的调节ubiquitin基因的核苷酸序列已由Ecker等在J.BiolChem.，262∶3524，1987上作了介绍。其序列大致如下AATTCATTATGCAGATCTTCGTCAAGACGTTAACCGGTAAAACCATAACTCTAGAAGTTGAATCTTCCGATACCATCGACAACGTTAAGTCGAAAATTCAAGACAAGGAAGGCATTCCACCTGATCAACAAAGATTGATCTTTGCCGGTAAGCAGCTCGAGGACGGTAGAACGCTGTCTGATTACAACATTCAGAAGGAGTCGACCTTACATCTTGTCTTAAGACTAAGAGGTGGTTGAGGTAC通过在HIV结合蛋白序列的5′端上插入信号肽的DNA序列，就能成功地使蛋白质分泌到培养基中。用于这种目的的信号序列，例如有酵母交配因子和α因子(KurjanandHerskowifz，Cell，30∶933，1982)的信号序列。此外，将sCD-4酵母表达模板整合到酵母染色体中即可获得表达，继而采用标记基因如酵母DHFR基因增殖，从而为增加的拷贝量进行选择。
一般说来，本发明的sCD-4蛋白可采用各种蛋白质纯化技术，由用过的培养基中进行纯化。蛋白质的纯化技术例如有亲和色谱法，离子交换色谱法，通透色谱法、疏水色谱法或反向色谱法。
sCD-4及其片段和衍生物可采用普通组比吸附剂和亲和色谱法进行纯化，所述普通组比吸附剂例如有糖类结合配位体或染料亲和配位体;或用与sCD-4(如单克隆抗体或HIVgp120蛋白或它们的一部分)特异结合的配位体。
纯化包括在大约28～45℃下，细胞在选择生长培养基中生长后，先澄清发酵培养基，然后将HIV结合蛋白与培养基中的其他蛋白分离。最佳方法是根据sCD-4分子的物理性质进行一系列层析步骤，从培养基中纯化sCD-4蛋白。
sCD-4蛋白纯化的另一方法是针对sCD-4采用单克隆抗体，蛋白质可用一步法纯化，即将澄清的培养基通过亲和凝胶载体，针对该蛋白质的单克隆抗体与该凝胶载体结合。有意义的蛋白在抗体结合部位与层析柱结合，而污染蛋白在层析柱上洗涤。然后在防止灭活的条件下，从层析柱上将蛋白质洗脱下来。
sCD-4蛋白的体外生物和免疫性质的特征说明，该蛋白对防治爱滋病具有重要意义。研究证明，sCD-4蛋白是一种病毒的胞外和细胞对细胞传播的抑制剂。因为本发明所介绍的sCD-4及其片段和衍生物已经证明，封闭病毒与培养液中CD-4+靶细胞相结合，这被认为给已感染的患者施用这类蛋白，能够抑制病毒的细胞外传播。因此，sCD-4蛋白作为治疗爱滋病的防治剂或与爱滋病有关的复合物(ARC)都具有重要的价值。
作为预防剂，给对这种疾病存在高度威胁的个人或对在病毒抗体存在下暴露在HIV之中的个人施用sCD-4蛋白。在患病的早期或在其攻击之前，施用有效量的这种蛋白质，可抑制HIV对CD-4+淋巴细胞的感染。作为治疗剂，给由HIV感染的患者施用sCD-4，可抑制病毒的细胞外传播。
受HIV感染的细胞和其他CD-4+淋巴细胞之间的融合似乎也是病毒传播的途径。此外，融合也可以部分对患者CD-4+淋巴细胞功能造成损害及CD-4+淋巴细胞的绝度缺失。细胞融合决定于病毒被膜基因产物和CD-4受体，并可受OKT-4A或类似单克隆抗体(Mabs)的抑制(Sattentau，et.al.，Science，234∶1120，1986)。本文所述的sCD-4蛋白与细胞融合相互干扰，因此要降低病毒的细胞对细胞的传播和CD-4+淋巴细胞功能的丧失。
CD-4受体是单型的，因此sCD-4蛋白被认为是一种能识别包括所有HIV在内的CD-4受体表面结构区的通用病毒抑制剂。
sCD-4蛋白可以与其他制剂结合使用，例如与抗其他HIV蛋白的制剂结合使用，如逆转录酶、蛋白酶等。用作HIV的有效治疗剂时，应防止病毒的中介作用和细胞与细胞的感染转移。sCD-4蛋白也可与其他抗病毒剂结合使用，例如叠氮胸苷(AZT)。
本发明的sCD-4蛋白还可通过与细胞外靶分子的结合。这种靶分子通常与CD-4受体表面结构区相作用，从而用作CD-4+细胞功能抑制剂。许多研究都提出CD-4受体在免疫耐性方面的临界作用，特别是在自身免疫病发病和进展以及宿主特异性移植排斥方面的临界作用。
用作预防或治疗剂时，sCD-4蛋白通过非肠道施用，最好通过静脉施用。该制剂可以浸剂或注射剂形式按日、周或月给药。剂量和速率的选择应保持sCD-4蛋白有效的循环量。另一种施用方式是将sCD-4蛋白用作体外透析剂。
本发明的sCD-4蛋白也可作为等同于用作治疗剂或CD-4+细胞作用抑制剂的天然的、合成的或重组的分子制剂使用。
例如sCD-4蛋白可用于筛选测定，如使用ELISA方法进行蛋白质作用的测定，以提供生化纯水溶性试剂，并与其他试剂结合使用，可测定CD-4受体表面结构区作用的竞争。例如，由于sCD-4蛋白与HIVenv蛋白或含HIVenv蛋白的混合物相结合，这种蛋白可用于筛选病毒结合的抑制剂。
根据体外研究证明，sCD-4蛋白能与表达HIVenv蛋白的细胞结合，因此这些蛋白也可用作对HIV感染的体内细胞的选择性靶分子。作为特异性靶载体蛋白，sCD-4蛋白可以用作载体蛋白，将毒害细胞的制剂输送给已感染的细胞。
此外，根据研究还证明，由于CD-4+细胞的分类限制作用，在细胞中存在抗原的情况下，CD-4受体特别能与MHC Ⅱ型抗原相结合，因此sCD-4蛋白可与Ⅱ型抗原结合使用，测定CD-4淋巴细胞与靶细胞相互作用的抑制剂。除了这些根据蛋白质与其靶分子之间的直接结合测定的例子之外，还可根据对蛋白识别的生化反应，设计更为复杂的测定。缺失型突变体也可用于检测与之作用的CD-4蛋白或分子的诊断测定。例如CD-4和CD-4+细胞以及对CD-4抗体的定量化测定，对爱滋病具有重要的诊断价值。
另外，sCD-4蛋白可用于生产新的诊断试剂，例如用于常规免疫测定(即ELISA测定、俘获免疫测定和放射免疫测定等)的Mabs或其他类型的分子。由于sCD-4对OKT-4、OKT-4A和大多数(如果不是全部)CD-4受体的其他表面抗原决定部位能够产生作用，所以该蛋白特别可用于系统内CD-4绝对量的免疫诊断测定。
CD-4受体残存在三种不同的化学环境氧化亲水细胞表面;疏水膜和还原亲水细胞质。这些不同的环境很可能妨碍处于完全天然状态下的受体的分离。sCD-4蛋白内由细胞外结构区的选择片段组成，并以可溶蛋白分泌到细胞上清液中，其外形看来与受体表面结构区的表面报其相似。因此，sCD-4蛋白适宜于作细微的结构分析，尤其适宜于作X射线结晶学分析。对单独的sCD-4蛋白或其他相作用的分子形成的复合物进行三维结构的测定，可为合理设计sCD-4的选择性拮抗物和激动剂提供基础。
以下给出的实施例是说明而不是限制本发明。遗传操作中所使用的酶通过商业途径获得，并且基本上按Vendor指示使用。除了另有说明外，基本上按Maniatis等所述方法(MolecularCloning，ColdSpsingHarborLaboratory，1982)进行。
实施例1大肠杆菌表达载体的构建采用重组DNA操作步瑁艚釉谥罩姑苈胱樱ㄐ蛄屑希㏕AA后面的完整SKBsCD-4和缺失突变体的编码序列置于大肠杆菌表达载体中的OMPA信号序列的下游，以构建质粒OMPAST4BBVI、OMPAVIVz和OMPAVI，这些载体的构建步骤如下
质粒JPT4的构建为了构建质粒JRT4，用XhoⅠ切割质粒DSP1(Pfarr，etal.，DNA，4∶461，1985)，失去SV40多聚腺苷酸早区，并用DNA聚合酶的克列诺夫片段填充XhoⅠ位点。用PvuⅡ和KpnⅠ切割牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸区(Pfarr，etal.，DNA，5∶115，1986)，并用T4DNA聚合酶处理使KpnⅠ位点钝化。这个230bp片段与DSP1连接，构建成DSP1BGH。
用SmaⅠ和SalⅠ切割DSP1BGH，并用由SalⅠ末端、BglⅡ位点和SmaⅠ末端构成的合成衔接物将galK盒(由SV40早启动子、galK编码区和BGHpoylA区构成)连接到SalⅠ位点的pUC19(Yanisch-Perron，etal.，Gene，33∶103，1985)。这三部分的连接形成质粒DSPIBZBGH.JT。
用StuⅠ和BclⅠ从而失去galK编码区的DSP1BZBGH.JT被连接到含有质粒pT4B中CD-4cDNA1.7kbEcoR1(填充的)-BamHⅠ片段(Maddon，etal.，m42∶93，1985)，以构建质粒JRY4。
质粒pUCsT4的构建采用人工合成衔接物，将质粒pTb中CD-4cDNA的HaeⅡ和HpaⅡ片段(1125bp)连接到用KpnⅠ和XbaⅠ切割的载体pUC18，以构建质粒pUCsT4。用含KpnⅠ末端和HaeⅡ的人工合成衔接物将CD-4cDNA的HaeⅡ末端连接到pUC18的KpnⅠ位点。用含HpaⅡ末端和XbaⅠ末端的人工合成衔接物将CD-4cDNA的HpaⅡ末端连接到pUC18的XbaⅠ位点。该衔接物还插入到CD-4编码区的核苷酸1257之后的TAA终止密码子。得到的质粒是pUCsT4。
pST4sal的构建为了构建质粒pST4sal，用BglⅡSacⅠ切割质粒JRT4，分离得到959bp片段(由SV40早期启动区和CD-4cDNA的前602个核苷酸组成)。用SacⅠ和XbaⅠ切割质粒pUCsT4质粒，分离得到660bp片段(由人工合成衔接物中TAA密码子后的核苷酸603-1257中的CD-4cDNA组成)。将这两个片段连接到用BglⅡ和XbaⅠ切割失去SV40早期启动区和CD-4完整编码区的DSP1BZBGH.JT。得到质粒pST4sal。
pST4DHFR的构建为了构建质粒pST4DHFRM，将含有β珠蛋白DHFR表达盒1的Bg1Ⅱ-BamHⅠ片段连接到pST4sal的BamHl位点。组成β珠蛋白DHFR表达盒的有老鼠β珠蛋白启动区(质粒pPK288(Berg，etal.，Mol.Cell.Biol，3∶1246，1983)中的550bpHincⅡ片段)，在其5′端用人工合成衔接物修饰后，含有BglⅡ位点;老鼠DHFR编码区(质粒pSV2-DHFR中的735bpHindⅢ(填充的)片段(Subramani，etal.，Mol.CellBiol.，1∶854，1981);DSP1中的NheⅠ(填充的)-BamHI(填充的)SV40polyA早期区(Pfarr，etal.，DNA，4∶461，1985));以及老鼠DHFR终止区(907bpHindⅢ(填充在质粒mDH9(Frayne，etal.，MolCellBiol.，4∶2921，1984)，在其3′端用人工合成的衔接物修饰以构建BamHI位点。
psT4BBV1DHFR的构建为了构建质粒psT4BBV1DHFR，用EcoRⅠ和XbaⅠ切割质粒pST4DHFR，失去含sCD-4编码区的较小片段。用XbaⅠ和BbvⅠ切割质粒sT4sal，分离得到含有可溶CD-4负型前导区的序列的1120bp编码片段。用含有EcoRⅠ末端、KpnⅠ位点和BbvⅠ末端的人工合成衔接物，将该片段与EcoRⅠ/XbaⅠ-切割pST4DHFR连接。该片段可与伸出在上述分离得到的sCD-4片段上的BbvⅠ相竞争。得到的质粒即为pST4BBVIDHFR。
OMPAST4的构建为了构建质粒OMPAST4，用NcoⅠ和SalⅠ消化质粒OMPA.GS，失去含衔接物区的较小片段。OMPA.GS是pAS1的衍生物(Rosenberg，etal.，Meth，Enzymol.，101∶123，1983;美国专利US-4578355)，该pASl具有插入在cⅡ核糖体结合序列3′端的NdeⅠ位点中的合成序列，该合成序列包括在多衔接物序列后面的OMPA前导体。合成序列大致如下5′-TATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCGGCTCTAGAGTCGACCTAGTTAACTAG-3′用NcoⅠ和SalⅠ切割质粒pUCsT4，分离得到含有sCD-4序列(CD-4核苷酸124-1257)的1149bp片段。将该片段与NcoⅠ/SalⅠ切割OMPA.GS连接，构建OMPAST4。
OMPAST4BbVI的构建为了构建质粒OMPAST4BbVI，用NaeⅠ和XbaⅠ切割质粒OMPAST4，失去由该切割得到的含有sCD-4编码区的较小片段。用KpnⅠ切割质粒ST4BBVIDHFR，用T4DNA聚合酶使3′突出末端钝化。然后再用XbaⅠ切割末端钝化的DNA，分离得到含有CD-4cDNA的核苷酸145-1257的1124bp片段。将分离得到的片段与NaeⅠ/XbaⅠ切割OMPAST4质粒连接，构建质粒OMPAST4BbvI。
pucST44184的构建为了构建质粒pucST4184，将CD-4cDNA(编码氨基酸(-25)至(+176)的682bp片段)中的EcoRⅠ-NheⅠ片段与NheⅠ位点上的人工合成衔接物sk727/725(NheⅠ和AvaⅠ两个末端)连接。sk727/725用于CD-4氨基酸177-183)编码。将sk727/725的AvaⅠ末端与pucST4的AvaⅠ-XbaⅠ片段连接(包括人体cDNA的1198-1257bp和在TAA终止密码子后面的CD-4受体的编码氨基酸351-369)。将由EcoRⅠ端和XbaⅠ端为两侧的该序列插入到在pUC19多衔接物(sk727/725)的EcoRⅠ和XbaⅠ两端上的pUC19中。sk727/725序列大致如下5′ctagctttccagaaggcc3′3′gaaaggtcttccggagcc5′
pucST4106的构建为了构建质粒pucST4106，将CD-4cDNA的EcoRⅠ-AvaⅡ片段(包括1-413bp和编码氨基酸(-)25至87)连接到AvaⅡ位点上的人工合成衔接物sk791/792(AvaⅡ-AvaⅠ末端)。sk791-792为CD-4氨基酸88-104编码。将sk791/792的AvaⅠ末端与pucST4的AvaⅠ-XbaⅠ片段连接(包括人体cDNA的1198-1257bp和在TAA终止密码子后面的CD-4受体的编码氨基酸351-369)。将以EcoRⅠ和XbaⅠ末端为两侧的该序列插入到在pUC19多衔接物的EcoRⅠ和XbaⅠ末端上的pUC19中。sk791/792序列基本如下5′gaccagaaggaggaggtgcaattgctagtgttcggattgactgccaacgtcttcctcctccacgttaacgatcacaagcctaactgacggttgagc5′sT4184.DHFR的构建为了构建质粒sT4184.DHFR，将pucST4184的EcoRⅠ-XbaⅠ片段(编码融合到351至369的氨基酸-25至183)连接到psT4.DHFR的EcoRⅠ末端和XbaⅠ末端，以取代编码SKBsCD-4的EcoRⅠ-XbaⅠ片段。
sT4106.DHFR的构建为了构建质粒sT4106.DHFR，将pucST4106的EcoRⅠ-XbaⅠ片段(编码融合到351至369的氨基酸-25至104)连接到psT4.DHFR的EcoRⅠ和XbaⅠ两端，以取代编码SKBsCD-4的EcoRⅠ-XbaⅠ片段。
OMPAV1的构建为了构建OMPAV1，用AflⅡ和XbaⅠ切割质粒OMPAST4BbvⅠ，失去含CD-4cDNA编码区的核苷酸371-1257的较小片段。用AflⅡ和XbaⅠ切割质粒pst4106DHFR，分离得到含CD-4cDNA序列的核苷酸371-459，1198-1257的160bp片段。将这两个片段连接构建成质粒OMPAV1。
OMPAV1V2的构建为了构建OMPAV1V2，用SacⅠ和XbaⅠ切割质粒OMPAST4BbvⅠ，失去含CD-4cDNA序列的核苷酸603-1257的较小片段。用SacⅠ和XbaⅠ切割质粒ST4184.DHFR，分离得到含CD-4cDNA序列的核苷酸603-696，1198-1257的164bp片段。两个片段互相连接构建成质粒OMPAV1V2。
实施例2sCD-4蛋白质在大肠杆菌中的表达采用常规操作，将OMPAV1和OMPAV1V2结构转化为缺陷型大肠杆菌入溶源性细菌AR58(cI857)和AR120。按下述方法进行热诱导(Rosenberg，etal.，Meth，Enzymol.，101∶123，1983)或萘啶酮酸诱导(Mott，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82∶88，1985)。
热诱导(处理细胞系AR58)从含有OMPAST4Bbv1、OMPAV1或OMPAV1V2质粒的10ml过夜AR58细胞培养物中取出7ml接种到200mlLB(含有50μg/ml氨苄青霉素)，在32℃的摇动保温箱中培养。在0.8吸收单位的650nm(O.D.650)光密度时，将加温至55℃的200mlLB加到培养物中，并将烧瓶移至42℃摇动保温箱。在温度移动后30、60和90分钟，各取1ml培养物样品进行分析。在90分钟时，将细胞置于冰水中冷却15分钟，用J-6贝克曼离心机(BeckmanInstruments，Fullerton，California)，3500rpm，4℃，15分钟，将细胞离心成碎片。在-20℃下，将细胞碎片冷藏至处理。在-20℃下，将条件培养基冷藏至处理。
萘啶酮酸诱导(处理细胞系AR120)从20ml含有OMPAST4Bbv1、OMPAV1V2质粒的过夜AR120细胞培养物中取13ml接种到400mlLB(含50μg/ml氨苄青霉素)，在37℃的摇动保温箱中培养。在0.4吸收单位的O.D.650时，将400ml萘啶酮酸(50mg/ml)加到培养物中。培养物在摇动保温箱中保持37℃，加入萘啶酮酸后1，3，5小时，各取1ml样品。在5小时时，将细胞置于冰水中冷却15分钟，用J-6贝克曼离心机，3500rpm，15分钟，4℃，离心成碎片。在-20℃下，将细胞碎片冷藏至处理。
接着进行诱导。取1ml样品的细胞碎片，用Western印迹法和对细菌中产生的变性可溶性T4的免子多克隆抗体，分析完整的突变体sT4蛋白(SKBsCD-4，VIJ4和V1V2J4)的表达。在经过热诱导和萘啶酮酸诱导的样品的细胞溶解产物中检测出适宜大小的蛋白。检测的量为总蛋白的1-5%。
条件培养基处理将冰冻条件培养基升温至室温，取出30ml等份液，置于贝克曼SW28(摇摆吊斗式转子)离心机中离心1小时，4℃，24000rpm，离心后再在4℃下，用压膜过滤沉淀和浓缩10-20倍。
采用Wertern印迹分析法(同上)、ELISA竞争和免疫沉淀，测定浓缩培养基中完整的SKBsCD-4，VIJ4或V1V2J4蛋白。
采用Wertern印迹法对每个样品检测在浓缩条件下培养基中适宜大小的蛋白，检测到细胞内蛋白的量为1-5%(0.1-0.5ng/ml未浓缩条件培养基)。用ELISA竞争测定法，测出三种蛋白都与OKT4A结合。VIJ4和V1V2J4蛋白再用一组对CD-4的多克隆抗体作进一步免疫沉淀测定(Ortho，Rartian，NewJersey).由OMPAV1和V1JH4表达的蛋白由OKT4B，OKT4C，OKT4E或OKT4F引起免疫沉淀。由OMPAV1V2和V1V2J4表达的蛋白，除OKT4外全部由OKT4单克隆抗体产生免疫沉淀。另外，该蛋白对OKT4C的亲和性低于对其他多克隆抗体。
细胞碎片的处理将经过90分钟OMPAST4Bbv1/AR58热诱导的细胞碎片置于冰上解冻，再悬浮在4℃的缓冲溶液中(100mM Tris-HCl，pH8，0.5mMEDTA，0.5M蔗糖)碎片与缓冲液的比为100 O.D.650/ml。将溶菌酶(10mg/ml于0.05M Tris-HCl，pH8)加到最终浓度为0.2mg/ml，悬浮液在冰上保温15分钟。加入等体积冰水，悬浮液在冰上再保温15分钟。将PMSF(50mM)加至最终浓度为1mM，接着将MgCl2(1M)加至最终浓度为2mM。细胞悬浮液3次通过一个18计量针，将粘度降低，然后在20000×g和4℃下离心10分钟。
离心后，将碎片再悬浮在20mMTris-HCl，pH8，5mMEDTA，5mMBME，其体积与离心前相等。悬浮液经超声处理60秒(其间10秒破碎，间隔30秒进行冷却)，然后在20000×g和4℃离心15分钟。得到的碎片和上清液经Western印迹法分析证明，70%的SKBsCD-4蛋白是在上清液部分。再将上清液在100000×g下离心60分钟，得到的碎片和上清液经Western印迹分析证明，5%以上的SKBsCD-4蛋白仍留在溶液中。上清液部分用等体积40mMMES(pH6.0)洗脱后，装载在1mlSSepharose(Pharmacia，Piscataway，NewJersey)柱上，用20mMMES(pH6.0)平衡。用10ml的20mMMES(pH6.0)洗涤层析柱。结合的SKBsCD-4用20nMMES，pH6.0，0.5MNaCl洗脱，按每份1ml进行收集。将流通、洗涤和洗脱的部分经Western印迹分析证明，5%以上的SKBsCD-4与层析柱结合，洗脱得到馏分2和3。
将流通、洗涤和洗脱的馏分，用ELISA竞争测定功能性SKBsCD-4。流通和洗脱馏分2都含有与OKT4A结合的SKBsCD-4。
免疫沉淀浓缩培养基(100μl)用等体积沉淀缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.5，100mMNaCl，0.1%NP-40，0.5%脱脂奶粉)稀释，再用3μg免子IgG在4℃下澄清15分钟，然后加30μl(包装体积)蛋白A-Sepharose小珠(Phar-macia，Piseataway，NewJersey)，在4℃下保持30分钟。经过澄清的上清液，用5μgOKT4，4A，4B，4C，4D，4E，4F，OKT8单克隆抗体(OrthoPharmaceuticals)，老鼠IgG(CooperBiomedical，Malvern，Pennsylvania)或免子抗老鼠IgG(CooperBiomedical)在4℃下保温30分钟。OKT4，4A，4C，OKT8，老鼠IgG和免子抗老鼠IgG在4℃保温条件下，用20μl(包装体积)蛋白A-Sepharose小珠沉淀30分钟。OKT4B，4D，4E和4F在4℃下，用10μg免子抗老鼠IgG保温30分钟，然后加入蛋白A-Sepharose小珠。沉淀后，小珠用200μl沉淀缓冲液洗涤2次，再用不含NP-40和脱脂奶粉的200μl沉淀缓冲液洗涤1次。经过洗涤的小珠在20μl沉淀缓冲液洗涤1次。经过洗涤的小珠在20μl样品缓冲液(125mMTris-HCl，pH6.8，20%丙三醇，1.4MβME(β-巯基乙醇)中煮沸5分钟。煮沸后，上清液在12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并按上述步骤用Western印迹法进行分析。
V1J4和V1V2J4蛋白由OKT4A产生免疫沉淀。由OMPAV1表达的蛋白是由OKT4A和OKT4D而不是由OKT4，OKT4B，OKT4C，OKT4E或OKT4F产生免疫沉淀。由OMPAV1V2表达的蛋白，除了OKT4外的所有OKT4单克隆抗体产生沉淀。另外，该蛋白对OKT4C的亲和性低于对其他单克隆抗体。
ELISA竞争在微量滴定板(Flow Laboratories，Mclean，Virgina)中每孔涂上100μl含有150ng纯sCD-4的0.1M NaHCO3/Na2CO3(pH9.4)，在室温下过夜。
等份(2.5-80μl)浓缩培养基或细胞提取液在有1mg/ml牛血清清蛋白(BSA)存在下，加入5ngOKT4A，最终体积为100μl，在室温下过夜。少于100μl的样品用磷酸缓冲盐水(PBS)稀释到100μl。保温后，滴定板倒出，用PBS冲洗3次，适当干燥。每孔加入380μlPBS/0.5%明胶。滴定板在37℃下保温1小时。
在37℃下保温后，将滴定板倒出，用PBS冲洗3次，适当干燥。将含有单克隆抗体的100μl保温样品加到滴定板的每个孔上，在37℃下保温5小时。
保温后，将滴定板倒出，用PBS冲洗3次，适当干燥。在每个孔中加入含有生物素的马/抗老鼠IgG的溶液100μl。将一滴马/抗老鼠IgG(VectorLabs，Burlingame，California)加到含1%马血清的10mlPBS中，配制成该抗体制剂。滴定板在37℃下保温30分钟。
保温后，将滴定板倒出，用PBBS冲洗5次，适当干燥。在每个孔中加入100μlABC复合物(VectorLabs，Burlingame，California)，然后将滴定板在室温下保温30分钟。
再将滴定板倒出，用PBS冲洗5次，适当干燥。每个孔中再加100μl磷酸硝基苯酯混合物(2mg/ml磷酸硝基苯酯(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)于0.1M碳酸氢钠，pH9.4，10mM MgCl2中)。滴定板在37℃和黑暗条件下保温30分钟。保温后，在405nm吸收值处读数。用已知培养基含OKT4A抗体的纯sCD-4量所得标准曲线测定sCD-4浓度。在ELISA竞争中，发现两个蛋白(V1J4和V1V2J4)都与OKT4A单克隆抗体结合。
实施例3酵母表达载体的构建用于构建表达sCD-4蛋白的酵母表达载体的质粒均以碱性高拷贝酵母往复载体pYSK120(Rosenberg，etal.，GeneticEngineesing，8∶151，1986)为基础。所有这类质粒都含有能提供可选择标记基因的酵母TRP1基因(TsumperandCarbon，Gene，10∶157，1980)的823bpEcoRⅠ-PstⅠ片段;能提供在酵母中复制来源的2微米环状酵母的2.0KbEcoRⅠ-PstⅠ片段(HartleyandDonaldson，Nature，286∶860，1980);能提供在插入在pBR322的HindⅢ和BanHⅠ位点间的大肠杆菌和酵母启动区-终止区模板中进行复制和选择的pBR322部分(缺失BamHⅠ至PuvⅡ)(inCloningVectors，Pouwels，Enger，Valk，Eds，1985)。启动区是由pYSK12中BamHⅠ-EcoRⅠ片段衍生的CUP1的431bpBamHⅠ-RsaⅠ片段(Butt，etal.，Proc.NatlAcadSci.USA，81∶3332，1984;Rosenberg，etal.GeneticEngineering，8∶151，1986);Gorman，etal.;Gene，48∶13，1986)或由质粒pYSK18中BamHⅠ-EcoRⅠ片段(Rosenberg，etal.，同上Gorman，etal.，同上)衍生的1.1kbTDH3启动序列(Holland，etal.，J.Biol.Chem.，255∶2596，1980)。终止区CYC1基因中361bpKpnⅠ-HindⅢ片段(Smith，etal.，Cell，16∶753，1979)。如下所述的各种合成序列都可插入到启动区和CYC1片段之间区段中。
pYSK147和pKYS148的构建质粒pYSK137(CUPI启动区)和pYSK138(TDH3启动区)在启动区序列3′端的EcoRⅠ位点和终止区序列5′端的KpnⅠ位点之间含有一个合成寡核苷酸序列。这个合成序列在三个读码的转译终止密码子的上游含有单一限制位点XhoⅠ，NcoⅠ和SalⅠ。合成衔接物具有下列序列GAATTCTCGAGCCATGGCCAGTCGACGTAGTTAAGTAGGTACC将含有sCD-4序列的碱基124-1257的质粒pUCsT4的NcoⅠ-SalⅠ片段插入到NcoⅠ-KpnⅠ切割pYSK137或pYSK138，分别得到pYSK147和pYSK148。
pYSK154和pYSK155的构建ubiquitin融合基因表达载体在启动区和CYC1终止区之间，含有一个适宜于合成酵母ubiquitin基因的盒(Ecker，etal.，J.Biol.Chem.，262∶3524，1987)。ubiquitin序列与Ecker等人发表的相同。除此之外，末端AflⅡ-KpnⅠ片段被含有3′端上的NcoⅠ限制位点的寡核苷酸序列取代。含有所需sCD-4序列的pYSK147的NcoⅠ-KpnⅠ片段插在这个NcoⅠ位点和CYC1片段5′端的KpnⅠ位点之间，得到pYSK154。在pYSK154中缺失sCD-4序列的前7个氨基末端氨基酸序列(前导肽序列)的pYSK154衍生物的构建，是先用KpnⅠ切割pYSK154，再用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(polIK)的克列诺夫片段填充并插入由经polIK处理的psT4BBV1DHFR至填入的粘性末端的KpnⅠ-XbaⅠsCD序列(sCD-4的碱基145-1257)。该质粒称为pYSK155。
pYSK159和pYSK161的构建含有切去末端的sCD-4序列(碱基124-603)的载体的构建是在sCD-4序列的SacⅠ位点(碱基602)插入含终止密码子的人工合成寡核苷酸序列。合成衔接物(2×链)具有下列序列CTAAGCGGCTCGAGATTCGCCGGC将这个合成序列插入到SacⅠ和NarⅠ切割pYSK148和pSYK154，分别得到pYSK159和pysk161。因此，pYSK159中的CD-4DNA具有用于氨基酸-9(丙氨酸)至151(亮氨酸)(YV1)。
实施例4sT4在酵母培养物中的表达采用常规技术(Shermanetal.，MethodsinYeastGenetics，ColdSpringHarbor，1986)选择色氨酸原养型，将质粒DNA(2-10μg/ml)用于转化酵母(啤酒酵母)。所用菌株是F762(Mata，trp/△/，ura3-52)或PEC1-8B(Mata，proA△∶∶URA3，ura3-52，trp1-289，his3)。将所选择的转化株培养物置于含有添加物的(2%葡萄糖，20μg/ml尿嘧啶，20μg/ml组氨酸)酵母氮碱(YNB，Difco，Detriot，Michigan)中培养。为使质粒利用CUP1启动区，加入100μM硫酸铜。在对数后阶段，离心收集、洗涤和破碎培养物。采用常规蛋白质免疫印迹测定方法，分析细胞溶解产物中的sCD-4。
在含有pYSK147和pYSK148的啤酒酵母中，sCD-4蛋白SKBysCD-4(氨基酸-9至369)在低水平上表达(大约少于0.5ng/l)。发现其活性与其颗粒部分有关，但用非离子洗涤剂提取时很容易溶解。在含有pYSK154的啤酒酵母培养物中，SKBYsCD-4(氨基酸-9至369)的量介于2-6mg/1(2×10细胞/ml)之间。这大约比没有稳定的ubiquitin序列存在下用pYSK147和pYSK148表达的CD-4蛋白的量提高了5倍。在任何情况下，合成sCD-4蛋白的估计大小都是相同的，这说明蛋白质的ubiquitin部分已从SKBsCD-4中切去。用对酵母ubiquitin的抗体和免疫印迹方法已证实了这一点。
在pYSK159和pYSK161中截去末端的sCD-4蛋白(YV1)的表达水平与表达为ubiquitin融合的sCD-4表达水平相似。所检测到的sCD-4的量与所检查的各个宿主菌株的量相似。
含有pYSK154的菌株F762中的SKBsCD-4经通过S-Sepharose层析柱进行部分纯化。在10mMTris缓冲液，pH6.0，1%Tween-20中制备得到的提取液粗品，在30000×g下离心。将上清液调至pH4.0，用于经50mM乙酸缓冲液平衡的S-Sepharose层析柱。样品用含有0.5MNaCl的50mM的MES[(2-(N-吗啉代)-乙烷磺酸)，pH6.0]缓冲液分批洗脱。免疫印迹测定证实了在洗脱液中存在着SKBYsCD-4。通过以ELISA竞争为基础的测定，测得该物质具谢钚浴＠肅HO细胞中的纯SKBsCD-4和OKT4A抗体，确认酵母衍生的SKBsCD-4的构型与哺乳动物细胞(CHO)衍生的物质的构型极为相似。
实施例5链霉菌载体的构建采用重组DNA操作，将人体CD-4cDAN序列与长孢链霉菌胰蛋白酶抑制剂(LTI)基因和兰色链霉菌β-半乳糖苷酶(βgal)基因的信号序列融合。将Scd-4小基因与链霉菌质粒(pIJ702(Katz，etal.，同上)和pIJ351(Kieser，etal.，同上)结合，构建质粒pLTI∶sT4/1，pLTI∶sT4/7，pLTI∶V1V2和pBgal∶sT4/7。载体构建如下。
pLTI∶sT4/1的构建从其他三种质粒(pUCsT4，pIJ351和pLTI450)构建质粒pLTI∶sT4/1。质粒pLTI450的构建如下pLTI450的构建将含有LTI基因的0.92kbSacⅠ-KnpⅠ片段插入到经SacⅠ和KpnⅠ消化过的pUC18。该质粒PLtI520用EagⅠ部分消化并用SalⅠ全部消化过后，与EagⅠ和SalⅠ末端的下列合成衔接物(2×链)连接5′-GGCCGCCGCCCCCGCGCGGCGGGGGCGCAGCT-5′
对由此连接得到的质粒进行筛选，用于将合成衔接物插入到位于SacⅠ位点约0.5kb处的EagⅠ位点。这个EagⅠ位点在相对于LTI基因5′端的86bp处。所得质粒含有信号肽和信号肽切割位点的LTI启动区和编码序列。EagⅠ和SalⅠ位点都可用于sCD-4小基因与LTI信号序列的融合。
pLTI∶sT4/1的构建为了构建质粒pLTI∶sT4/1，在pUCsT4中的大约1.1kbBbvⅠ-PstⅠ片段上分离得到sCD-4编码序列。这个片段含有人体CD-4cDNA序列的149-1257bp。质粒pUCsT4经BbvⅠ消化并用逆转录酶处理后填充到突出的5′端。然后用PstⅠ消化DNA。这个编码SKBsCD-4的1.1kbBbvⅠ(RT)-PstⅠ片段与pLTI450连接，用SalⅠ和逆转录酶处理，继而经PstⅠ消化。这个连接得到质粒pLTI450sT4/1。构建pLTI∶sT4/1的最终步骤要求将链霉菌复制功能插入到pLTI450sT4/1上。同时用PstⅠ消化pIJ351(Kieser，etal.，同上)，并将其与经PstⅠ消化过的pLTI450sT4/l连接。
pLTI∶sT4/7的构建由其他三个质粒(pUCsT4，pIJ702，pLTI450)构建质粒pLTI∶sT4/7。为了构建质粒pLTI∶sT4/7，在pUCsT4中大约1.1kbNcoⅠ-PstⅠ片段上分离得到sCD-4编码序列。这个片段含有人体CD-4cDNA序列的124-1257bp。如实施例1所述，这些bp位于ATG起始密码子和TAA终止密码子之间。起始密码子可以补充一部分NcoⅠ识别序列。在这个片段上所含的sCD-4编码序列含有CD-4前导序列中的9个氨基酸。pUCsT4经NcoⅠ和逆转录酶处理后用PstⅠ消化。将这个片段与经过HindⅡ和PstⅠ处理过的pLTI450连接。这个连接得到质粒pLTI450sT4/7。链霉菌复制子由质粒pIJ702(Katz，etal.，同上)提供。通过2个质粒上的单一PstⅠ位点，将其插入pLTI450sT4/7，从而构建得到质粒pLTI∶sT4/7。
质粒pLTI∶V1V2的构建由质粒psT4.184，pLTI450和pIJ351构建质粒pLTI∶V1V2。从psT4.184分离得到0.54kbXbaⅠ-EcoRⅠ片段。这个片段用BbvⅠ和逆转录酶处理。BbvⅠ末端相当于人体CD-4cDNA序列的149bp。然后将这个钝端片段与经SalⅠ和逆转录酶处理过的pLTI450连接，构建得到质粒pLTI450V1V2。链霉菌复制功能由pIJ351提供。这个质粒通过pIJ351和pLTI450V1V2两个质粒子上的单一PstⅠ位点克隆到pLTI450V1V2得到的就是质粒pLTI∶V1V2。
pβgalsT4/7的构建由质粒pUCsT4，pIJ702和p3SSXMCP构建质粒pBgalsT4/7。p3SSXMCP是含有β-半乳糖苷酶启动区和信号序列的pUC9(VieisaandMessin，Gene，19∶259，1982)衍生物。位于信号肽切割位点编码序列下游的26bp是一个XmnⅠ位点(Eckhart，etal.，J.Bacteriol.，169∶4249，1987)。插入到这个位点的是含有BamHⅠ识别序列的合成衔接物(NewEnglandBiolabs，Beverly，Massachusetts)，得到质粒p3SS×10。这个载体用BamHⅠ和逆转录酶处理，继而用XhoⅠ消化。与这个载体连接的是1个具有由逆转录酶处理过的NcoⅠ末端的片段，得到一个钝端和一个SalⅠ末端，填充到BamHⅠ位点与填充到NcoⅠ位点的连接，重又给出了BamHⅠ和NcoⅠ两个位点。得到的质粒是p3ssXMCP。pUCsT4用XbaⅠ和逆转录酶处理，继而用NcoⅠ消化。然后将这个1.1kbNcoⅠ-XbaⅠ(RI)片段插入到已经用SacⅠ和T4DNA聚合酶Ⅰ处理并进行NcoⅠ消化的p3SSXMCP。链霉菌复制功能能由通过两个质粒上的单一BglⅡ位点插入到p3SSXsT4的pIJ702提供。得到的质粒就是pβgal/sT4/7。
实施例6sCD-4小基因在链霉菌中的表达将质粒pLTI∶sT4/1，pLTI∶sT4/7，pLTI∶V1V2和pβgal∶sT4/7转化到兰色链霉菌1326中(Bibb，etal.，同上)。另外，将pLTI∶sT4/1，pLTI∶sT4/7，pLTI∶V1V2引入天兰色链霉菌M124(Hopwood，etal.，GeneticManipulationofStreptomyces-1LabortoryManual，F.Crowe&Sons，Ltd.，Norwich，England，1985)、白色链霉菌J1074(ChaterandWilde，J.Dene.Micsobiol.，116∶323，1980)和长胞链霉菌白色衍生物(ATCC保藏号23931)。所有质粒都用Thompson等人介绍的方法(J.Bacteriol.，151∶668，1982)引入各种宿主。将3ml含有100μg/ml硫链丝菌肽的0.4%琼脂涂在转化板上选择转化株。
将抗硫链丝菌肽转化株置于10ml胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汁加5μg/ml硫链丝菌肽中繁殖48-72小时，此片鉴定表达CD-4小基因的克隆。培养物上清液和细胞溶解产物在12%聚丙烯酰胺(30∶0.8，丙烯酰胺∶bis)-1%十二烷基硫酸钠凝胶进行分离后转移到硝化纤维中(Towbin，etal.，ProcNatlAcadSciUSA，76∶4350，1979)。按Deen等人(文献同上)所述方法，用免子sCD-4-抗血清探测硝化纤维过滤物。
pLTI∶sT4/1，pLTI∶sT4/7和pBgal∶sT4兰色链霉菌转化株表达约为45KD的蛋白，这是由这些质粒编码的sCD-4蛋白的预定大小。与此类似的是pLTI∶V1V2兰色链霉菌转化株表达大约20KD的蛋白，这是对V1V2蛋白的预定大小。在天兰色链霉菌、白色链霉菌和长孢链霉菌中也检查了SKBsCD-4和V1V2J4的表达。如兰色链霉菌一样，45KD(pLTI∶sT4/1和pLTI∶sT4/7转化株)和20KD(pLTI∶V1V2转化株)的蛋白也可由其他种链霉菌表达。
对兰色链霉菌培养物上清液和细胞溶解产物中SKBsCD-4的定量测定证明其表达量为1-5mg/l。V1V2J4在培养物上清液和细胞溶解产物的表达量为2-10mg/l。pβgal∶sT4兰色链霉菌转化株的表达量低于1mg/l。
还用pLTI∶sT4/7兰色链霉菌细胞系，在12升发酵罐中测定SKBsCD-4的表达。类似于小规模表达研究一样，将细胞培养在胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汁加5μg/ml硫链丝菌肽中。保温后7.5，24，31.5，54和72小时，分析培养物上清液和细胞溶解产物中SKBsCD-4的表达。最大容积表达量为60mg/l，而且发生在保温后24小时。SKBsCD-4均匀分布在培养物上清液和完整细胞之间。
含有V1V2J4和SKBsCD-4的经过部分纯化的上清液用ELISA竞争证明都与OKT4A结合，说明这些由链霉菌衍生的蛋白都是HIV结合蛋白。
将HIV结合蛋白V1J4与LTI启动区作类似的连接。并用Western测定法证明其在兰色链霉菌中的表达。
上述实施例说明，HIV结合蛋白是由CD-4衍生的，例如SKBsCD-4，SKBYsCD-4，V1J4，V1V2J4和YV1都是具有与sCD-4结合功能的HIV结合蛋白，它们可通过本发明的重组有机体予以表达和分泌。更具体地说，它们具有SKBsCD-4V1区的HIV结合结构区。
以上说明书和实施例充分公开了本发明，包括其最佳实施例。对本文中公开的实施例所作出的改进和提高均属下列权利要求中要求保护的范围。
权利要求
1.制备HIV结合蛋白的方法，该方法包括培养由载体转化的大肠杆菌细胞和从中收集HIV结合蛋白，所述载体含有HIV结合蛋白的编码序列，通过操作与调节单位相连接。
2.制备HIV结合蛋白的方法，该方法包括培养由载体转化的链霉菌细胞和从中收集HIV结合蛋白，所述载体含有HIV结合蛋白的编码序列，通过操作与调节单位相连接。
3.制备HIV结合蛋白的方法，该方法包括培养由载体转化的酵母细胞和从中收集HIV结合蛋白，所述载体含有HIV结合蛋白的编码序列，通过操作与调节单位相连接。
全文摘要
由CD-4受体蛋白衍生的HIV结合蛋白在重组宿主细胞中的表达。
文档编号C12N1/16GK1037537SQ8910092
公开日1989年11月29日 申请日期1989年2月24日 优先权日1988年2月24日
发明者詹姆斯·阿托斯, 玛丽·埃伦·布劳纳, 菲利普·厄尼斯特·克拉克, 基思·查尔斯·迪安, 詹姆斯·艾伦·福恩沃尔德, 杰西卡·安吉尔·戈曼, 甘内什·马胡苏丹·沙菲, 雷蒙·惠特尼·斯威特, 迪安·佩龙·泰勒 申请人:史密丝克莱恩贝克曼公司