专利名称：用于检测人免疫缺陷病毒-1型的引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和核酸化学领域。特别涉及检测人类免疫缺陷性病毒1型(HIV-1)的方法和试剂，因此本发明可用于一般医学领域，特别是医学诊断学领域和分子生物学领域。
扩增核酸特定序列方法的发明，即聚合酶链反应(PCR)，为快速检测样品中存在的过去曾认为是不可检测的微量核酸提供了可能(见美国专利4,683,195、4,683,202、4,965,188)。PCR技术的发展和应用在文献中有详细报道，例如关于PCR相关课题范围的资料可见于“PCR技术-DNA扩增原理和应用”，1989，(HA.Erlich编)Stockton Press，New York，NY；“PCR手册方法和应用指南”，1990，(M.A.Innis等编)Academic Press，San Diego，CA；以及PCR技术，1995，(M.A.Innis等编)Academic Press，San Diego，CA。由销售商，例如Perkin Elmer(Norwalk，CT)，出售PCR试剂并出版PCR技术手册。
应用PCR和探针杂交技术扩增并检测HIV-1核酸的报道见于Kwok，1992，医学年鉴(Ann.Med.)24211-214；及Coutlee等，1991，分子细胞学探针(Mo1.cell.Probes)5241-259。以PCR技术为基础的HIV-1检测鉴定方法见于美国专利号5,008,182.和5,176,775；Kellogg and Kwok，1990，PCR手册-方法和应用指南(Innis等编)，Academic Press，San Diego，CA337-347，Holodniy，1991，传染病杂志(J.Inf.Dis.)163802-865；Jackson，1991，艾滋病51463-1467；Mulder，1994，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)32(2)292-300。
用于扩增和检测HIV-1的商品试剂盒可以从Hoffmann-LaRoche(Nutley，NJ)购得，AmplicorTMHIV-1实验是检测HIV-1原病毒DNA的体外实验方法，AMPLICOR HIV-1 MONITORTM实验是HIV-1 RNA定量的体外实验方法。两种Amplicor实验都使用SK462(SEQ ID NO5)和SK4321(SEQ ID NO6)引物扩增HIV-1核酸，在Mulder等，1994，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol)，32(2)292-300中有叙述，本文特称为Amplicor HIV-1引物。
HIV-1具有相当的基因组序列多变性。对HIV-lgag及eiv基因核酸序列的多基因分析见Myers等，1993，人类反转录病毒和艾滋病1993，Los AlamosNational Laboratory，Los Alamos，NM.已明确M族存在A-J亚型。
现有技术中的分子生物和核酸生化的传统技术，可见有关文献的解释，例如，Sambook 1989，分子克隆-实验手册，(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)Cold Spring Harbor，New York；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait，1984)；核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.Hames andS.J.Higgins.编，1984)；以及丛书，酶学方法(Academic Press，Inc.).
已鉴定明确了许多HIV-1 M族分离物(毒株)应用上述gag基因扩增引物，特别是Amplicor HIV-1引物SK462(SEQ ID NO5)及SK431(SEQ IDNO6)，是不可扩增或者是不可有效扩增的。这些毒株以前在AmplicorHIV-1引物结合区中未见序列变化。
本发明的目的之一是提供改进的一些引物，能有效扩增这些新发现毒株以及应用这些Amplicor HIV-1引物扩增所有的毒株。而且本发明的引物能以近似相同的效率扩增所有已知的HIV-1型M族毒株。
本发明涉及改进的寡核苷酸引物，该引物能使HIV-1型M族A-G亚型的gag基因片段的PCR扩增具近似相同效率而不出现非目的片段的伴随扩增。
本发明特别涉及用于扩增人类免疫缺陷性病毒1型(HIV-1)核酸的寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物选自SKCC1(SEQ ID NO3)及SKCC3(SEQ IDNO4)。
优选SK145(SEQ ID NO1)和SKCC1(SEQ ID NO3)组成的或SK145(SEQ ID NO1)和SKCC3(SEQ ID NO4)组成的寡核苷酸引物对。
在另一实施方案中这些成对引物可以与引物SK145M2(SEQ ID NO2)组合形成一组由SK145(SEQ ID NO1)、SKCC1(SEQ ID NO3)及SK145M2(SEQ ID NO2)组成的或一组由SK145(SEQ ID NO1)、SKCC3(SEQ ID NO4)、SK145M2(SEQ ID NO2)组成的寡核苷酸引物。
本发明还涉及扩增来自HIV-1型M族亚型gag基因区域的改进方法，包括应用本发明的引物进行PCR扩增。
本发明还涉及含有本发明扩增引物的试剂盒，这些试剂盒可以包含另外的试剂，例如检测探针或者一个或多种扩增试剂例如聚合酶、缓冲液、三磷酸核苷酸。
为帮助理解本发明，对有关术语定义如下
“核酸”、“寡核苷酸”指的是多聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)及多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)及其它类型的多核苷酸嘌呤或嘧啶碱基的N糖甙或修饰后的嘌呤或嘧啶碱基。“核酸”和“寡核苷酸”这两者名称之间没有长度区别，可以互换使用。这些术语只是指分子的一级结构。因此包括双股、单股DNA以及双股、单股RNA。
寡核苷酸可用适当的方法制备，如克隆并限值适当序列以及直接化学合成，例如应用Narang等的磷酸三酯法，1979，酶学方法(Meth.Enzymol.)6890-96；Brown等的磷酸二酯法，1979，酶学方法(Meth.Enzymol.)68109-151；Beaucage等的二乙基磷酸酰胺法，1981，四面体通讯(TetrahedonLett.)221859-1862；以及美国专利号4,458,066的固相载体法。这些合成方法在Goodchild，1990，生物结合化学(Bioconjugate Chemistry)1(3)165-187中有评论。
“杂交”指的是应用两个单链核酸通过碱基互补配对形成双链结构。杂交可发生于完全互补的核酸链间或存在小错配区的基本互补的核酸链间。只能在完全互补核酸链间发生杂交的条件称为“严格杂交条件”或“序列特异杂交条件”。基本上互补序列的稳定双链可在非严格杂交条件下获得。允许的错配程度可通过适当调节杂交条件控制。核酸领域的技术人员凭经验调节一些变量能够决定双链的稳定性。这些变量包括寡核苷酸的长度和碱基对的浓度、离子强度、以及碱基错配率。根据该领域的指南(Sanbook 1989，分子克隆-实验手册，(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)Cold SpringHarbor，New York；Wetmur，1991，生物化学和分子生物学评论26(3/4)227-259)进行。
“引物”指的是天然或人工合成的寡核苷酸，在诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物条件下，例如在4种不同的三磷酸核苷和聚合试剂(例如DNA聚合酶或反转录酶)及适宜缓冲液和适宜温度下，能作为DNA合成的起始点。引物优选单链寡聚脱氧核糖核苷酸。引物的适宜长度取决于该引物的用途，一般在15-35个核苷酸之间。短的引物分子一般要求较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板的准确序列，但必须与模板充分互补杂交。引物可以为检测或固定而具备一些另外的特征，但不能改变该引物的基本性能即作为DNA合成起始点。例如引物可以在5’端包含另一个核酸序列，它不与靶核酸杂交，但有助于克隆该扩增的产物。引物与模板充分互补杂交的区域在本文中称为杂交区域。
本文所用的“上游”引物指的是以延伸产物为编码链的引物，“下游”引物指延伸产物为互补非编码链亚序列的引物。
“目的序列”、“目的区域”、“目的核酸”指的是用于扩增检测或作其它分析的核酸片段。
按本文所指，如果引物与目的序列之间的错配数少于引物与样品中可能存在的非目的序列间的错配数，则该引物对于目的序列来说就是特异性的。只有当错配数不超过引物与目的序列间的错配数时才能选择形成稳定双链的杂交条件。在该条件下目的特异性引物只与目的序列形成稳定双链。因此在适当的严格扩增条件下应用目的特异性引物能特异性扩增那些含有目的引物结合位点的序列。同样，在适当的严格杂交条件下应用目的特异性探针能检测特异性的目的序列。
“扩增反应混合物”指的是含有进行扩增反应所必须试剂的溶液，一般含有引物、热稳定性DNA聚合酶、脱氧三磷酸核苷(dNTPS)、适宜缓冲液中的二价金属离子。若反应混合物含有全部进行反应所必须的试剂，则为完全的反应混合物，若只含有一部分必要的试剂，则为不完全混合物。熟悉本领域的技术人员都明白，各种反应成份常规上是单独溶液保存，各含有一种成份，以利于方便、稳定储存或应用时可调节各成分的浓度，并在反应之前将各反应物合并以形成完全的反应混合物。而且本领域的技术人员也都知道反应物都是分装出售，适用的商品试剂盒可含有包括本发明引物在内的任何一种反应成分。HIV-1扩增引物本发明的引物能扩增来自HIV-1型M族各亚型的核酸。这些引物显著优于以前所用的引物，能够以近似相同的效率扩增所有M族A-G亚型分离物的gag基因区域的核酸，包括新发现的分离物。这些引物的核苷酸序列如下所示，自左到右按5’到3’方向排列。上游引物SK145(SEQ ID NO1)AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATSK145M2(SEQ ID NO2) AGTGGGGGGGACACCAGGCAGCAATGCAAAT下游引物SKCC1(SEQ ID NO3)TACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCCSKCC3(SEQ ID NO4)TGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTAT本发明的下游引物可与本文中的所有上游引物一起使用，本发明的下游引物优选与上游引物SK145(SEQ ID NO1)一起使用，视情况也可与上游引物SK145M2(SEQ ID NO2)结合。上游引物SK145(SEQ ID NO1)见kellog和Kwok，1990，PCR手册方法和应用指南，1990，(Innis等编)Academic Press，SanDiego，CA337-347。第二个上游引物SK145 M2(SEQ ID NO2)在与SK145(SEQ ID NO1)相同的区域杂交，但能更好的与某些HIV-1A和E亚型分离物的核酸序列相匹配，如实施例中所示，这两种上游引物同时使用能平衡特定亚型扩增的效率。扩增在能扩增全部HIV-1型M族各亚型的条件下进行扩增，但该条件必须足够严格以避免非目的序列的扩增。优选的扩增反应条件详见Mulder，1994，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)32(2)292-300，以及Amplicor HIV-1Monitor实验中的产物部分，该严格条件并非本发明的关键所在。扩增条件的最优化可按本文提供的指导建立。
本发明的引物和方法可用于检测HIV-1原病毒DNA或HIV-1RNA，RNA的扩增用反转录/聚合酶链反应(RI-PCR)，该技术在本学科内已知，可见于美国专利号5,322,770、5,310,652；Myers Gelfand，1991，生物化学(Biochemistry)30(31)7661-7666；以及Young等，1993 临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)31(4)882-886。HIV-1RNA的RT-PCR扩增技术见Mulder等，1994，临床微生物学杂志(J.Clin Microbiol)32(2)；292-300和Holodniy等，1991传染病杂志(J.Inf.Dis.)163802-865.
适用于扩增HIV-1DNA及RNA的样品制备方法可见有关文献。所用的具体方法不是本发明的关键，有关技术人员可根据本文提供的指导选择并优化适当的样品制备方法。用于检测HIV-1原病毒DNA的优选样品制备方法见Casareale等，1992，PCR方法和应用2149-153以及Butcher和Spadoro.1992，临床免疫学通讯(Clin.Immunol Newsletter)1273-76。用于检测HIV-1原病毒DNA的优选样品制备试剂盒可作为Amplicor HNV-1实验的一部分购得。用于检测血浆中HIV-1RNA的优选样品制备法见Mulder等，1994，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol)32(2)292-300。用于检测和/或定量HIV-1RNA的优选样品制备试剂盒可作为AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验的一部分购得。扩增产物分析本发明的扩增引物和方法适用于任何扩增核酸的应用，例如应用本发明的引物有助于克隆和/或HIV-1测序。检测PCR扩增核酸的方法在本领域中是已知的。用于分析该扩增的核酸的方法不是本发明关键所在，任何适当的方法均可使用。优选使用实施例中所示的HIV-1RNA扩增法以定量病毒的荷载量。
检测扩增核酸的方法包括用凝胶电泳分析扩增产物及用与互补寡核苷酸探针杂交来进行检测。检测靶-探针杂交的适宜程序是已知的，包括斑点印迹法和反向斑点印迹法。
斑点印迹法中扩增的目的DNA用固相支持物固定，如尼龙膜。该膜-靶复合物在适宜的杂交条件下与标记的探针一起孵育，并在适宜的严格杂交条件下洗去未结合的探针，然后监测膜上结合探针的情况。PCR扩增产物的斑点印迹检测法见Saiki，1986，自然(Nature)324163-166和美国专利号5,468,613。
在反向斑点印迹法中，探针固定在固相支持物如尼龙膜上，扩增的目的DNA是标记了的。目的DNA的标记一般是在扩增过程中通过与标记的引物结合实现，可以标记一个或两个引物。将膜-探针复合物与标记的扩增的靶DNA在适宜杂交条件下孵育，然后在适当的严格条件下洗去未杂交的靶DNA，监测滤膜作为结合靶DNA存在的标志。反向斑点印迹法可见Saiki，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.SciUSA)866230及美国专利号5,468,613。
或者，反向斑点印迹鉴定法也可在具有大量探针杂交位点或孔的固相支持物上进行。例如微孔板特别适用于本方法的大规模临床应用。可通过被动结合或粘联在微孔板上的蛋白介质如牛血清蛋白(BSA)将探针固定在微孔板上进行(Tung，1991，生物结合化学(Bioconjugate Chem.)2464-465)。。反向斑点印迹法见美国专利号5,232,829；Loeffelholz等，1992，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)30(11)2847-2851；Jackson等，1991等，艾滋病AIDS51463-1467；Mulder等，1994，J.Clin.Microbiol32(2)292-300；AMPLICOR HIV-1 及AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验产物的插入片段。
检测或/和定量扩增产物优选应用与固定在微孔板上的寡核苷酸探针杂交的方法，按AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验的试剂和方法进行。应用本方法定量HIV-1RNA在实施例中有详细叙述。
BSA缀合探针也可与磁性微粒结合，结合探针在溶液中与标记的扩增产物杂交，通过溶液的磁性获取结果产物。根据上述方法即可检测磁性固定的杂交双链。
另一适合的鉴定方法称为5’-核酸酶鉴定法，见美国专利号5,210,015、5,487,972以及Holland等，1988，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)887276-7280。根据此法将标记的检测探针加入扩增反应混合物中，该探针已经修饰以防止探针作为DNA合成的引物。任何在每一合成步骤如引物延伸过程中与目的DNA杂交的探针通过DNA聚合酶(例如TaqDNA聚合酶)的5’-3’外切核酸酶活性而降解，然后检测该探针的降解产物。因此探针断裂产物的存在既能够表明探针与目的DNA杂交的发生和也能表明扩增反应的发生。美国专利号5,491,063和5,571,673给出了检测与扩增同时发生的探针降解的改进方法。
上述的鉴定方案通常应用标记的寡核苷酸协助检测杂交双链。寡核苷酸用可通过分光器、光化学、生物化学、免疫化学或化学的方式可检测到的标记物标记。可用的标记物有32P、荧光染料、电子密度试剂、酶(例如通常用于ELISA中的)、生物素、或者可产生抗血清或单克隆抗体的半抗原或蛋白。本发明标记的寡核苷酸可应用前述合成寡核苷酸的方法合成和标记。
通过监测反应混合物中双链DNA总量的增加检测HIV-1核酸扩增的替换方法见Higuchi等，1992，生物/技术(Bio/Technology)10413-417；Higuchi等，1993，生物/技术(Bio/Technology)；111026-1030；欧洲专利公开号512,334。双链目的DNA的检测依据在于当溴化乙锭和其它DNA结合标记与双链DNA结合时显示的增加的荧光度。这些DNA结合标记是加到扩增反应混合物中的。目的序列的扩增使双链DNA量增加，导致可检测的荧光度的增加。
本发明也涉及试剂盒，包含实施本发明方法所用组分的多包装单位。一个实用的试剂盒包括扩增HIV-1核酸的PCR引物，也含有用于检测扩增的HIV-1产物的试剂，例如寡核苷酸探针，这些探针有时被固定在适当的载体膜上。其它可选择的试剂盒成份包括催化引物延伸产物合成的制剂、三磷酸核苷酸底物、用于标记的物质(例如亲和素-酶缀合物、酶底物，若用生物素标记则为显色剂)、PCR或杂交反应的适宜缓冲液以及实施本方法的说明。
本发明的下述实施例只提供例证，并不限制本发明的范围。通过参阅上文所述及下文的实施例，本学科领域中一般的技术人员可以明了实施例后权利要求书范围内本发明的大量实施方案。
实施例1定量标准的构建用AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验法进行的病毒载荷的定量需用一种定量标准(QS)，该定量标准用相同引物对扩增，但用另一探针检测。将QS按已知的浓度加到被检样品中以产生已知的参照信号，在一较宽的目的片段浓度范围内，由扩增的目的片段或扩增的QS产生的信号与该参照量成正比。目的片段拷贝数可通过比较未知目的片段扩增所产生的信号与已知QS所产生的信号算得。
由于本发明引物扩增的片段不完全包含在AMPLICOR HIV-1MONITOR实验的QS中，因此应用本发明的引物可以构建一新的QS。新的QS是通过延伸Amplicor QS序列使其包含SKCC！(SEQ ID NO3)及SKCC3(SEQ ID NO4)结合位点，由Amplicor QS构建成的。产生的QS可用AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验用的QS特异性探针检测。含有新QS序列的质粒构建可按以下所示的标准技术进行，通过该质粒转录QS RNA。
应用SK145(SEQ ID NO1)及SK151(SEQ ID NO7)引物在下面实施例2中所述的必要条件下扩增由AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验获得的Amplicor QS。这种扩增产生一含有SK145(SEQ ID NO1)及SK151(SEQ IDNO7)引物结合位点的DNA扩增产物，并保留原有的含QS特异探针结合位点的内序列。
然后将产生的扩增产物延伸使其包含SKCC1(SEQ ID NO3)的引物结合位点，并加上一个接头以便克隆产物。该步通过用SK145(SEQ ID NO1)再次扩增延伸使其在5’-末端包含一HindIII接头和SKCC1(SEQ ID NO3)而实现。适宜的扩增条件见Kellogg Kwok，1990，PCR方案方法和应用指南(Innis等编)，Academic Press，San Diego，CA337-347，除应用较低的退火/延伸温度(例如42℃)以使SHCC1(SEQ ID NO3)发生杂交之外。
然后，将扩增产物进一步延伸使其包含SKCC3(SEQ ID NO4)引物结合位点，并在另一端加上第二个接头以便克隆产物。该步通过用SK145(SEQ IDNO1)扩增延伸使其在5’-末端包含一Hind III接头，同样，用SKCC3(SEQ IDNO4)在5’末端延伸使其包含一XBaI接头，扩增条件同上。
然后，将扩增产物插入质粒，扩增的DNA和质粒PSP64(promage，Madison，WI)分别用HindIII和XBaI消化，再用标准方法连接。用重组质粒转染感受态细胞并获取含有正确插入片段的克隆。对重组质粒的插入片段必须进行序列测定以明确该引物和探针结合位点无突变发生。
QS RNA是用MEGAScriptTMSP6试剂盒(Ambion，Inc.Austin，TX)由含有QS序列的重组质粒转录得来。
实施例2HIV-1 RNA定量本实施例评价了由不同HIV-1分离物毒株扩增的相对效率，同时也用AMPHCOR HIV-1 MONITOR实验的试剂盒进行了扩增以便比较。
HIV-1毒株来自HIV-1阳性的临床病例，克隆gag基因片段并用标准方法测序，根据该序列确定克隆的HIV-1亚型。发现大量HIV-1毒株是新型的。本例中按核苷酸序列选取特定的毒株，预期这些毒株的扩增对于AMPLICORHIV-1 MONITOR实验法会有一定的困难，而且所选的毒株能够代表M族亚型的序列变化。目的核酸构建含有来自每一分离物的HIV-1 gag基因片段的质粒，并基本上按Holodniy，1991，传染病学杂志(J.Inf.Dis.)163802-865的方法转录HIV-1 RNA模板。制备每种模板的贮藏液并测定模板浓度，按估计的相对浓度稀释贮藏液以使加到每一反应中的模板浓度相等，加到反应体系中的绝对模板拷贝数大约为4000-8000。定量标准将实施例1所述的QS按已知浓度加入各个反应混合物中，一般每个反应体系大约有100个拷贝。引物反应A-F是应用以下引物组合进行的。
引物组合比较反应引物组合A SK462(SEQ ID NO5)SK431(SEQ ID NO6)B SK145(SEQ ID NO1)SK151(SEQ ID NO7)C SK145(SEQ ID NO1)SKCC1(SEQ ID NO3)D SK145(SEQ ID NO1)和SK145M2(SEQ ID NO2)SKCC1(SEQ ID NO3)E SK145(SEQ ID NO1)SKCC3(SEQ ID NO4)F SK145(SEQ ID NO1)和SK145M2(SEQ ID NO2)SKCC3(SEQ ID NO4)所有的引物都在5’末端生物素化，以便能在反向斑点印迹、微孔板方法中检测。上面未提到的其它引物的序列见下，方向为5’至3’。
上游引物SK462(SEQ ID NO5) AGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT下游引物SK431(SEQ ID NO6) TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCTSK151(SEQ ID NO7) TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT扩增扩增反应A是按AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验所用的试剂和条件进行的。
扩增反应B按100ul反应体积进行，包含的试剂见下HIV-1模板RNAQS RNA
50mMN-二苷氨酸pH 8.3111mM醋酸钾K(OAc)3.6mM醋酸锰Mn(OAc)2500uM三磷酸脱氧尿苷(dUTP)300uM脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)和脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)的每一种50uM 脱氧胸苷三磷酸(dTTP)15％ 甘油0.2uM 每种生物素化的引物2单位 UNG*10单位rTthDNA聚合酶**由Hoffmann-La Roche生产，Pekin Elmer(Norwalk，CT)出售.
扩增反应C、D按反应B的条件进行，但需作如下改动100m K(OAc)500uM dATP，dCTP和dGTP的每一种7.5％ 甘油10单位UNG扩增反应E和F按反应C和D的条件进行但改用10％的甘油，反应混合物的细微改动是为使每对引物的扩增条件最优化。
扩增反应B-F是用TC600DNA热循环仪(Perkin Elmer，Norwalk，CT)按如下温度程序进行的。
反应前孵育 50℃ 2分钟反转录 60℃ 30分钟4个循环 变性95℃ 10秒钟退火55℃ 10秒种延伸72℃ 10秒种26个循环 变性90℃ 10秒种退火60℃ 10秒种延伸72℃ 10秒种最后延伸 72℃ 15分钟用探针杂交检测扩增产物应用AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验的试剂和方案检测扩增产物，估计的起始目的片段浓度按其中所述方法计算。结果AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验的定量方法中，起始目的片段浓度通过比较扩增后该目的片段产生的信号与扩增后已知浓度的QS产生的信号得到。因为QS的已知浓度是扩增前的数值，而比较的信号是扩增后的信号，因此扩增相对效率的改变会影响对未知目的片段起始浓度的估计。AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验定量是按HIV-1亚型B的扩增效率标定的，已知HIV-1的其它亚型会以较低的效率扩增，因此估计的目的片段浓度会比真实浓度低。
在本实验中目的RNA按已知浓度加到各反应中，因此每一毒株的相对扩增效率可通过比较估计的目的片段浓度确定。因为AMPLICOR HIV-1MONITOR实验定量是以HIV-1亚型B的扩增效率标定的，所以将亚型B(克隆105-1)的估计先导浓度作为参考值。对每一毒株，都用该分离物的估计靶浓度除以B亚型的估计靶浓度来测定相对扩增效率。这些相对扩增效率见下表，“-”表示该反应未进行。
相对亚型B的效率克隆亚型 A B C D E F113-1A694.31.70.91.41.40.9113-2A19 ---1.31.11.30.6114-1A12.4 ---1.41.30 70.9114-2A9.8 1.21.11.81.50.8115-1A497.6 0.81.21 1.6115-2A646.42.41 1.50.91.4105-1B11 1 1 1 1101-15 C7.3 ---1.13.51.91.4107-6D0.8 ---0.60.70.70.8308-1D0.9 ---0.60.70.70.5110-5E520.7465.7 3.51.24.60.8111-6E0.8 ---1.11.60.91.1112-7E3.3 0.81.51 91.21.4106-1G1.9 ---2.32 1.81.5108-3G0.6 ---0.50.80.50.5109-1G32.5 1 0.50.60.60.3
结果显示，AMPLICOR用V-1 MONITOR实验(反应A)扩增不同的HIV-1毒株的效率有显著不同，有一些毒株包括亚型E毒株，克隆110-5，其扩增效率至少比亚型B(克隆105-1)的效率低500倍。
尽管只检测了一部分毒株，但应用引物对SK145(SEQ ID NO1)和SK151(SEQ ID NO7)(反应B)仍显示能显著提高扩增效率的均一性。但是亚型E毒株(克隆110-5)的扩增效率仍比亚型B(克隆105-1)的扩增效率低500倍。
应用SK145(SEQ ID NO1)和SKCC1(SEQ ID NO3)(反应C)能以大约3倍于亚型B(克隆105-1)的扩增效率扩增包括亚型E毒株(克隆110-5)在内的全部毒株。加入SK145M2(SEQ ID NO2)(反应D)能进一步提高毒株110-5的扩增效率，使其与亚型B参照种基本上相当。
同样，应用SK145(SEQ ID NO1)及SKCC3(SEQ ID NO4)(反应E)能以大约5倍于亚型B(克隆105-1)的效率扩增包括亚型E毒株(克隆110-5)的全部毒株。加入SK145M2(SEQ ID NO2)(反应F)能进一步提高毒株110-5的扩增效率，使其与亚型B参照种基本上相当。
实施例3临床样品中的HIV-1定量本实施例中对来自Senegal的血清阳性病人的30个临床样品检测HIV-1RNA，虽然未确定临床样品中存在的亚型，但因亚型A和D在非洲该地区内相当普遍，可以预计某些临床样品不能被扩增或不能应用AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验进行有效扩增。
样品准备如下将血浆样品(80-250ul)与20ul 0.25％(重量/体积)的红色Estapor聚苯乙烯微球(Bangs Laboratories，Inc.，Carmel，IN)一起加到1.5ml椎形离心管中，25,300Xg在4℃下离心1小时，弃上清，将沉淀粒子重新悬浮于250ul溶解缓冲液(50ul溶解液相当于6.7ul 30u/ul RNA酶抑制剂(Promega，Madison，WI)；0，67ul100mMDTT(二硫苏糖醇)；2ul10％NP40(Pierce，Rockford，IL)；0.25ul 4mg/ml多聚rARNA；和40.4ul焦碳酸二乙酯处理的水)。将该沉淀在室温下孵育15分钟并旋转混匀。
扩增反应在100ul含有50ul病毒裂解液和50ul的2x扩增反应混合物的反应体系中进行，以使最终反应物浓度与上面所述一致。大约100个拷贝的适当QS作为反应混合物的一部分被加到每一反应中，扩增产物的检测按AMPLICORHIV-1 MONITOR实验所用的试剂和方法进行，如上所述。
每一样品的扩增按如下引物组合进行。
引物组合比较反应 引物组合A SK462(SEQ ID NO5)SK431(SEQ ID NO6)B SK145(SEQ ID NO1)SKCC1(SEQ ID NO3)C SK145(SEQ ID NO1)和SK145M2(SEQ ID NO2)SKCC1(SEQ ID NO3)结果按每ml血浆中HIV-1模板的拷贝数总结如下
估计的目的片段浓度(拷贝/毫升)分离物 A BC重复试验重复式验DKN 0350 800 1860 16001100DKN 079360 300603724091780 152300DKN 1541140 216605456068820 67120DKN 1620 160202598064340 21880DKN 1620 121801052014300 18320DKN 1690 3140 7000 56518047DKN 1711180 640 500 560 1040DKN 282560 3400 4360 55603460DKN 402340 4260 1052070005060MBN 26 27740 169401922016700 18680MBN 31 180 1820 1820 17202240MBN 34 840 2160 2200 31003120MIH 0022320 51320121100 144180 123900MIH 0122960 336204092040740 75840MIH 01330360 319805536042800 71220MIH 03017625 178500 273938 169750 189625MIH 053+ 534960 231620 530900 878340MIH 05510560 439605422049400 37400MIH 0745700 3980 6020 36404940MIH 11230480 271980 490780 423600 416140MIH 157520 165480 82920169980 146320MIN 003a 1300 577202162035380 34560MIN 003b 1760 328203094027760 26600MIN 017540 437380 375120 447740 902780MIN 0670 000 0MIN 12644320 636003846056680 40300MIN 139460 146320 142800 94520 105600MIN 146200 499203210019900 30400MIN 2170 3220 1880 23202580MIN 589154780267740 127100 144160 228040结果表明，本发明的引物组合B和C能扩增来自大多数的临床样品。30例样品中除一例外，该引物组合B和C都能扩增，相反AMPLICOR HIV-1MONITOR实验不能扩增29例中的6例。样品MIH053应用AMPLICORHIV-1 MONITOR实验扩增产生出一个强信号，但不能产生QS信号。因此在上表中该样品未被定量，以“+”表示。
而且，对大多数样品应用引物组合B或C估计的拷贝数显著高于应用AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验估计的拷贝数。根据实施例2中显示的扩增效率的不同，以上应用AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验低估的模板浓度也许会产生明显降低的扩增效率。
在样品MIN067中未检测到病毒RNA，但这是否是由于目的序列中的不可见变化干扰了引物杂交或探针杂交，或其它原因引起的，尚不能定论。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名F.HOFFMANN-LA ROCHE AG(B)街道Grenzacherstrasse 124(C)城市Basle(D)洲BS(E)国家Switzerland(F)邮编(ZIP)CH-4070(G)电话061-688 37 82(H)传真061-688 13 95(I)电报962292/665542 hlr ch(ii)发明名称检测HIV-1的引物(iii)序列号7(iv)机读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机Apple Macintosh(C)操作系统System 7.1(Mactintosh)(D)软件Word 5.1(v)在先申请资料申请号60-037744申请日17.01.97(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO1AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO2AGTGGGGGGACACCAGGCAGCAATGCAAAT(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO3TACTAGTAGT TCCTGCTATG TCACTTCC(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO4TGAAGGGTAC TAGTAGTTCC TGCTAT(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述 SEQ ID NO5AGTTGGAGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO6TGCTATGTCA GTTCCCCTTG GTTCTCT(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO7TGCTATGTCA CTTCCCCTTG GTTCTCT
权利要求
1.一种用以扩增人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的寡核苷酸引物，其选自SKCC1(SEQ ID NO3)和SKCC3(SEQ ID NO4)。
2.一对由SK145(SEQ ID NO1)和SKCC1(SEQ ID NO3)组成的寡核苷酸引物。
3.一组由权利要求2的一对引物和SK145M2(SEQ ID NO2)组成的寡核苷酸引物。
4.一对由SK145(SEQ ID NO1)和SKCC3(SEQ ID NO4)组成的寡核苷酸引物。
5.一组由权利要求4的一对引物和SK145M2(SEQ ID NO2)组成的寡核苷酸引物。
6.一种检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的试剂盒，其包括权利要求1的寡核苷酸引物。
7.一种检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的试剂盒，其包括权利要求书2的一对寡核苷酸引物。
8.一种检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的试剂盒，其包括权利要求3的一组寡核苷酸引物。
9.一种检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的试剂盒，其包括权利要求4的一对寡核苷酸引物。
10.一种检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的试剂盒，其包括权利要求5的一组寡核苷酸引物。
11.一种扩增人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的方法，其包括应用SKCC1(SEQ ID NO3)或SKCC3(SEQ ID NO4)进行聚合酶链反应。
12.权利要求11的方法，其中聚合酶链反应是用SK145(SEQ ID NO1)和SKCC1(SEQ ID NO3)进行。
13.权利要求12的方法，其中聚合酶链反应也用SK145M2(SEQ ID NO2)进行。
14.权利要求11的方法，其中聚合酶链反应是用SK145(SEQ ID NO1)和SKCC3(SEQ ID NO4)进行。
15.权利要求11的方法，其中聚合酶链反应也用SK145M2(SEQ ID NO2)进行。
16.基本上如本文所述的新的引物、方法和试剂盒。
全文摘要
本发明为人类免疫缺陷性病毒1型(HIV－1)gag基因核酸序列的聚合酶链反应(PCR)扩增提供了改进的引物,本发明的引物和扩增方法能够以几乎相同的效率检测全部HIV－1型M族的分离物。
文档编号C07H21/04GK1191975SQ9810391
公开日1998年9月2日 申请日期1998年1月9日 优先权日1997年1月17日
发明者辛迪·D·克里斯托弗森, 雪莉·Y·夸克, 吕余希达 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司