专利名称：实验动物多项病毒的简易蛋白芯片定性检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及ー种病毒抗体定性检测的蛋白芯片试剂盒，具体涉及ー种检测实验动物多项病韋的简易蛋白芯片定性试剂盒。
背景技术：
灵长类实验动物是研究病毒感染性疾病、神经系统疾病及肿瘤等疾病和新药研发所必需的重要动物模型。随着研究的深入，对灵长类实验动物的需求量及其品质的要求也不断提高。我国科技部已经制定实验动物健康标准，明确要求普通级动物必须是B病毒 (BV)阴性，SPF级动物必须是B病毒(BV)、猴T细胞趋向性病毒(STLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D病毒(SRV)等阴性。国内外用动物单位根据其研究内容的不同也对麻疹病毒、埃博拉病毒、猴泡沫病毒等多种病毒有要求，但因为缺乏可靠的检测方法，灵长类实验动物健康检测远远跟不上行业发展的需要，因此，提供一种灵敏度高、特异性强、检测速度快、效率高的动物病毒检测方法已成为必然的需求。现有的检测方法主要是玻片法和ELISA方法，该两种方法一次只能检测出ー种病毒抗体，操作繁琐，检测的速度慢、效率低。
实用新型内容为解决现有技术的不足，本实用新型的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、检测速度快、效率高的检测实验动物多项病毒的简易蛋白芯片定性试剂盒。为达到上述目的，本实用新型是通过以下的技术方案来实现的实验动物多项病毒的简易蛋白芯片定性检测试剂盒，其特征在于，包括按矩阵预点了多种病毒抗原及參照细胞的芯片膜、用于加样的载样条、渗滤用的渗滤垫和反应的塑料平皿，所述的载样条贴覆在所述的芯片膜上按矩阵排列的每组抗原点上，且所述的载样条的尺寸与每组抗原点的尺寸相匹配。进ー步，所述的芯片膜的基质为孔径0. 45um的硝酸纤维膜，大小为9cm*9cm，且硝酸纤维膜上共预点3列，每列9组，共27组，其中前25组检测样本，最后两组分别为阴性对照和阳性对照，每组可以点布约7种抗原，包括病毒抗原及參照细胞，在每组病毒抗原点的两端，各有一个用于定位的甲基紫点，每个点的量为0. 5-lul，直径约2mm。此外，所述的硝酸纤维膜所预点的抗原为实验猴易感的B病毒(BV)、猴T细胞趋向性病毒(STLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D病毒(SRV)、麻疹病毒(Measles)、埃博拉病毒(Ebola)、猴痘病毒(MPV)中的至少ー种病毒。而所述的载样条是尺寸为0. 5cm*2cm,厚度为0. 18mm的滤纸条。还包括用于血清样本渗滤而放在芯片膜下方的渗滤垫，所述的渗滤垫是大小为9cm*9cm的厚滤纸。此外，还包括碱性磷酸酶标记的羊抗猴IgG、显示试剂快红和萘酚和用于将硝酸纤维膜成像的成像仪。本实用新型是将浸透了稀释血清的载样条按顺序贴覆在抗原膜矩阵上，经过孵育、洗涤后，加入适量的碱性磷酸酶标记的羊抗猴IgG进行二次孵育，再次洗涤后加入显色剂快红和萘酚进行显色，通过抗原点是否显色来判读结果。通过成像仪将膜成像，再经过软件的处理和分析，可以对结果做定量分析。本实用新型的有益效果是本实用新型提供的实验动物多项病毒的简易蛋白芯片定性检测试剂盒，可在两小时内一次性同时检测B病毒、STLV、SIV、SRV、麻疹等多种病毒的抗体，ー张9cm*9cm的芯片膜能同时检测25份样本,姆次实验可以同时操作若干张芯片膜，实现了多份样本的多种病毒同步检测，即大大提高了检测的速度和效率又減少了每个标本的采样量。硝酸纤维膜比传统的固相载体能吸附更多的抗原，大大提高了检测敏感性，利用本实用新型的检测方法简易，不需要特殊设备，便于在各级动物中心和养殖单位推广使用， 同时还具有稳定性高、重复性好，特异性好的优点，芯片膜还可以批量加工，且易于保存。
图I是猴病韋抗体检测芯片不意图；图2是染色深度和读膜參照示意图。图中主要附图标记含义为a、芯片膜b、病毒抗原组C、阴性对照组d、阳性对照组e、甲基紫点。
具体实施方式
图I是猴病毒抗体检测芯片示意图。如图I所示实验动物多项病毒的简易蛋白芯片定性检测试剂盒，包括按矩阵预点了多种病毒抗原及參照细胞的芯片膜a、用于加样的载样条、渗滤垫和反应的塑料平皿，所述的载样条贴覆在所述的芯片膜a上按矩阵排列的每组抗原点上，且所述的载样条的尺寸与姆组抗原点的尺寸相匹配，在本实施方式中，所述的载样条的尺寸为0. 5cm*2cm,厚度为 0. 18mm。而所述的芯片膜a的基质为硝酸纤维膜，其规格为9cm*9cm，且芯片膜a上共预点3列(即如图I所示的第一列、第二列和第三列)，每列9组，共27组，且前25组为病毒抗原组b，最后两组分别为阴性对照组c和阳性对照组d，每组可以点布约7种病毒抗原，在每组病毒抗原点的两端，各有一个用于定位的甲基紫点e，每个点的量为0. 5-lul，直径约2_，而用于点布抗原的硝酸纤维膜的孔径为0. 45um,。此外，所述的芯片膜a所预点的抗原为实验猴易感的B病毒、猴T细胞趋向性病毒、猴免疫缺陷病毒、猴逆转录D病毒、麻疫病毒、埃博拉病毒、猴痘病毒中的至少一种病毒。在本实施方式中，完成免疫反应后出现红色斑点的即代表该样本的对应病毒抗体是阳性的。图2是染色深度和读膜參照示意图。如图2所示从左至右分别代表 “+/_” “ + ” “++” “+++”的染色深度，即染色深度逐渐增強。此外，还包括用于将硝酸纤维膜成像的成像仪。具体过程如下[0026]I.材料和试剂在本实施例中，所用的试剂酶标ニ抗为碱性磷酸酶标记的羊抗猴IgG，母液浓度为lmg/ml，容剂为50%甘油，工作液稀释比例为1:1000到1:5000之间。而用于显色的显色剂为快红和萘酚，使用的浓度为快红l_4mg/ml，溶剂为0. 2M Tris Buffer，最佳浓度为3mg/ml ;萘酚0. 2-0. 5mg/ml，溶剂为水，最佳浓度为0. 4mg/ml。具体为(I) 10cm*10cm 的塑料平皿；(2 ) 9cm*9cm 的厚渗滤垫；(3)载样条；(4)芯片膜4°C保存，保持干燥；(5)碱性磷酸酶标记的羊抗猴IgG :临用前取15耵，用0. OlM PBS稀释2000倍后
使用；(6)磷酸盐缓冲试剂0. 01M, pH7. 2 ；(7) PBST 洗涤液在 100 ml 0. OlMPBS 中加 IOOPl 100% 吐温-20，充分混匀，得0. 1% PBST洗涤液，室温保存；(8)样本稀释试剂本试剂为脱脂奶粉，实验前用0. OlM PBS配成5g/100ml样本稀释液，4°C保存；(9) Tris缓冲试剂1. 42gTris HCl加超纯去离子水或蒸懼水至50ml,配成0. 2MpH8. 0 Tris Buffer工作液，室温保存；(10)阴性对照-25°C保存，临用前取适量加样本稀释液按1:5稀释；(11)阳性对照-25°C保存，临用前取适量加样本稀释液按1:5稀释；(12)萘酹取40mg用IOOml超纯去离子水或蒸懼水溶解后室温保存备用；(13)快红染色前取 15mg 用 5ml 0. 2M pH8. 0 Tris Buffer 溶解；(14)反应终止试剂IOOmg试剂用超纯去离子水或蒸馏水定容至100ml，配成0. 1%的反应终止液，室温保存。2.操作步骤( I)收集标本使用不加抗凝剂的采血管，采静脉血约I. 5ml ;采血后可直接离心或静置半小时待血液凝固后再离心，3000rpm, 10_15min ;吸出血清。(2)稀释血清将待检血清按照1: 5的比例用样本稀释液稀释备用；取IOOul对照血清，加样本稀释液按1:5稀释待用。(3)准备芯片膜取出芯片膜a，放在10cm*10cm的塑料平皿中，加入15ml样本稀释液，置摇床上慢速摇动，室温封闭半小时；封闭结束后，将芯片膜a用PBS冲洗干净；然后在芯片膜a下垫置9cm*9cm的渗滤垫ー张，注入少许PBST洗涤液将膜和厚滤纸充分湿润，再倒出多余液体。(4)加样 先将稀释好的血清在震荡器上轻度震荡混匀，用尖头镊子轻夹一片本试剂盒提供的载样条的一端，将另一端小心浸入稀释的样本中，待载样条浸透稀释血清后贴覆在芯片膜a的矩阵上的每两个甲基紫中间的位置。按序贴完25个待检样本后再贴上对照样本。(5)孵育盖上平皿盖，置于水浴槽或恒温箱中37°C孵育30分钟。(6)洗涤孵育结束后，取出平皿，用洗涤液快速冲去芯片膜a上覆盖的载样条，弃去渗滤垫；再用洗涤液洗涤3遍，每遍5分钟，洗涤过程中置塑料平皿于摇床上中速摇动。(7)酶标ニ抗将提供的碱性磷酸酶标记的羊抗猴IgG按每块芯片膜取15 M1抗体加入到15mlPBS中的比例进行稀释，混匀后倒入塑料平皿，置室温孵育30分钟。(8)洗涤倒出ニ抗溶液，将芯片膜用洗涤液洗涤3遍，每遍5分钟。(9)显色姆块膜需要称取15mg快红溶于5ml I X Tris Buffer、2mg萘酹溶于5ml超纯去离子水或蒸馏水。使用前将两种显色剂混匀，倒入塑料平皿中。大约需要反应2-5分钟，即可将染好的芯片膜浸入预先准备的15ml反应终止液中I分钟以终止反应。然后用蒸馏水快速冲洗2遍后，将芯片膜置于空气中自然晾干，再判读結果。3.结果判断可以选用3. I和/或3. 2方式进行3. I肉眼判读出现以下情况判为阳性⑵(I)若对照细胞点无色，同时病毒抗原点顔色相当于图2中“+ +++”深度；(2)若对照细胞点深度为“ 土”，同时病毒抗原点深度达“++”及其以上。出现以下情况判为可疑(I):(I)若对照细胞无着色，病毒抗原点顔色深度相当于图2中“+/-”深度；(2)若病毒抗原点和对照细胞点颜色深度相似，都达到图2中“ + ”及其以上深度；出现以下情况判为阴性(N)若病毒抗原点无色，或颜色仅达到图2中“ 土”同时对照细胞点也达到“ 土 ”。3. 2取上述染色结束的芯片膜，通过成像仪成像，再用Image J软件进行处理和分析。即可对所检测的病毒抗体做半定量分析。本实用新型提供的检测实验动物多项病毒的简易蛋白芯片定性试剂盒，可在两小时内ー次性同时检测8病毒、511^、51￥、51^、麻疹等多种病毒的抗体，ー张9011*9011的芯片膜能同时检测25份样本，毎次实验可以同时操作若干张，实现了多份样本的多种病毒同步检测，即大大提高了检测的速度和效率；硝酸纤维膜比传统的固相载体能吸附更多的抗原，大大提高了检测敏感性；利用本实用新型的检测方法简易，不需要特殊设备，便于在各级动物中心和养殖单位推广使用；同时还具有稳定性高、重复性好、特异性好的优点；芯片膜还可以批量加工，且易于保存。上述实施例仅是本实用新型的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但不能因此而理解为对本实用新型专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。因此，本实用新型专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求1.实验动物多项病毒的简易蛋白芯片定性检测试剂盒，其特征在于，包括按矩阵预点了多种病毒抗原的芯片膜、用于加样的载样条和塑料平皿，所述的载样条贴覆在所述的芯片膜上按矩阵排列的每组抗原点上，且所述的载样条的尺寸与每组抗原点的尺寸相匹配。
2.根据权利要求I所述的实验动物多项病毒的简易蛋白芯片定性检测试剂盒，其特征在于，所述的芯片膜的基质为0. 45um孔径的硝酸纤维膜，大小为9cm*9cm，点布有27组病毒抗原组，每组包括7种不同病毒和对照抗原，在每组病毒抗原点的两端，各有一个用于定位的甲基紫点，每个点的量为0. 5-lul，直径约2_。
3.根据权利要求I所述的实验动物多项病毒的简易蛋白芯片定性检测试剂盒，其特征在于，还包括用于血清样本渗滤而放在芯片膜下方的渗滤垫，所述的渗滤垫为大小为9cm*9cm的厚滤纸。
4.根据权利要求I至3任一项权利要求所述的实验动物多项病毒的简易蛋白芯片定性检测试剂盒，其特征在于，所述的芯片膜所预点的抗原为实验猴易感的B病毒、猴T细胞趋向性病毒、猴免疫缺陷病毒、猴逆转录D病毒、麻疫病毒、埃博拉病毒、猴痘病毒中的至少一 种病毒。
5.根据权利要求I所述的实验动物多项病毒的简易蛋白芯片定性检测试剂盒，其特征在于，所述的载样条是尺寸为0. 5cm*2cm,厚度为0. 18mm的滤纸条。
6.根据权利要求I所述的实验动物多项病毒的简易蛋白芯片定性试剂盒，其特征在于，还包括用于将芯片膜成像的成像仪。
专利摘要本实用新型公开了实验动物多项病毒的简易蛋白芯片定性检测试剂盒，其特征在于，包括按矩阵预点了多种病毒抗原及参照细胞的抗原芯片膜、用于加样的载样条、渗滤垫和反应的塑料平皿，所述的载样条贴覆在所述的芯片膜上按矩阵排列的每组抗原点上，且所述的载样条的尺寸与每组抗原点的尺寸相匹配。样本中的病毒抗体和膜上相应的抗原发生特异性结合，然后加入酶标二抗、显色剂，通过一系列的反应，待检样本中所检病毒抗体阳性的样本在其相应的抗原点呈现肉眼可见的斑点，一组抗原点对应一份样本，一张芯片膜能同时检测27份样本，实现了多份样本的多种病毒同步检测，方法简易，不需要特殊设备，便于在各级动物中心和养殖单位推广使用。
文档编号G01N33/569GK202393770SQ20112051474
公开日2012年8月22日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者时长军, 荣荣, 郭连香 申请人:苏州西山生物技术有限公司