一种利用BiFC指示细胞中Wnt信号活性状态的载体组合物及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用BiFC指示细胞中Wnt信号活性状态的系统及应用。本发明提供了一种融合蛋白组，由融合蛋白A和融合蛋白B组成，所述融合蛋白A包括核心效应因子β-catenin片段和位于其C段的荧光蛋白片段A；所述融合蛋白B包括转录因子TCF和位于其N段的荧光蛋白片段B。本发明的实验证明，本发明利用依据双分子荧光互补技术(BiFC)的策略将Wnt信号通路中核心效应因子β-catenin与转录因子TCF形成的复合体可视化，从而直接显示Wnt在细胞中的活性状态，本发明将BiFC系统瞬时转染细胞或构建成稳定表达细胞系，可观察到细胞核中形成的特异信号，该信号可以特异显示并反映活细胞中Wnt信号通路活性状态及其变化。
【专利说明】—种利用B i FC指示细胞中Wnt信号活性状态的载体组合物及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，尤其涉及一种利用BiFC指示细胞中Wnt信号活性状态的载体组合物及应用。
【背景技术】
[0002]经典的Wnt信号通路是一条保守而重要的信号转导通路，与胚胎发育、成体组织稳态、癌症发生都有着密切联系。在多种癌症中，例如结直肠癌、乳腺癌、肺癌、皮肤癌等等，都已经检测到因为通路成员突变等多种原因造成的fct信号的异常激活。因此，对Wnt信号通路的研究以及以fct信号为靶点的药物筛选都具有非常重要的意义。
[0003]关于经典Wnt信号的工作模式，目前人们认为，当fct信号被激活时，降解复合体的功能被抑制，使得β-catenin得以在细胞质中积累，进而入核与转录因子TCF结合一同激活下游靶基因的转录。近年来，已经有许多基因被鉴定为fct信号通路靶基因，这些基因在细胞增殖、细胞存活、细胞代谢等多个领域都发挥着重要作用。因此，β-catenin与TCF家族成员(TCF1、LEFU TCF3、TCF4)发生相互作用形成复合体被认为是Wnt信号过程中的关键步骤，成为fct信号转录调控的重要开关。该关键步骤也被认为是药物筛选的重要靶点之一 O
[0004]为了显示Wnt 信号在细胞内的活性状态，人们发明了多种方法。T0PFLASH报告系统便是一种广泛应用的方法，该系统可通过报告基因荧光素酶的表达显示fct靶基因的转录输出状态。
[0005]在双分子荧光互补技术(BiFC)系统中，荧光蛋白被截成N段、C段两部分，分别与两个目标蛋白构建为融合蛋白。单独的荧光蛋白片段本身不能发出荧光，并且在细胞空间范围内随机接近的几率很小。只有当两个目标蛋白之间发生相互作用时，才可以拉近荧光蛋白片段，有利于它们重组成完整的荧光蛋白进而发出荧光，如图1所示。BiFC可用于观测活细胞内蛋白分子间的相互作用，也可以通过其荧光定位显示互作发生的位置。BiFC在多种物种的细胞组织中均能使用，例如在哺乳动物细胞、植物组织、线虫等多种系统中都具有可行性。BiFC信号可在普通显微镜下进行检测，不需要特殊分析手段。BiFC系统可以在较低的蛋白水平下检测到荧光，并且只需要两个荧光蛋白片段之间具有一定的结构上的柔性。总体来说，BiFC为显示活细胞内蛋白之间的相互作用提供了直接、便捷、高精度的技术手段。
[0006]目前，还没有报道利用BiFC技术显示β-catenin水平及下游水平的蛋白互作情况。
【发明内容】
[0007]本发明的一个目的地是提供一种用于检测细胞内Wnt信号活性状态的融合蛋白组。[0008]本发明提供的融合蛋白组，由融合蛋白A和融合蛋白B组成:
[0009]所述融合蛋白A包括β -catenin的C端缺失片段和位于其C段的荧光蛋白片段A；
[0010]所述融合蛋白B包括转录因子TCF和位于其N段的荧光蛋白片段B ；
[0011 ] 所述β -catenin的C端缺失片段为β -catenin蛋白氨基酸序列N末端起第2-667
个氨基酸残基。
[0012]上述的融合蛋白组中，
[0013]所述融合蛋白A从N端起依次由所述β -catenin的C端缺失片段、连接肽和荧光蛋白片段A组成；
[0014]所述融合蛋白B从N端起依次由所述转录因子TCF、连接肽和荧光蛋白片段B组成；
[0015]所述荧 光蛋白片段A和所述荧光蛋白片段B来源于同一个荧光蛋白或不同荧光蛋白。
[0016]上述的融合蛋白组中，
[0017]所述TCF 为 TCF1、TCF2、TCF3、TCF4 或其转录变体。
[0018]所述连接肽的氨基酸序列为序列表中序列2 ；
[0019]所述荧光蛋白为EYFP和/或Venus荧光蛋白；
[0020]所述荧光蛋白片段A为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第155-238位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第159-238位氨基酸；
[0021 ] 所述荧光蛋白片段B为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第1_173位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第1-158位氨基酸。
[0022]上述的融合蛋白组中，
[0023]所述融合蛋白A从N端起依次由所述β -catenin的C端缺失片段、连接肽和荧光蛋白片段A组成；所述荧光蛋白片段A为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第155-238位氨
基酸；
[0024]所述融合蛋白B从N端起依次由所述转录因子TCF3、连接肽和荧光蛋白片段B组成；所述荧光蛋白片段B为EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第1-158位氨基酸；
[0025]所述融合蛋白A的氨基酸序列具体为序列表中的序列8 ；
[0026]所述融合蛋白B的氨基酸序列具体为序列表中的序列14。
[0027]本发明的另一个目的是提供DNA分子组。
[0028]本发明提供的DNA分子组，其由编码融合蛋白A的DNA分子A和编码融合蛋白B的DNA分子B组成,所述DNA分子A的核苷酸序列为序列表中序列7 ;所述DNA分子B的核苷酸序列为序列表中序列13。
[0029]本发明第三个目的是提供重组载体组。
[0030]本发明提供的重组载体组，由表达融合蛋白A的重组载体和表达融合蛋白B的重组载体组成；
[0031]所述表达融合蛋白A的重组载体为将所述编码融合蛋白A的DNA分子插入表达载体得到的载体；
[0032]所述表达融合蛋白B的重组载体为将所述编码融合蛋白B的DNA分子插入表达载体得到的载体。
[0033]上述表达载体具体为pcDNA3.1-FLAG, pcDNA3.1-Myc 或 pBI。
[0034]本发明第四个目的是提供一种转基因细胞系。
[0035]本发明提供的转基因细胞系，为将所述表达融合蛋白A的重组载体和所述表达融合蛋白B的重组载体共同导入宿主细胞中得到的细胞系。
[0036]上述融合蛋白组、上述的DNA分子组、上述的重组载体组或权利要求7所述的转基因细胞系在利用BiFC检测影响细胞Wnt信号的物质中的应用也是本发明保护的范围；
[0037]或上述融合蛋白组、上述的DNA分子组、上述的重组载体组或上述的转基因细胞系在利用BiFC检测细胞中Wnt活性状态中的应用也是本发明保护的范围。
[0038]本发明第五个目的是提供一种利用BiFC检测或鉴定影响细胞内Wnt信号的物质的方法。
[0039]本发明提供的方法，包括如下步骤:
[0040]将小分子物质作用上述的转基因细胞系，检测处理后的转基因细胞系，
[0041]若处理转基因细胞系的BiFC荧光信号比处理前转基因细胞系强，则所述小分子物质为激活细胞内fct信号的物质； [0042]若处理转基因细胞系的BiFC荧光信号比处理前转基因细胞系弱，则所述小分子物质为抑制细胞内fct信号的物质；
[0043]所述小分子物质具体为导致TCF缺失的干扰RNA、GSK3 β、E_cadherin、LiCl、BIO、NC043 或 SRSFl 蛋白。
[0044]上述作用的方式如下:
[0045]若是蛋白或核酸，则作用为将含有蛋白编码基因或含有核酸的重组载体转染到所述转基因细胞中；
[0046]若小分子物质为化合物，则作用为将所述化合物加入转基因细胞培养基中。
[0047]本发明第六个目的是提供一种用于检测细胞内fct信号活性状态的方法。
[0048]本发明提供的方法，将所述表达融合蛋白A的重组载体和所述表达融合蛋白B的重组载体共同导入宿主细胞，得到转基因细胞，观察转基因细胞，若有荧光产生，表明激活细胞中的fct信号，若无荧光产生，表明未激活细胞中的Wnt信号，实现可视化观察细胞中的fct信号活性状态或变化。
[0049]本发明的实验证明，本发明利用双分子荧光互补技术(BiFC)的策略将Wnt信号通路中核心效应因子β -catenin与转录因子TCF形成的复合体可视化,从而直接显示Wnt在细胞中的活性状态，本发明将BiFC系统瞬时转染细胞，可观察到细胞核中形成的特异信号，该信号可以特异显示并反映活细胞中fct信号通路活性状态及其变化。因此，该方法相比T0PFLASH系统更为直观、方便，且可提供细胞定位上的具体信息；直观显示活细胞中fct信号转导的关键蛋白β-catenin与转录因子TCF的相互作用，包括时间与空间定位，同时也建立了一个可用于筛选影响二者互作关系的小分子或基因的研究体系。另外，本发明提供的BiFC构建策略包括EYFP以及Venus荧光蛋白片段的采用，与β-catenin(C端)和TCF (N端)的融合位置，以及linker序列的使用，帮助特异、有效的BiFC荧光形成，并对于TCF家族不同成员以及其他物种中同源蛋白均可适用。
[0050]总之，在本发明中，拟用BiFC系统来特异显示Wnt中关键步骤β -catenin与TCF之间的相互作用来表征细胞的激活情况。相较于之前常用于显示fct信号激活靶基因转录输出的TOP-Flash报告系统，BiFC系统可以在TOP-Flash报告系统的上游显示Wnt信号的激活情况，提供了全新的显示维度。并且由于BiFC系统还可以提供定位信息，从而具备为研究提供更多信息的可能性。依据BiFC系统所构建的细胞系可以被应用于针对大规模筛选或鉴定fct信号调控因子或小分子的实验中。
[0051]以下的实施例便于更好的理解本发明，其中用到的相关表达载体、细胞系并不限定于本发明。由于β-catenin和TCF在不同物种之间较为保守,4个TCF家族成员之间介导与β -catenin相互作用的结构域也较为保守，因此BiFC构建策略可以显示不同物种来源的，例如人类、小鼠、斑马鱼、爪蟾，TCFs与β-catenin之间的相互作用。
[0052]下述实施例中以β -catenin和TCF3组合为例。
[0053]实施例中的实验方法，均为常规分子细胞生物学实验方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0054]图1为BiFC系统工作基本原理示意图
[0055]图2为β -catenin-TCF BiFC系统克隆构建示意图
[0056]图3为β -catenin-TCF BiFC系统空间结构示意图
[0057]图4为β -catenin-TC F BiFC系统克隆的表达及活性检测
[0058]图5为利用TCF突变体检测β -catenin-TCF BiFC系统的特异性
[0059]图6为利用TCF突变体对β -catenin-TCF BiFC不同组合进行比较
[0060]图7为Wnt信号负调控因子过表达抑制β -catenin-TCF BiFC信号[0061 ]图8为β -catenin-TCF BiFC系统稳定表达细胞系构建策略
[0062]图9为β -catenin-TCF BiFC稳定表达细胞系的蛋白表达检测
[0063]图10为小分子药物处理可导致β -catenin-TCF BiFC荧光信号变化
[0064]图11为病毒感染处理可导致β -catenin-TCF BiFC荧光信号变化
【具体实施方式】
[0065]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0066]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0067]实施例1、融合蛋白组合物及由其构建的BiFC系统
[0068]基于β -catenin与TCF3-CBD的晶体结构，可以知道β -catenin的C端(第667氨基酸，不含C端未知结构)与TCF3的N端在空间上较为接近。荧光蛋白的两个片段被设计分别融合于TCF3N端以及β -catenin的C端。由于β -catenin的C端结构未知,且不参与TCF之间的相互作用，同时β -catenin Δ C( β -catenin氨基酸自N末端第2-667位氨基酸残基，β-catenin Λ C片段以下简称β-cat)的使用也可以在一定程度上避免细胞内Wnt信号过高而诱导凋亡，起到保护细胞的作用，因此采用β -catenin Λ C和TCF3作为目的蛋白构建BiFC系统。
[0069]β -catenin 的 genbank 号及提交时间为 ΝΡ_001091679，2014.4.27 ；
[0070]转录因子TCF3 的 genbank 号及提交时间为 NP_001080938, 2014.5.14。
[0071]按照BiFC系统构建经验，一段具有柔性结构特点的GSGSGS序列作为连接肽用来连接目标蛋白和荧光蛋白片段，其核苷酸序列为序列1，其氨基酸序列为序列表中序列2，通过增加结构的灵活性提高融合蛋白形成的几率。
[0072]β -cat-TCF BiFC系统的空间结构如图2所示。
[0073]1.融合蛋白组合物的获得
[0074]1.1融合蛋白组合的设计
[0075]根据文献，选取EYFP和Venus作为荧光蛋白，EYFP的氨基酸序列为序列表中序列3，其编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4，Venus的氨基酸序列为序列表中序列6，其编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5。
[0076]将上述两种荧光蛋白按照如下划分:荧光蛋白片段YN(YFP蛋白的N端起第1_158个氨基酸残基)、YC (YFP C端起第159-240个氨基酸残基)、VN (Venus蛋白的N端起第1-173个氨基酸残基)、VC(Venus蛋白的C端起第155-239个氨基酸残基)被用于克隆构建，得到4种类型的融合蛋白组合物:
[0077]组合一、β -cat-VC+VN-TCF:由融合蛋白β _cat_VC和融合蛋白VN-TCF组成；
[0078]融合蛋白β -cat-VC编码基因的核苷酸序列为序列表中序列7，其中序列7自5’末端第1-1998位核苷酸为β -catenin Δ C编码区，第2005-2022位核苷酸为连接肽编码区，第2023-2280位核苷酸为VC编码区；融合蛋白β -cat-VC的氨基酸序列为序列表中序列8,其中序列8自N末端第1-666位氨基酸残基为β -catenin Δ C,第669—674位氨基酸残基为连接肽，第675-759位 氨基酸残基为VC ；
[0079]融合蛋白VN-TCF编码基因的核苷酸序列为序列表中序列11，其中序列11自5’末端第1-519位核苷酸为VN编码区，第520-537位核苷酸为连接肽编码区，第544-2181位核苷酸为TCF3蛋白编码区；融合蛋白VN-TCF的氨基酸序列为序列表中序列12，其中序列12自N末端第1-173位氨基酸残基为VN，第174-179位氨基酸残基为连接肽，第182-726位氨基酸残基为TCF3蛋白；
[0080]上述组合中，VC和VN可以互换，β -cat-VN+VC-TCF与β -cat-VC+VN-TCF结果无
显著差异。
[0081]组合二、β -cat-YC+VN-TCF:由融合蛋白β _cat_YC和融合蛋白VN-TCF组成；
[0082]融合蛋白β -cat-YC编码基因的核苷酸序列为序列表中编号9，其中序列9自5’末端第1-1998位核苷酸为β -catenin Δ C编码区，第2005-2022位核苷酸为连接肽编码区，第2023-2265位核苷酸为YC编码区；融合蛋白β -cat-YC的氨基酸序列为序列表编号
10,其中自N末端第1-666位氨基酸残基为β -catenin Δ C,第669-674位氨基酸残基为连接肽，第675-754位氨基酸残基为YC ；
[0083]融合蛋白VN-TCF的核苷酸序列和氨基酸序列分别为序列11和序列12。
[0084]组合三、β -cat-VC+YN-TCF:由融合蛋白β -cat-VC和融合蛋白YN-TCF组成；
[0085]融合蛋白β -cat-VC的氨基酸序列和核苷酸序列请见序列7和序列8。
[0086]融合蛋白YC-TCF编码基因的核苷酸序列为序列表中序列13，其中序列13自5’末端第1-480位核苷酸为YN编码区，第480-492位核苷酸为连接肽编码区，第499-2130位核苷酸为TCF3蛋白编码区；融合蛋白YN-TCF的氨基酸序列为序列表中序列14，其中序列14自N末端第1-157位氨基酸残基为YN，第161-164位氨基酸残基为连接肽。第167-713位氨基酸残基为TCF3蛋白；[0087]组合四、β -cat-YC+YN-TCF:由融合蛋白β _cat_YN和融合蛋白YC-TCF组成；
[0088]融合蛋白β -cat-YC的氨基酸序列和核苷酸序列请见序列9和序列10。
[0089]融合蛋白YN-TCF的氨基酸序列和核苷酸序列请见序列13和序列14。
[0090]上述组合中，YC和YN可以互换，β -cat-YN+YC-TCF与β -cat-YC+YN-TCF结果无
显著差异。
[0091]1.2表达融合蛋白的重组载体组的获得
[0092]上述融合蛋白编码基因均通过PCR扩增，并利用酶切位点分别构建于pcDNA3.1-FLAG和pcDNA3.1-Myc载体(两个载体均记载在如下文献中:c-Cbl_MediatedNeddylation Antagonizes Ubiquitination and Degradation of the TGF-β Type IIReceptor molecular cell Volume49, Issue3, 7February2013, Pages499 - 510,公众可从清华大学获得)中，得到表达各融合蛋白的重组载体组合物，可原核表达出目的蛋白。
[0093]重组载体组合物具体如下:
[0094]组合一:重组载体pcDNA3.1-FLAG- β -cat-VC 和重组载体 pcDNA3.1-Myc-VN-TCF ；
[0095]重组载体pcDNA3.1-FLAG- β -cat-VC为将序列表中序列7所示的融合蛋白β -cat-VC编码基因插入pcDNA3.1-FLAG载体的BamH I和Kpn I酶切位点间得到表达β -cat-VC的载体；
[0096]重组载体pcDNA3.1-Myc-VN-TCF为将序列表中序列11所示的融合蛋白VN-TCF编码基因插入pcDNA3.1-Myc载体的Kpn I和Xba I酶切位点间得到表达VC-TCF的载体；
[0097]组合二:重组载体 pcDNA3.1-FLAG- β -cat-YC 和重组载体 pcDNA3.1-Myc-VN-TCF
[0098]重组载体pcDNA3.1-FLAG- β -cat-YC为将序列表中序列9所示的融合蛋白β -cat-YC编码基因插入pcDNA3.1-FLAG载体的BamH I和Kpn I酶切位点间得到表达β -cat-YC的载体；
[0099]组合三:重组载体pcDNA3.1-FLAG- β -cat-VC 和重组载体 pcDNA3.1-Myc-YN-TCF
[0100]重组载体pcDNA3.1-Myc-YN-TCF为将序列表中序列13所示的融合蛋白YN-TCF编码基因插入pcDNA3.1-Myc载体的Kpn I和Xba I酶切位点间得到的表达YN-TCF的载体；
[0101]组合四:重组载体pcDNA3.1-FLAG- β -cat-YC 和重组载体 pcDNA3.1-Myc-YN-TCF
[0102]重组载体pcDNA3.1-FLAG- β -cat-YC为将序列表中序列9所示的融合蛋白β -cat-YC编码基因插入pcDNA3.1-FLAG载体的BamH I和Kpn I酶切位点间得到表达β -cat-YC的载体；
[0103]β -cat-YC/VC+YN/VN-TCF的方式显示以上几种组合，BiFC系统克隆的载体结构如图3所示。
[0104]1.3鉴定BiFC融合蛋白的表达
[0105]I)鉴定各融合蛋白的表达及属性
[0106]在构建完融合蛋白克隆质粒后，需要对克隆表达以及可能的Wnt激活能力进行初步检测。
[0107]将上述获得的4组重组载体(每组设两个浓度梯度)中的每个重组载体分别与Super TOP-Flash (Super TOP-FI ash: Addgene, Plasmidl2456)、RL-TK-Reni I la (pRL-TK-Renil la: GenBank:AF025846.2)质粒共转染HEK293T细胞，再利用威格拉斯双荧光报告检测试剂盒计算相对荧光强度。该相对荧光强度可以显示对细胞内fct信号的激活作用。同时进行SDS-PAGE、免疫印迹检测共转染质粒后蛋白的表达情况。其中，阳性对照载体为将β -cat蛋白全长编码区序列15插入pcDNA3.1-FLAG载体的BamH I和Xba I酶切位点间得到的载体。
[0108]相对荧光 强度部分结果如图4B所示:
[0109]VN-TCF 为重组载体 pcDNA3.l-FLAG-VN-TCF 与 Super TOP-Flash,pRL-TK-Renilia质粒共转染HEK293T细胞，表达约80KD大小的与其目的蛋白；
[0110]YN-TCF 为重组载体 pcDNA3.l-FLAG-YN-TCF 与 Super TOP-Fl ash, pRL-TK-Ren ilia质粒共转染HEK293T细胞，表达约80KD大小的与其目的蛋白；
[0111]β-cat-YC 为重组载体 pcDNA3.1-FLAG-β-cat-YC 与 Super TOP-Flash、pRL-TK-Renilla质粒共转染HEK293T细胞，表达82.5KD大小的与其目的蛋白；
[0112]β-cat-VC 为重组载体 pcDNA3.1-FLAG-β-cat-VC 与 Super TOP-Flash、pRL-TK-Renilla质粒共转染HEK293T细胞，表达约83KD大小的与其目的蛋白；
[0113]β -cat-WT 为对照载体与 Super TOP-Fl ash, pRL-TK-Ren ilia 质粒共转染 HEK293T细胞，表达约90KD大小的与其目的蛋白。
[0114]可以看出，融合蛋白可以表达且其蛋白大小符合预期。由相对荧光强度显示的Wnt信号激活情况表明，TCF融合蛋白不具有Wnt信号的激活能力，相比于全长的β-catenin，β -cat Δ C融合蛋白具有较弱的激活能力。
[0115]2)鉴定转基因细胞系共表达融合蛋白组合物
[0116]将每个重组载体组合中的重组载体分别按照质量比为1:1瞬时转染ΗΕΚ293Τ细胞(ATCC, #CRL-3216):
[0117]HEK293T/ β -cat-VC+VN-TCF:转染重组载体 pcDNA3.1-FLAG- β -cat-VC 和重组载体 pcDNA3.1-Myc-VN-TCF ；
[0118]HEK293T/β-cat-YC+VN-TCF:转染重组载体 pcDNA3.1-FLAG-β -cat-YC 和pcDNA3.1-Myc-VN-TCF ；
[0119]HEK293T/ β -cat-VC+YN-TCF:转染重组载体 pcDNA3.1-FLAG- β -cat-VC 和重组载体 pcDNA3.1-Myc-YN-TCF ；
[0120]HEK293T/ β -cat-YC+YN-TCF:转染重组载体 pcDNA3.1-FLAG- β -cat-YC 和重组载体pcDNA3.1-Myc-YN-TCF0
[0121]置于荧光显微镜下(425~475nm激发，485~535nm观察)进行观察，以及组合三β -cat-VC+VN-TCF为例，结果如图4A所示，可以观察到细胞核中的BiFC荧光信号。
[0122]其中，在37°C培养条件下，转染载体组合一、二、四的细胞均可以形成BiFC荧光；将转染载体组合三的HEK293T/ β -cat-YC+YN-TCF在30°C培养4小时，在荧光显微镜下也可以检测到BiFC荧光。
[0123]从上述可以看出，四种载体组合转染后细胞均可以检测到定位于细胞核中的BiFC荧光信号，表明四种融合蛋白组合及其对应的四种载体组合物均可以用于BiFC系统的显示，可用于可视化观察fct在细胞中的活性状态。
[0124]3) β -cat-TCF BiFC荧光特异性的鉴定
[0125]pcDNA3.1-FLAG-β-cat-VC 质粒分别与 pcDNA3.l-Myc-YN-TCF Λ NLS、pcDNA3.l-Myc-YN-TCF Δ N质粒被瞬时转染入HeLa细胞，在荧光显微镜下进行观察。[0126]重组载体pcDNA3.l-Myc-YN-TCF Δ NLS为将核苷酸序列为序列16的YN-TCF Δ NLS编码基因插入pcDNA3.1-Myc载体的Kpn I和Xba I位点得到的载体。
[0127]重组载体pcDNA3.1-Myc-YN-TCF Δ N为将核苷酸序列为序列17的YN-TCF Δ N编码基因插入pcDNA3.1-Myc载体的Kpn I和Xba I位点得到的载体。
[0128]结果如图5所示，可以看出，缺失C端核定位信号的TCF(TCF3 ANLS)与β -catenin共表达时，可以观察到BiFC荧光信号但信号定位于细胞质中，显示TCF的细胞定位决定了 BiFC荧光信号的定位。当缺失N端β-catenin结合区的TCF (TCF3 Λ N)与β -catenin共表达时，则观察到明显减弱的BiFC荧光或几乎观察不到荧光信号。这些结果显示BiFC荧光信号特异来自于β -catenin-TCF复合体，并且β -catenin-TCF-BiFC系统可以特异显示该蛋白复合体的细胞定位。
[0129]4) β -cat-VC+YN-TCF 为 BiFC 观察的最优组合
[0130]重组载体pcDNA3.1-Myc-VN-TCF Δ N被构建用于帮助鉴定BiFC观察的最优组合，其为将核苷酸序列为序列18的VN-TCFΛN编码基因插入pcDNA3.1-Myc载体的Kpn I和XbaI位点得到的载体。
[0131]在质粒瞬时转染条件下，分别过表达了 4个组合的质粒及其对应含有TCF Λ N的对照组合，并对比BiFC荧光形成的差异来显示系统特异性。质粒组合及图中的指示方法如下:
[0132](I) β -cat-VC+VN-TCF,图中表示为 β-VC+VN-T，其对照组合为β -VC+VN-TCF3ΔN(VN-TΔN)
[0133](2) β -cat-YC+VN-TCF,图中表示为 β-YC+VN-T，其对照组合为β -YC+VN-TCF3ΔN(VN-TΔN)
[0134](3) β -cat-VC+YN-TCF,图中表示为 β-VC+YN-T，其对照组合为β -VC+YN-TCF3ΔN(ΥΝ-Τ ΔN)
[0135](4) β -cat-YC+YN-TCF,图中表示为 β-YC+YN-T，其对照组合为β -YC+YN-TCF3ΔN(ΥΝ-Τ ΔN)
[0136]结果如图6Α显不，组合一、二有少量本底水平的突光形成,表现在其相应的对照组合在瞬时转染条件下仍能检测到少量荧光，但明显减弱，因而具有一定特异性；而组合四的本底水平在正常温度条件(图6Α)以及低温诱导条件下均不能被检测到(图6Β)，故具有相对更高的特异性；组合三则兼具以上几种组合的特点，荧光明亮，且既不需要低温诱导又具有较高特异性。因此，最优的融合蛋白组合为β-cat-VC+YN-TCF组合，用其进行后续实验。
[0137]2、融合蛋白组合物β -cat-VC+YN-TCF在筛选影响Wnt信号通路的新基因中的应用
[0138]GSK3 β可以通过磷酸化,导致β-catenin降解,E-cadherin可以与TCF竞争结合β -catenin。
[0139] 重组载体pCS2+-GSK3 0将GSK30编码基因(序列19)插入pCS2+(记载在如下文献中:Rupp, R.A.W.，Snider，L，and Weintraubj H.(1994).Xenopus embryos regulate thenuclear localization of XMyoD.Genes and Developments: 1311-1323.，公众可从清华大学获得)表达载体的Xho I和Xba I位点间。[0140]重组载体pCS2+-E_cadherin将E-cadherin编码基因(序列20)插入pCS2+表达载体的BamH I和EcoR I位点间。
[0141]将pCS2+、pCS2+-GSK3 β 和 pCS2+-E_cadherin 分别与 β -cat-VC+YN-TCF 组合共转，并进行荧光显微镜检测，结果如图7左图所示。
[0142]pCS2+ 为将 pCS2+ 转染 HEK293T/ β -cat-VC+YN-TCF 得到的转基因细胞；
[0143]GSK3 β 为将 pCS2+-GSK3 β 转染 ΗΕΚ293Τ/ β -cat-VC+YN-TCF 得到的转基因细胞；
[0144]E-cadherin 为将 pCS2+-E_cadherin 转染 HEK293T/ β -cat-VC+YN-TCF 得到的转基因细胞。
[0145]以将 pCS2+ (pCS2+)、pCS2+_GSK3 β (GSK3 β )和 pCS2+-E_cadherin (E-cadherin)分别转染HEK293T细胞进行荧光显微镜检测作为对照，以HEK293T/ β -cat-VC+YN-TCF为对照，结果如图7右图所示。
[0146]HEK293T/ β -cat-VC+YN-TCF 和 pCS2+-E_cadherin (E-cadherin)转染 HEK293T 细胞结果无显著差异。可以看出，作为对照，GSK3 β和E-cadherin的过表达并不影响转染的GFP质粒产生的荧光信号；BiFC荧光系统可以反应β -catenin蛋白水平的变化；加入β -cat-VC+YN-TCF组合载体后，GSK3 β和E-cadherin产生的BiFC荧光信号低于不加。
[0147]经过GSK3 0编码基因或E-cadherin编码基因处理后的转基因细胞比不加入这些小分子物质 的转基因细胞 HEK293T/ β -cat-VC+YN-TCF 或 pCS2+-E_cadherin (E-cadherin)转染HEK293T细胞的BiFC荧光信号弱，表明GSK3 β编码基因和E-cadherin编码基因均为影响fct信号通路的基因，具体作用是抑制细胞内Wnt信号。
[0148]上述结果表明，载体组合物可以用来筛选、鉴定影响Wnt信号通路的基因，可以影响β -catenin和TCF定位、蛋白水平、或者影响两个蛋白相互作用的新基因，都有可能通过本发明的载体组合物加入后BiFC荧光的变化显示出来。
[0149]3.融合蛋白组合物β -cat-VC+YN-TCF在筛选影响Wnt信号通路的小分子中的应用
[0150]3.1共表达融合蛋白组合物β -cat-VC+YN-TCF转基因细胞系的获得
[0151]选择在稳定表达tTA的HeLa细胞(HeLa_tTA)中构建表达系统。同时，考虑到两个相互结合的融合蛋白最好表达量相似，以获得最好的互作效果，PBI表达载体被尝试使用。pBI载体带有一个响应四环素(doxycycline, dox)调控的启动子,可以双向驱动基因表达。β -cat-YC/VC和YN/VN-TCF被分别克隆在该启动子的上下游，在四环素控制转录因子tTA或者rtTA存在下，可实现对两者的诱导表达。pBI载体也被进行了适当改造。核糖体内部进入位点(internal ribosome entry site, IRES)被引入连接融合突光蛋白和抗性筛选基因Nec/，该序列可以保证在一条转录本上存在两个开放阅读框。由于靠近下游的开放阅读框更易丢失，因而该策略一定程度上保证了上游融合蛋白表达细胞系的筛选成功几率。除了抗性筛选这一指标，BiFC荧光的产生，也可以作为细胞系筛选过程中的第二个必要指标。
[0152]具体如下:
[0153]重组载体pB1-FLAG-β -cat-VC为将序列表中序列7所示的融合蛋白β -cat-VC编码基因插入pBI载体(clontech，#631006)的NotI和Sal I酶切位点间得到表达β -cat-VC的载体；
[0154]重组载体pB1-Myc-YN-TCF为将序列表中序列13所示的融合蛋白YN-TCF编码基因插入pBI载体的Nhe I和EcoR V酶切位点间得到表达YN-TCF的载体。
[0155]具体克隆构建策略如图8所示。
[0156]将重组载体pB 1-FLAG-β-cat-VC 和 pB 1-My c-YN-TCF 共同瞬时转染HeLa-tTA (clontech, #631156)细胞，两天后在培养基中加入G418进行筛选，三周成功筛选到 β -cat/TCF BiFC 稳转细胞系 HeLa-BiFC#4_l 和 HeLa-BiFC#4_2。
[0157]将重组载体pB1-venus所示的venus核苷酸序列(序列5)插入pBI的NotI和Sal I酶切位点间得到的载体转染HeLa-tTA细胞，两天后在培养基中加入G418进行筛选，三周成功筛选到稳转细胞系HeLa-venus,作为对照细胞系。
[0158]将HeLa-BiFC#4-l、HeLa-BiFC#4_2 和 HeLa-venus 进行免疫印迹实验，结果如图9所示，可以看出，检测到正确大小的外源蛋白的诱导表达，表明，HeLa-BiFC#4-1、HeLa-BiFC#4-2可以稳定表达融合蛋白组合物β -cat-VC (约83KD)以及YN-TCF (约80KD)。
[0159]3.2融合蛋白组合物β -cat-VC+YN-TCF在筛选影响Wnt信号通路的小分子中的应用
[0160]以下示例中利用多种已知小分子处理β -cat/TCF BiFC稳转细胞系，测试其对Wnt信号通路活性状态变化的响应。
[0161]用Wnt 信号的激活剂 LiCl (20mM)、BIO (I μ Μ)、Wnt 抑制剂 NC043 (7.5 μ Μ)和对照试剂DMSO处理细胞，具体如下:
[0162]将HeLa-BiFC 细胞系 HeLa-BiFC#4_l、HeLa-BiFC#4_2、HeLa-venus 分别在含有终浓度为20mM的LiCl、含有终浓度为I μ M BIO、含有终浓度为20mM LiCl和7.5 μ M NC043的MS培养基和含有同体积DMSO的MS培养基(作为不处理对照)中培养24小时。
[0163]荧光显微镜检测，结果如图10所示，左边的3列显示细胞系分别加入Wnt信号激活剂LiCl、BIO处理，BiFC信号的变化情况以及明场下的细胞状态；LiCl、BIO的处理可导致β -cat-TCF-BiFC荧光增强、阳性细胞增多。
[0164]右边的3列显示细胞系分别加入Wnt信号激活剂LiCl以及在此基础上同时加入Wnt抑制剂NC043处理后，BiFC信号的变化情况以及明场下的细胞状态。Wnt抑制剂NC043的同时处理可以减弱β -cat-TCF-BiFC荧光信号。
[0165]经过小分子LiCl、BIO处理后的转基因细胞比不加入这些小分子物质的转基因细胞的BiFC荧光信号增强，表明LiCl、BIO均为影响Wnt信号通路的物质，具体作用是激活细胞内Wnt信号。而将NC043加入经过小分子LiCl处理后的转基因细胞后，其荧光信号减弱，表明NC043为影响Wnt信号通路的基因，具体作用是抑制细胞内Wnt信号。
[0166]进一步表明，融合蛋白组合物β-cat-VC+YN-TCF可用于筛选影响Wnt信号通路小分子药物如LiCl、BIO和NC043。
[0167]3.3融合蛋白组合物β -cat-VC+YN-TCF在筛选影响Wnt信号通路的病毒中的应用
[0168]目前，研究表明SRSFl (图中简称为SR)蛋白可以促进β-catenin蛋白的翻译。
[0169]SRSFl 蛋白(NP_001071634，PRI11-MAY-2014)过表达病毒的获得是通过 SRSFl 蛋白编码基因通过pLent1-BSD载体导入293FT细胞中(Life Technologies, #R700-07)，包装得到SRSFl蛋白过表达病毒。
[0170]以空载体pLent1-BSD(0RIGENE，#PS100082)转入细胞，得到对照病毒(controlvirus)ο[0171]将SR蛋白过表达病毒(SRvirus)和对照病毒(control virus)分别感染β-cat/TCF BiFC稳转细胞系细胞HeLa-BiFC#4-l，用相应抗生素处理一周，纯化病毒感染后的细胞，最后观察BiFC荧光信号。以不加任何病毒处理的HeLa-BiFC#4-l为对照。
[0172]结果如图11所示，左图为荧光图，可以看出，SR蛋白过表达后可以明显促进稳转细胞系中BiFC荧光的形成；
[0173]右图为BiFC阳性细胞统计图，可以看出，SR蛋白过表达后可以明显促进稳转细胞系中BiFC荧光的形成，表现在BiFC阳性细胞比率增高；
[0174]不加任何病毒处理的β -cat/TCF BiFC稳转细胞系细胞HeLa-BiFC#4_l结果和对照病毒(control virus)分别感染β-cat/TCF BiFC稳转细胞系细胞HeLa-BiFC#4_l的结
果无显著差异。
[0175]上述结果表明，经过SRSFl蛋白过表达病毒处理的β-cat/TCF BiFC稳转细胞系细胞HeLa-BiFC#4-l的BiFC荧光信号比不经病毒处理的β -cat/TCF BiFC稳转细胞系细胞HeLa-BiFC#4-l强，表明，SR蛋白及过表达该蛋白的病毒为影响Wnt信号通路的基因，具体作用是促进细胞内Wnt信号。上述结果表明，融合蛋白组合物β-cat-VC+YN-TCF可用于筛选影响Wnt信号通路 的病毒或蛋白。
【权利要求】
1.一种用于检测细胞内Wnt信号活性状态的融合蛋白组，由融合蛋白A和融合蛋白B组成: 所述融合蛋白A包括β-catenin的C端缺失片段和位于其C段的荧光蛋白片段A ; 所述融合蛋白B包括转录因子TCF和位于其N段的荧光蛋白片段B ； 所述β -catenin的C端缺失片段为β -catenin蛋白氨基酸序列N末端起第2-667个氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白组，其特征在于: 所述融合蛋白A从N端起依次由所述β -catenin的C端缺失片段、连接肽和突光蛋白片段A组成； 所述融合蛋白B从N端起依次由所述转录因子TCF、连接肽和荧光蛋白片段B组成； 所述荧光蛋白片段A和所述荧光蛋白片段B来源于同一个荧光蛋白或不同荧光蛋白。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白组，其特征在于:
所述TCF为TCF1、TCF2、TCF3、TCF4或其转录变体。 所述连接肽的氨基酸序列为序列表中序列2 ； 所述荧光蛋白为EYFP和/或Venus荧光蛋白； 所述荧光蛋白片段A为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第155-238位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第159-238位氨基酸； 所述荧光蛋白片段B为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第1-173位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第1-158位氨基酸。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白组，其特征在于: 所述融合蛋白A从N端起依次由所述β -catenin的C端缺失片段、连接肽和突光蛋白片段A组成；所述荧光蛋白片段A为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第155-238位氨基酸；所述融合蛋白B从N端起依次由所述转录因子TCF3、连接肽和荧光蛋白片段B组成；所述荧光蛋白片段B为EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第1-158位氨基酸； 所述融合蛋白A的氨基酸序列具体为序列表中的序列8 ； 所述融合蛋白B的氨基酸序列具体为序列表中的序列14。
5.DNA分子组，其由编码融合蛋白A的DNA分子A和编码融合蛋白B的DNA分子B组成，所述DNA分子A的核苷酸序列为序列表中序列7 ;所述DNA分子B的核苷酸序列为序列表中序列13。
6.重组载体组，由表达融合蛋白A的重组载体和表达融合蛋白B的重组载体组成； 所述表达融合蛋白A的重组载体为将所述编码融合蛋白A的DNA分子插入表达载体得到的载体。 所述表达融合蛋白B的重组载体为将所述编码融合蛋白B的DNA分子插入表达载体得到的载体。
7.—种转基因细胞系，为将所述表达融合蛋白A的重组载体和所述表达融合蛋白B的重组载体共同导入宿主细胞中得到的细胞系。
8.权利要求1-4中所述融合蛋白组、权利要求5所述的DNA分子组、权利要求6所述的重组载体组或权利要求7所述的转基因细胞系在利用BiFC检测影响细胞Wnt信号的物质中的应用；或权利要求1-4中所述融合蛋白组、权利要求5所述的DNA分子组、权利要求6所述的重组载体组或权利要求7所述的转基因细胞系在利用BiFC检测细胞中Wnt活性状态中的应用。
9.一种利用BiFC检测或鉴定影响细胞内Wnt信号的物质的方法，包括如下步骤: 将小分子物质作用权利要求7所述的转基因细胞系，检测处理后的转基因细胞系， 若处理转基因细胞系的BiFC荧光信号比处理前转基因细胞系强，则所述小分子物质为激活细胞内fct信号的物质； 若处理转基因细胞系的BiFC荧光信号比处理前转基因细胞系弱，则所述小分子物质为抑制细胞内fct信号的物质； 所述小分子物质具体为导致TCF缺失的干扰RNA、GSK3 β , E-cadherin、LiCl、BIO、NC043 或 SRSFl 蛋白。
10.一种用于检测细胞内Wnt信号活性状态的方法，将所述表达融合蛋白A的重组载体和所述表达融合蛋白B的重组载体共同导入宿主细胞，得到转基因细胞，观察转基因细胞，若有荧光产生，表明激活细胞中的fct信号，若无荧光产生，表明未激活细胞中的Wnt信号，实现可视化观察细胞中的Wnt信号活性状态或变化。
【文档编号】C12N15/62GK104004098SQ201410234150
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】吴畏, 丁雅洁, 汤玮欣 申请人:清华大学