用番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法

用番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法
【专利摘要】一种番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，由番茄prosystemin基因克隆、构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体、制备含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的根癌农杆菌菌株、制备转基因丹参植株步骤组成。将番茄prosystemin基因转入丹参植株，干涉了丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因，抗虫性明显高于野生丹参，生长100天转基因的丹参根中，迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮IIA含量，分别是同时期非转化丹参根中迷迭香酸和丹酚酸B和丹参酮IIA的1.31倍、1.69倍、2.62倍。
【专利说明】用番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程【技术领域】，具体涉及到在丹参中引入并表达番茄原系统素基因的方法。
【背景技术】
[0002]丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)为唇形科(Labiatae)鼠尾草属多年生草本植物，以其根及根茎入药，为我国常用大宗药材之一。丹参的主要活性成分为脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类，具有活血化瘀，通经止痛，清心除烦等功能，在临床上被广泛用于心脑血管疾病、癌症以及各种炎症的治疗。伴随着丹参原药材需求量的日益扩大和规范化种植的需求，培育活性成分含量高的优良丹参新品种已成为丹参原药材生产中亟待解决的关键问题之一。最初从丹参中分离出来的水溶性成分是丹参素，它能抗血小板聚集，具有抗血栓形成、促进纤维蛋白降解以及抗心肌缺血的功效。此外，丹酚酸也是丹参水溶性成分里面重要的一类，总丹酚酸不仅对心、脑、肝、肾等器官的损伤都有保护作用，其中丹酚酸B也作为目前已知抗氧化作用最强的天然产物之一，在体内发挥着清除自由基、提高机体抗氧化能力等重要生理作用。丹酚酸B也是《中华人民共和国药典》(2010年版)规定的丹参药材质量控制的水溶性指标性成分之一。
[0003]丹参中代表性成分丹参酮IIA参与了多种生化反应表现出天然抗氧化、抗肿瘤、抗菌消炎等生物活性。通过抑制肿瘤细胞增、诱导肿瘤细胞凋亡等机制实现其抗肿瘤作用；通过扩张血管、改善微循环、抗血栓形成等作用清除氧自由基、改善能量代谢、改善心脑血管功能。所以丹参酮作为抗肿瘤、抗菌抗炎和改善心脑血管功能等方面都具有较好的临床应用前景。
[0004]随着丹参有效成分及其药理活性的深入研究，近年来以丹参为主要原料的药品、制剂、化妆品和系列保健产品层出不穷，丹参资源供不应求。伴随着丹参药材需求的日益扩大和野生资源的逐渐减少，人工种植面积逐年增大。然而作为常异交植物，丹参种内变异较大，性状复杂。栽培丹参只种不选的状况使得各产地丹参质量参差不齐，品种退化严重，有效成分含量不稳定，成为丹参作为高品质植物药计入国际市场的最大障碍之一。提高丹参中有效成分，尤其是迷迭香酸和丹酚酸B的含量，培育优异的丹参资源具有重要意义。
[0005]由于人工栽培条件下药田生态环境中生物多样性差、物种丰富度低，导致丹参病虫害优势种群突出、病虫害频发，棉铃虫、线虫以及丹参根腐病等已成为严重威胁丹参药材品质，严重影响了药材的产量和质量，导致丹参减产和市场供求不稳定的现象。目前治理病虫害仍采用喷洒杀虫剂，不仅造成了药材的化学物质残留也对环境造成了一定程度的影响。这些问题已经突出地暴露在中药材产业化发展中，成为中药丹参药材产业发展的瓶颈。
[0006] 解决丹参病虫害的问题，人们做出了很多的试探和努力。近年来利用基因工程、细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良以提高其有效成分的含量愈来愈受到人们的重视。在诸多方法中，利用基因工程技术对药用植物次生代谢途径的遗传特性进行改造，提高药用植物有效成分含量，培育能够大量积累目标次生代谢物的新品种，愈来愈受到人们的关注。以转基因技术为核心的现代分子育种技术在改良药用植物、丰富中药资源、提高抗病性和抗逆性、培养高天然药物含量的新型转基因药材有广泛的应用前景。但目前利用转基因技术提高丹参抗虫性的技术未见报道。在已有的采用转基因方法提高丹参药用成分的技术中，仅局限在转入外源基因提高丹参的酚酸类成分含量，而利用基因操作的手段引入外源基因提高代谢源头物质流合成并同时削弱该物质向其他竞争旁路流失，利用这种“开源节流”的原则对代谢途径进行调控，从而提高了丹参酚酸类和丹参酮类成分含量的技术方法尚无报道。

【发明内容】

[0007]本发明所要解决的技术问题在于克服上述技术的不足，提供一种抗虫性高、活性成分含量高的用番茄基因和干涉丹参内源基因提高丹参抗虫性和活性成分的方法。
[0008]解决上述技术问题所采用的技术方案是由下述步骤组成:
[0009]1、番爺 prosystemin 基因克隆
[0010]利用OMEGA公司E.Z.N.A.? Plant RNA Kit提取试剂盒，按照说明书分离提取番爺总RNA,用Takara公司PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒,按照说明书将番爺总RNA反转录成cDNA备用；采用Primer Premier5.0软件，设计番爺prosystemin基因编码框的上游引物、下游引物，以番茄cDNA为模板，进行聚合酶链式反应，反应体系为:以番茄cDNA为模板，进行聚合酶链式反应，反应体系为:取番茄cDNA与DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTP、上游引物、下游引物、二次蒸馏水的体积比为1:0.5:5:5:1:1:37.5，按照如下条件反应:95°C 3分钟，95°C 30秒、57°C 30秒、72°C 45秒、循环35次，得到番茄prosystemin基因，并在番爺prosystemin基因的上游引物前引入Spe I限制性酶切位点和保护碱基GACTAGT，在下游引物前引入BstE II限制性酶切位点和保护碱基CAGGGTAACC，用番爺prosystemin基因引物:
[0011]上游引物prosystemin-F5' -GACTAGTATGGGAACTCCTTCATATGATATC-3'、
[0012]下游引物prosystemin-RS' -CAGGGTAACCCGTTTGTCTGTTATTATTTGAG-3'、
[0013]以番茄cDNA为模板，按下述反应体系进行混合:番茄cDNA与DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTP、prosystemin-F、prosystemin_R、二次蒸懼水的体积比为 2:0.5:5:5:1:1:36.5，并按照95 °C 3分钟，95°C 30秒、57 °C 30秒、72°C 45秒、循环35次，进行聚合酶链式反应扩增，得含有酶切位点的番茄prosystemin基因，获得的扩增产物进行电泳分离，回收扩增产物与PMD19-T载体(购于宝生物工程大连有限公司)用T4DNA连接酶(购于宝生物工程大连有限公司)按连接酶使用说明书连接，构成prosystemin-pMD19-T载体并采用热激转化法转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，prosystemin-pMD19-T载体与大肠杆菌DH5 α的体积比为1:9.5~10.5，挑选所得阳性克隆，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到番爺prosystemin基因序列，该基因序列如下:
[0014]atgggaactc cttcatatga tatcaaaaac aaaggagatg acatgcaaga 50
agaaccaaag gtgaaacttc accatgagaa gggaggagat gaaaaggaaa 100
aaataattga aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaagatacc 150
atctcttcat atgttttaag agatgataca caagaaatac caaagatgga 200
acatgaggag ggaggatatg taaaggagaa aattgttgaa aaggagacta 250
tatcccaata tatcatcaag attgaaggag atgatgatgc acaagaaaaa 300
ctaaaggttg agtatgagga ggaagaatat gaaaaagaga aaatagttga 350
aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaaggagat gatgcacaag 400
aaaaaccaaa ggtggaacat gaggaaggag atgacaaaga gactccatca 450
caagatatca tcaagatgga aggggagggt gcactagaaa taacaaaggt 500
ggtatgtgag aaaattatag tacgagaaga tcttgctgtt caatcaaaac 550
ctccatcaaa gcgtgatcct cccaaaatgc aaacagacaa taataaactc 600
[0015]2、构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体
[0016]用Spe I和BstE II分别双酶切prosystemin-pMD19_T载体、植物表达载体pCAMBIA-1302，分别回收prosystemin基因片段和pCAMBIA-1302双酶切后的酶切产物，将片段与产物用T4DNA连接酶连接，筛选，获得pCAMBIA-1302-prosystemin中间载体；
[0017]选取位于丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因，简称C0MT，编码区3'端345bp的片段作为RNA干涉的靶片段，在该片段分别引入酶切位点Cla Ι/Κρη I及Xho I/BamH I，应用Primer Prime5.0设计扩增引物:
[0018]i COMT-F: 5' -CCATC GAT GGTACCACCCTCCCCGACGGCGGCGTCCA-3'
[0019]iCOMT-R:5/ -GCTCTAGACTCGAG GGATCCCACACCACCTACAACCACCTCCT-3'；
[0020]用聚合酶链式扩增反应，将该345bp的上游引入Cla I和Kpn I两个酶切位点，于其下游引入Xho I和BamH I两个酶切位点；经聚合酶链式扩增反应扩增，得含有Cla I/KpnI 及 Xho I/BamH I 的产物 COMTi，连接 p_MD19T 载体得 C0MTi_pMD19T 载体；用 Xho I 和 Kpn
I分别酶切 C0MT1-pMD19T 载体、pKannibal 载体，将用 Xho I,KpnI 酶切 C0MTi_pMD19T 载体的片段与经Xho 1、Kpn I酶切pKannibal载体的片段,用DNA连接酶相连成pKannibal+中间载体；用BamH I和Cla I分别酶切C0MTi_pMD19T载体、pKannibal+载体，用含有BamH I和Cla I酶切C0MT1-pMD19T载体的片段与经BamH I和Cla I酶切pKannibal+的片段用DNA连接酶相连，获得的新载体为pKANNIBAL/COMTi。
[0021]用Sac I 和 Pst I 双酶切 pKANNIBAL/COMT1、pCAMBIA1302_prosystemin载体，将双酶切pKANNIBAL/COMTi所获得的干涉转录框，连接到经双酶切后的pCAMBIA1302-prosystemin 载体上，得 pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/C0MTi载体，并转入大肠杆菌DH5ci中进行扩增，提取质粒，用酶切方法进行鉴定，得到含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/C0MTi，命名为 pCPKC 载体。
[0022]3、制备含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的根癌农杆菌菌株
[0023]将pCPKC载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，采用液氮冻融法进行转化，转化后的产物于27.5 °C~28.5 °C培养箱中倒置培养36~72小时，挑取抗性单菌落分别用prosystemin基因特异性引物prosystemin-F和prosystemin基因特异性引物prosystemin-R进行聚合酶链式反应,筛选,用pCPKC载体上特异性引物,序列为:
[0024]35S-F5' -TACAAAGGCGGCAACAAACG-3'
[0025]35S-R5' -GCAATGGAATCCGAGGAGGT-3'
[0026]进行聚合酶链式反应，筛选，获得含有pCPKC载体的根癌农杆菌菌株。
[0027]4、制备转基因丹参植株
[0028]采用常规组织培养方法获得无菌丹参试管苗，采用叶盘转化法，将含有pCPKC载体的根癌农杆菌与无菌丹参试管苗进行浸染，获得含有番茄prosystemin基因并且干涉丹参内源咖啡酰-O-甲基转移酶基因的丹参植株。
[0029]在本发明的构建含有番爺prosystemin基因和丹参咖啡酰_0_甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的步骤2中，所述的用Spe I和BstE II双酶切prosystemin-pMD19_T 载体、植物表达载体pCAMBIA-1302 为:取含有 prosystemin-pMD19-T载体、IOXM Buffer、限制性内切酶Spe 1、限制性内切酶BstE I1、二次蒸馏水于37 °C反应2小时20分钟，限制性内切酶Spe I与限制性内切酶BstE IIUOXM Buffer、含有prosystemin-pMD19-T载体、二次蒸懼水的体积比为1:1:2:6:10 ;取植物表达载体PCAMBIA-1302U0XM Buffer、限制性内切酶Spe 1、限制性内切酶BstE I1、二次蒸馏水于37°C反应3小时，限制性内切酶Spe I与限制性内切酶BstE IIUOXM Buffer、植物表达载体pCAMBIA-1302、二次蒸馏水的体积比为I:1:2:6:10。
[0030]在本发明的构建含有番爺prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的步骤2中，所述的用Xho I和Kpn I分别酶切C0MT1-pMD19T载体、pKannibal载体为:取C0MT1-pMD19_T载体、10XM Buffer、限制性内切酶Xho 1、限制性内切酶Kpn 1、二次蒸馏水，37°C反应2小时40分钟，限制性内切酶Xho I与限制性内切酶Kpn
1、10XMBuffer、C0MT1-pMD19-T 载体、二次蒸馏水的体积比为 I:1:2:6:10 ;取 pKannibal载体、IOXM Buffer、限制性内切酶Xho 1、限制性内切酶Kpn 1、二次蒸馏水，37°C反应2小时40分钟，限制性内切酶Xho I与限制性内切酶Kpn IUOXM Buffer、pKannibal载体、二次蒸馏水的体积比为1:1:2:6 =IO0
[0031]在本发明的构建含有番爺prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的步骤2中，所述的用BamH I和Cla I分别酶切C0MTi_pMD19T载体、pKannibal+载体为:取含有C0MTi_pMD19T载体、10XK Buffer、限制性内切酶Cla 1、限制性内切酶BamH 1、二次蒸馏水，37°C反应2小时30分钟，限制性内切酶Cla I与限制性内切酶BamH IUOXK Buffer、C0MT1-pMD19_T载体、二次蒸馏水的体积比为I:1:2:6:10 ；取pKannibal+载体、10XK Buffer、限制性内切酶Cla 1、限制性内切酶BamH 1、二次蒸馏水，37°C反应2小时30分钟，限制性内切酶Cla I与限制性内切酶BamH IUOXK Buffer、pKannibal+载体、二次蒸懼水的体积比为1:1:2:6:10。
[0032] 在本发明的构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰_0_甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的步骤2中，所述的用Sac I和Pst I双酶切pKANNIBAL/COMT1、pCAMBIA1302-prosystemin 载体为:取 pKANNIBAL/COMTi 载体、10XM Buffer、限制性内切酶Sac 1、限制性内切酶Pst 1、二次蒸馏水，37°C反应3小时，限制性内切酶Sac 1、限制性内切酶Pst 1、10XMBuffer、pKANNIBAL/C0MTi 载体、二次蒸馏水的体积比为 I:1:2:6:10 ;取pCAMBIA-1302-prosystemin载体、10XM Buffer、限制性内切酶Sac 1、限制性内切酶Pst 1、二次蒸馏水于37°C反应3小时，限制性内切酶Sac I与限制性内切酶Pst 1、10XM Buffer、pCAMBIA1302_prosystemin 载体、二次蒸懼水的体积比为 1:1:2:6:10。
[0033]本发明将番茄prosystemin基因转入丹参植株，干涉了丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因，筛选获得了抗虫性明显高于野生丹参，转基因丹参酚酸类含量显著提高。在生长100天的转基因的丹参干燥根中，迷迭香酸的含量为16.96±0.90mg/g、丹酹酸B的含量达57.64±1.94mg/g、丹参酮IIA含量为2.04±0.19mg/g，分别是同时期非转化普通丹参干燥根中迷迭香酸(12.90±0.48mg/g)、丹酚酸B(34.04±0.89mg/g)、丹参酮ΙΙΑ(0.78±0.llmg/g)的1.31倍、1.69倍、2.62倍。为提高丹参中各类有效成分含量提供了一种新方法，可在丹参的培育中推广使用。
【专利附图】

【附图说明】
[0034]图1是检测转基因丹参植株中番茄prosystemin基因表达量图。
[0035]图2是检测转基因丹参植株中丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因表达量图。
[0036]图3是棉铃虫噬咬3天后转基因丹参株系2与野生丹参叶片受损程度的实验照片。
[0037]图4是高效液相色谱测定野生丹参和转基因丹参株系2中活性成分含量的色谱图。
[0038]图5是野生丹参和转基因丹参株系2中活性成分含量图。
【具体实施方式】
[0039]下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
[0040]实施例1
[0041]本实施例用番茄基因和丹参内源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法步骤如下:
[0042]1、番爺 prosystemin 基因克隆
[0043]利用OMEGA公司E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit提取试剂盒，按照说明书分离提取番爺总RNA,用Takara公司PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒,按照说明书将番爺总RNA反转录成cDNA备用；采用Primer Premier5.0软件,设计番爺prosystemin基因编码框的上游引物、下游引物，以番茄cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。反应体系为:番茄cDNAly 1、DNA聚合酶0.5μ 1、DNA聚合酶缓冲液5μ l、dNTP5y 1、上游引物1μ 1、下游引物I μ 1、二次蒸馏水37.5 μ 1，按照如下条件反应:95°C 3分钟，95°C 30秒、57。。30秒、72。。45秒、循环35次,得到番爺prosystemin基因，并在番爺prosystemin基因的上游引物前引入Spe I限制性酶切位点和保护碱基GACTAGT，在下游引物前引入BstE II限制性酶切位点和保护碱基CAGGGTAACC，用番茄prosystemin基因引物:
[0044]上游引物prosystemin-F5' -GACTAGTATGGGAACTCCTTCATATGATATC-3'
[0045]下游引物prosystemin-RS' -CAGGGTAACCCGTTTGTCTGTTATTATTTGAG-3'
[0046]以番茄cDNA为模板，按下述反应体系进行混合:番茄cDNA2y 1、DNA聚合酶
0.5 μ 1、DNA 聚合酶缓冲液 5 μ 1、dNTP5 μ 1、prosystemin-Fl μ 1、prosystemin-Rl μ 1、二次蒸馏水36.5 μ 1，并按照95°C 3分钟，95°C 30秒、57°C 30秒、72°C 45秒、循环35次，进行聚合酶链式反应扩增，得含有酶切位点的番茄prosystemin基因，获得的扩增产物进行电泳分离，用OMEGA公司E.Z.N.A.TM GelExtraction Kit试剂盒回收扩增产物与pMD19_T载体(购于宝生物工程大连有限公司)用T4DNA连接酶(购于宝生物工程大连有限公司)按连接酶使用说明书连接，构成prosystemin-pMD19-T载体并采用热激转化法转入大肠杆菌DH5a感受态细胞中，取prosystemin-pMD19_T载体10 μ 1、大肠杆菌DH5 a感受态细胞100 μ l,prosystemin-pMD19_T载体与大肠杆菌DH5 a的体积比为1:10,挑选所得阳性克隆10个，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到番茄piOsystemin基因序列，该基因序列
如下:
[0047]
atgggaactc cttcatatga tatcaaaaac aaaggagatg acatgcaaga 50
agaaccaaag gtgaaacttc accatgagaa gggaggagat gaaaaggaaa 100
aaataattga aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaagatacc 150
atctcttcat atgttttaag agatgataca caagaaatac caaagatgga 200
acatgaggag ggaggatatg taaaggagaa aattgttgaa aaggagacta 250
tatcccaata tatcatcaag attgaaggag atgatgatgc acaagaaaaa 300
ctaaaggttg agtatgagga ggaagaatat gaaaaagaga aaatagttga 350
aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaaggagat gatgcacaag 400
aaaaaccaaa ggtggaacat gaggaaggag atgacaaaga gactccatca 450
caagatatca tcaagatgga aggggagggt gcactagaaa taacaaaggt 500
ggtatgtgag aaaattatag tacgagaaga tcttgctgtt caatcaaaac 550
ctccatcaaa gcg tgatcct cccaaaatgc aaacagacaa taataaactc 600
[0048]2、构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体
[0049]用Spe I和BstE II分别双酶切prosystemin-pMD19_T载体、植物表达载体pCAMBIA-1302,双酶切的方法为:取 prosystemin-pMD19_T 载体 6 μ 1，Spe Il μ 1、BstEΙΙΙμ 1、10XM Buffer2y I, 二次蒸馏水10μ 1，混合均匀，于37°C反应2小时20分钟，电泳分离，用OMEGA公司E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit试剂盒回收酶切片段，得到prosystemin 基因回收片段。取植物表达载体 pCAMBIA-13026 μ I, Spe Il μ l.BstE III μ 1、10XMBuffer2y 1，二次蒸馏水10 μ 1，混合均匀，于37°C反应3小时，电泳分离，用OMEGA公司E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit试剂盒回收酶切片段，得到pCAMBIA-1302回收片段。将prosystemin基因回收片段与pCAMBIA-1302回收片段按照摩尔比为1:7用T4DNA连接酶连接，取连接产物10 μ I用热激转化法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞100 μ 1，挑取单克隆10个,37°C 180rpm振荡培养16~18小时，用prosystemin特异引物prosystemin-F和prosystemin-R经菌落聚合酶链式反应检测，反应条件为95°C、10分钟；然后94°C、30秒，60°C、30秒，72°C、40秒，35个循环，得到阳性菌株；用碱裂解法提取阳性菌株质粒，用Spe I和BstE II双酶切方法进行酶切反应，筛选，获得pCAMBIA-1302-prosystemin中间载体。
[0050]选取位于丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因，简称C0MT，编码区3 ^端345bp的片段作为RNA干涉的靶片段，在该片段分别引入酶切位点Cla Ι/Κρη I及Xho I/BamH I，应用Primer Prime5.0软件设计扩增引物:
[0051 ] i COMT-F: 5' -CCATCGAT GGTACCACCCTCCCCGACGGCGGCGTCCA-3'
[0052] iCOMT-R:5/ -GCTCTAGACTCGAG GGATCCCACACCACCTACAACCACCTCCT-3'；[0053]将该345bp的上游引入Cla I和Kpn I两个酶切位点，于其下游引入Xho I和BamHI两个酶切位点；经聚合酶链式扩增反应扩增丹参cDNA，反应条件为95°C、3分钟；然后940C >30 秒，58。。、30 秒，72。。、25 秒，35 个循环，得含有 Cla I/Kpn I 和 Xho I/BamH I 的咖啡酰-O-甲基转移酶，命名为COMTi，经电泳分离后按照试剂盒说明书回收COMTi片段，以P-MD19T载体与COMTi片段的体积比1:9连接，得C0MTi_pMD19T载体。
[0054]用Xho I 和 Kpn I 分别酶切 C0MTi_pMD19T 载体、pKannibal 载体，取 C0MT1-pMD19_T载体6 μ 1、10XM Buffer2 μ 1、限制性内切酶Xho Il μ 1、限制性内切酶Kpn Il μ 1、二次蒸馏水10μ I于37°C反应2小时40分钟;取pKannibal载体6 μ IUOXM Buf f er2 μ 1、限制性内切酶Xho Il μ 1、限制性内切酶Kpn Il μ 1、二次蒸馏水10μ I于37 °C反应2小时40分钟；将这两者的酶切产物进行电泳分离，按照试剂盒说明书回收COMTi基因片段和pKannibal载体片段，取COMTi基因回收片段I μ l、pKannibal中间载体回收片段7 μ 1、T4DNA连接酶
Iμ 1、IOX T4DNA连接酶Buffer I μ I，16°C反应3小时，获得pKannibal+中间载体。
[0055]用BamH I 和 Cla I 分别酶切 C0MTi_pMD19T 载体、pKannibal+ 载体，取(:0皿11-?]\?191'载体6 4 IUOXK Buffer2 μ 1、限制性内切酶Cla Il μ 1、限制性内切酶BamH
IIμ 1、二次蒸馏水10 μ 1，混合均匀于37°C反应2小时30分钟；取pKannibal+中间载体
6μ 1、10XK Buffer2 μ 1、限制性内切酶Cla Il μ 1、限制性内切酶BamH Il μ 1、二次蒸馏水10 μ 1，混合均匀于37 V反应2小时30分钟，将这两种酶切产物进行电泳分离，按照试剂盒说明书回收COMTi基因片段与pKannibal+中间载体片段，取COMTi基因回收片段1.5 μ 1、pKannibal+ 中间载体回收片段 6.5 μ 1、T4DNA 连接酶 I μ 1、10XT4DNA 连接酶 Bufferl μ 1，16°C反应3小时，获得的新载体为pKANNIBAL/COMTi。
[0056]用Sac I和Pst I双酶上一步获得的新pKANNIBAL/COMTi和pCAMBIA1302-prosystemin 载体，取 pKANNIBAL/C0MTi6 μ 1、Sac 11 μ 1、PstΙ?μ 1、10XM Buffer2y 1、二次蒸馏水10 μ 1，混合均匀，于37 °C反应3小时；取pCAMBIA-1302-prosystemin 载体 6 μ 1、Sac Il μ 1、Pst Il μ 1、10XM Buffer2 μ 1、二次蒸馏水10 μ 1，37°C反应3小时；电泳分离，按照OMEGA公司E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit试剂盒说明书回收pKANNIBAL/COMTi酶切产物和pCAMBIA-1302-prosystemin载体酶切产物，取 pKANNIBAL/COMTi 酶切产物 2 μ 1、pCAMBIA-1302-prosystemin 载体回收片段 6 μ 1、T4DNA 连接酶 I μ 1、10XT4DNA 连接酶 Bufferl μ 1，16 °C 反应 3 小时，得 pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/COMTi载体。将该载体转入大肠杆菌DH5 α中进行扩增，用碱裂解法提取质粒，用Sac I和Pst I双酶切的方法进行鉴定,得到含有番爺prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体ρ CAMBIA13 O 2 /prosystemin+pKANNIBAL/COMTi，命名为 pCPKC 载体。
[0057]3、制备含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的根癌农杆菌菌株
[0058] 将pCPKC载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，采用液氮冻融法进行转化，转化后的产物于28±0.5°C培养箱中倒置培养48小时，挑取抗性单菌落20个，28±0.5°C,160rpm震荡培养中24小时，分别用prosystemin基因特异性引物prosystemin-F和prosystemin基因特异性引物prosystemin-R进行聚合酶链式反应,反应条件为95°C、10分钟；然后94°C、30秒，60°C、30秒，72°C、40秒，35个循环，得到阳性菌株；再用pCPKC载体上特异性引物:
[0059]35S-F5' -TACAAAGGCGGCAACAAACG-3'
[0060]35S-R5' -GCAATGGAATCCGAGGAGGT-3'
[0061]对阳性菌株进行聚合酶链式反应，反应条件为94°C、3分钟；94°C、30秒，59°C、30秒，72 0C >50秒，35个循环，筛选，最终获得含有pCPKC载体的根癌农杆菌菌株。
[0062]4、制备转基因丹参植株
[0063]无菌丹参试管苗的获得可采用常规组织培养方法，具体方法如下:
[0064]丹参种子用流水冲洗，用体积分数为75%乙醇水溶液表面灭菌20秒，二次蒸馏水冲洗2次，每次4分钟，用质量分数为0.1 %的氯化汞水溶液表面灭菌10分钟，二次蒸馏水冲洗5次，丹参种子用滤纸吸干表面残存的水分，置于MS基本培养基上萌发，25°C，16小时光照，光照强度为3000LuX，8小时黑暗培养箱内培养2周，获得无菌试管苗。
[0065]将含有pCPKC载体的根癌农杆菌与无菌丹参试管苗进行浸染的具体方法如下:
[0066]选取生长30天的丹参无菌试管苗，将其叶片切成0.5厘米X0.5厘米的小块，转入预培养培养基中(预培养基为每ILMS培养基含有IOmL浓度为1.0mg/mL的6-苄氨基腺嘌呤、ImL浓度为1.0mg/mL的a_萘乙酸的培养基)，在正常培养条件下预培养I天，将预培养过的一部分叶片转入稀释好的含有PCPKC载体根癌农杆菌菌液中，28°C恒温100转/分钟浸染25~30分钟，取出叶片，用无菌滤纸吸干，转移到预培养培养基上暗培养2~3天；另一部分预培养的叶片不进行农杆菌的浸染，直接在预培养培养基上培养至生芽后，将芽剥落，置于1/2MS培养基上生根，作为实验未转化的空白对照植株；暗培养2~3天后，将叶片从原培养基上取出，转接到选择培养基上(选择培养基为ILMS培养基中含有IOmL浓度为3mg/mL的潮霉素和IOmL浓度为200mg/mL的头孢霉素的培养基)，每10~15天更换一次选择培养基；待抗性芽长到约0.5~I厘米左右时，将抗性芽切下，转入1/2MS培养基上生根。在1/2MS培养基(每IL含有IOmL浓度为200mg/mL的头孢霉素、IOmL浓度为3mg/mL的潮霉素)筛选培养3~4次，每10~15天更换一次培养基，能正常生根的植株从节间切断，带有2个腋芽的茎段扦插于MS培养基上继代培养，4~6周左右更换一次培养基，筛选的阳性转化株系和对照株系移栽至科研温室中同等条件培养，移栽培养250天的转基因丹参植株用于迷迭香酸和丹酚酸B含量的测定。
[0067]实施例2
[0068]在本实施例的番爺prosystemin基因克隆步骤I中，取prosystemin-pMD19_T载体10 μ 1、大肠杆菌DH5a感受态细胞95 μ l,prosystemin-pMD19_T载体与大肠杆菌DH5 a的体积比为1:9.5，挑选所得阳性克隆10个，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到番爺prosystemin基因序列。该步骤中的其它步骤与实施例1相同。其它步骤与实施例1相同。
[0069]实施例3
[0070]在本实施例的番爺prosystemin基因克隆步骤I中，取prosystemin-pMD19_T载体10 μ 1、大肠杆菌DH5 α感受态细胞10.5 μ I, prosystemin-pMD19_T载体与大肠杆菌DH5a的体积比为1:10.5，挑选所得阳性克隆10个，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到番爺prosystemin基因序列。该步骤中的其它步骤与实施例1相同。其它步骤与实施例I相同。[0071]实施例4
[0072]在以上实施例1~3的制备含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰_0_甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的根癌农杆菌菌株步骤3中，将pCPKC载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，采用液氮冻融法进行转化，转化后的产物于27.5°C培养箱中倒置培养72小时，挑取抗性单菌落分别用prosystemin基因特异性引物prosystemin-F和prosystemin基因特异性引物prosystemin-R进行聚合酶链式反应,该步骤中的其它步骤与实施例1相同。它步骤与实施例1相同。
[0073]实施例5
[0074]在以上实施例1~3的制备含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰_0_甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的根癌农杆菌菌株步骤3中，将pCPKC载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，采用液氮冻融法进行转化，转化后的产物于28.5°C培养箱中倒置培养36小时，挑取抗性单菌落分别用prosystemin基因特异性引物prosystemin-F和prosystemin基因特异性引物prosystemin-R进行聚合酶链式反应,该步骤中的其它步骤与实施例1相同。它步骤与实施例1相同。
[0075]为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备的转基因丹参植株进行了番茄基因和丹参内源基因的表达量、转基因丹参植株的抗虫性以及活性成分的含量，进行了大量的实验，各种实验情况如下:
[0076]1、检测转基因丹参植株中prosystemin和咖啡酰_0_甲基转移酶基因的表达量
[0077]用PremierPrimer5.0软件,设计合成适合实时突光定量逆转录-聚合酶链式反应扩增所需的番茄prosystemin基因、丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因以及丹参管家基因肌动蛋白-β 基因的引物，分别标记为 qProsystemin_F、qProsystemin-R ；qC0MT-F>qC0MT-R ；qSmACT-F、qSmACT-R。引物序列分别为:
[0078]qProsystemin-F5/ -TAGTTGAAAAAGAGACTCCATCCCA-3'
[0079]qProsystemin-R5/ -ACGACAAGTTAGTTTTGGAGGT-3'
[0080]qC0MT-F5' -TCCAGGTGTGGAGCATGTGG-3'
[0081]qC0MT-R5; -GTGTTTTACCCTTCCACTA-3'
[0082]qSmACT-F:5，-AGGAACCACCGATCCAGACA-3’
[0083]qSmACT-R:5，-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3，
[0084]按照OMEGA公司E.Z.N.A.? Plant RNA Kit提取试剂盒的说明书提取生长30天的丹参总RNA,并用Takara公司PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒合成丹参cDNA第
一链，保存备用。
[0085] 以非转化丹参株系cDNA为空白对照，以转化pCPKC载体的丹参植株为实验组，用实时突光定量逆转录-聚合酶链式反应法测定番爺prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因的表达量。实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应扩增条件是:94°C预变性、I分钟；40个循环(94°C变性、10秒，60°C退火并收集荧光信号，25秒)，95°C、I分钟，60°C、I分钟，60~95°C、每30秒升高0.5°C，收集一次荧光。反应结束后荧光信号值采用“比较Ct值的相对定量法”进行基因表达的分析。具体处理方法按照“iQ?5多重实时荧光定量PCR仪说明书”进行。检测结果见图1、2。在图1、2中，横坐标为不同的转基因株系，纵坐标为相对表达量，CK代表非转化丹参株系，*表示实验组与对照组比较具有显著差异性(P〈0.05)。由图1可见，与对照植株相比，外源目的基因番爺prosystemin基因在转化株系2、3、8、13中都具有不同程度的表达，并与对照相比具有显著性差异(P〈0.5)，表明番茄prosystemin基因已在丹参中过量表达。在图2中，株系2、3、8、13、15、16中的咖啡酰-O-甲基转移酶表达量较对照有明显下调(P〈0.05)，说明对丹参内源基因咖啡酰-O-甲基转移酶的干涉是成功的。综合番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因表达量的检测结果，选取转基因丹参株系2、13两个株系进行后续试验。
[0086]2、转基因丹参株系抗虫实验
[0087]分别从生长30天的转基因丹参株系2、13和相同生长状态的野生丹参的不同3个植株上摘取顶叶I片，置于铺有潮湿脱脂棉的培养皿上，每个培养皿中放I片丹参顶叶。另外在每个培养皿中接种3头处于三龄幼虫期的棉铃虫幼虫(为实验室保留)。将培养皿置于25°C光照培养箱中培养，3天后观察叶片损害程度，结果见图3，从图3中可以看出，左图为实验3天后转基因丹参株系2的叶片，叶片几乎没有被咬噬，而且棉铃虫也因没有食物而死亡；右图为野生型丹参叶片，从图中可看出叶片被咬噬严重，边缘褐化、坏死。并统计棉铃虫的死亡率，见表1。
[0088]表1噬咬3天后接种于转基因丹参株系2与野生丹参叶片的棉铃虫死亡率
[0089]
【权利要求】
1.一种用番茄基因和丹参内源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，由下述步骤组成: (1)番爺prosystemin基因克隆 用E.Z.N.A.? Plant RNA Kit提取试剂盒，按照说明书分离提取番茄总RNA，用PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒,按照说明书将番爺总RNA反转录成cDNA备用；采用Primer Premier5.0软件,设计番爺prosystemin基因编码框的上游引物、下游引物，以番茄cDNA为模板，进行聚合酶链式反应，反应体系为:取番茄cDNA与DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTP、上游引物、下游引物、二次蒸馏水的体积比为1:0.5:5:5:1:1:37.5，按照如下条件反应:95°C 3分钟，95°C 30秒、57°C 30秒、72°C 45秒、循环35次，得到番茄prosystemin基因，并在番爺prosystemin基因的上游引物前引入Spe I限制性酶切位点和保护碱基GACTAGT，在下游引物前引入BstE II限制性酶切位点和保护碱基CAGGGTAACC，用番爺prosystemin基因引物:
上游引物 prosystemin-F5' -GACTAGTATGGGAACTCCTTCATATGATATC-3'
下游引物 prosystemin-RS' -CAGGGTAACCCGTTTGTCTGTTATTATTTGAG-3' 以番茄cDNA为模板，按下述反应体系进行混合:番茄cDNA与DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTP、prosystemin-F、prosystemin-R、二次蒸懼水的体积比为 2:0.5:5:5:1:1:36.5，并按照 95 °C 3 分钟，95°C 30 秒、57°C 30 秒、72°C 45 秒、循环 35 次，进行聚合酶链式反应扩增，得含有酶切位点的番茄P r O S y S t e m i η基因，获得的扩增产物进行电泳分离，回收扩增产物与PMD19-T载体用T4DNA连接酶按连接酶使用说明书连接，构成prosystemin-pMD19-T载体，并采用热激转化法转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，prosystemin-pMD19-T载体与大肠杆菌DH5 α的体积比为1:9.5~10.5,挑选所得阳性克隆，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到番茄prosystemin基因序列，该基因序列如下:
atgggaactc cttcatatga tatcaaaaac aaaggagatg acatgcaaga 50
agaaccaaag gtgaaacttc accatgagaa gggaggagat gaaaaggaaa 100
aaataattga aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaagatacc 150
atctcttcat atgttttaag agatgataca caagaaatac caaagatgga 200
acatgaggag ggaggatatg taaaggagaa aattgttgaa aaggagacta 250
tatcccaata tatcatcaag attgaaggag atgatgatgc acaagaaaaa 300
ctaaaggttg agtatgagga ggaagaatat gaaaaagaga aaatagttga 350
aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaaggagat gatgcacaag 400
aaaaaccaaa ggtggaacat gaggaaggag atgacaaaga gactccatca 450
caagatatca tcaagatgga aggggagggt gcactagaaa taacaaaggt 500
ggtatgtgag aaaattatag tacgagaaga tcttgGtgtt caatcaaaac 550
ctccatcaaa gcgtgatcct cccaaaatgc aaacagacaa taataaactc 600 (2)构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体 用Spe I和BstE II分别双酶切prosystemin-pMD19_T载体、植物表达载体pCAMBIA-1302，分别回收prosystemin基因片段和pCAMBIA_1302双酶切后的酶切产物，将片段与产物用T4DNA连接酶连接，筛选，获得pCAMBIA-1302-prosystemin中间载体； 选取位于丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因，简称C0MT，编码区3'端345bp的片段作为RNA干涉的靶片段，在该片段分别引入酶切位点Cla I/Kpn I及Xho I/BamH I，应用PrimerPrime5.0设计扩增引物:
i COMT-F: 5' -CCATCGAT GGTACCACCCTCCCCGACGGCGGCGTCCA-3'
i COMT-R: 5' -GCTCTAGACTCGAG GGATCCCACACCACCTACAACCACCTCCT-3'； 用聚合酶链式扩增反应，将该345bp的上游引入Cla I和Kpn I两个酶切位点，于其下游引入Xho I和BamH I两个酶切位点；经聚合酶链式扩增反应扩增，得含有Cla I/Kpn I及Xho I/BamH I 的产物 COMTi，连接 p_MD19T 载体得 C0MTi_pMD19T 载体；用 Xho I 和 Kpn I 分别酶切 C0MT1-pMD19T 载体、pKannibal 载体，将用 Xho 1、KpnI 酶切 C0MTi_pMD19T 载体的片段与经Xho 1、Kpn I酶切pKannibal载体的片段,用DNA连接酶相连成pKannibal+中间载体；用BamH I和Cla I分别酶切C0MTi_pMD19T载体、pKannibal+载体，用含有BamH I和Cla I酶切C0MT1-pMD19T载体的片段与经BamH I和Cla I酶切pKannibal+的片段用DNA连接酶相连，获得的新载体为pKANNIBAL/COMTi ； 用 Sac I 和 Pst I 双酶切 pKANNIBAL/C0MT1、pCAMBIA1302-prosystemin 载体，将双酶切pKANNIBAL/COMTi所获得的干涉转录框，连接到经双酶切后的pCAMBIA1302-prosystemin载体上，得 pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/C0MTi 载体，并转入大肠杆菌 DH5 α 中进行扩增，提取质粒，用酶切方法进行鉴定，得到含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/COMTi，命名为pCPKC载体； (3)制备含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的根癌农杆菌菌株 将pCPKC载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，采用液氮冻融法进行转化，转化后的产物于27.5 °C~28.5 °C培养箱中倒置培养36~72小时，挑取抗性单菌落分别用prosystemin基因特异性引物prosystemin-F和prosystemin基因特异性引物prosystemin-R进行聚合酶链式反应,筛选,用pCPKC载体上特异性引物,序列为:
35S-F5' -TACAAAGGCGGCAACAAACG-3'
35S-R5' -GCAATGGAATCCGAGGAGGT-3' 进行聚合酶链式反应，筛选，获得含有PCPKC载体的根癌农杆菌菌株； (4)制备转基因丹参植株 采用常规组织培养方法获得无菌丹参试管苗，采用叶盘转化法，将含有PCPKC载体的根癌农杆菌与无菌丹参试管苗进行浸染，获得含有番茄prosystemin基因并且干涉丹参内源咖啡酰-O-甲基转移酶基因的丹参植株。
2.根据权利要求1所述的用番茄基因和丹参内源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，其特征在于在本发明的构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的步骤(2)中，所述的用Spe I和BstE II双酶切prosystemin-pMD19_T载体、植物表达载体pCAMBIA-1302 为:取含有 prosystemin-pMD19-T载体、10 XM Buffer、限制性内切酶Spe 1、限制性内切酶BstE I1、二次蒸馏水于37 °C反应2小时20分钟，限制性内切酶Spe I与限制性内切酶BstE IIUOXM Buffer、含有prosystemin-pMD19-T载体、二次蒸懼水的体积比为1:1:2:6:10 ;取植物表达载体PCAMBIA-1302U0XM Buffer、限制性内切酶Spe 1、限制性内切酶BstE I1、二次蒸馏水于37°C反应3小时，限制性内切酶Spe I与限制性内切酶BstE IIUOXM Buffer、植物表达载体pCAMBIA-1302、二次蒸馏水的体积比为I:1:2:6:10。
3.根据权利要求1所述的用番茄基因和丹参内源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，其特征在于在本发明的构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的步骤(2)中，所述的用Xho I和Kpn I分别酶切C0MT1-pMD19T 载体、pKannibal 载体为:取 C0MT1-pMD19_T 载体、10 XM Buffer、限制性内切酶Xho 1、限制性内切酶Kpn 1、二次蒸馏水，37°C反应2小时40分钟，限制性内切酶Xho I与限制性内切酶Kpn IUOXM Buffer、C0MT1-pMD19_T载体、二次蒸馏水的体积比为I:1:2:6:10 ;取pKannibal载体、10XM Buffer、限制性内切酶Xho 1、限制性内切酶Kpn 1、二次蒸馏水，37°C反应2小时40分钟，限制性内切酶Xho I与限制性内切酶Kpn 1、10XM Buffer、pKannibal载体、二次蒸懼水的体积比为1:1:2:6:10。
4.根据权利要求1所述的用番茄基因和丹参内源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，其特征在于在本发明的构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰_0_甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的步骤(2)中，所述的用BamH I和Cla I分别酶切C0MT1-pMD19T 载体、pKannibal+ 载体为:取含有 C0MTi_pMD19T 载体、IOXK Buffer、限制性内切酶Cla 1、限制性内切酶BamH 1、二次蒸馏水，37°C反应2小时30分钟，限制性内切酶Cla I与限制性内切酶BamH 1、10XK Buffer、C0MT1-pMD19_T载体、二次蒸馏水的体积比为I:1:2:6:10 ;取pKannibal+载体、10XK Buffer、限制性内切酶Cla 1、限制性内切酶BamH1、二次蒸馏水，37°C反应2小时30分钟，限制性内切酶Cla I与限制性内切酶BamH IUOXKBuffer、pKannibal+载体、二次蒸懼水的体积比为I:1:2:6:10。
5.根据权利要求1 所述的用番茄基因和丹参内源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，其特征在于在本发明的构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰_0_甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的步骤⑵中，所述的用Sac I和Pst I双酶切pKANNIBAL/COMTi, pCAMBIA1302-prosystemin 载体为:取 pKANNIBAL/COMTi 载体、IOXM Buffer、限制性内切酶Sac 1、限制性内切酶Pst 1、二次蒸馏水，37°C反应3小时，限制性内切酶Sac 1、限制性内切酶Pst IUOXM Buffer、pKANNIBAL/COMTi载体、二次蒸馏水的体积比为I:1:2:6:10 ;取口0六1^从-1302-口1'0878七611^11载体、10\]\^1^€61'、限制性内切酶530 1、限制性内切酶Pst 1、二次蒸馏水于37°C反应3小时，限制性内切酶Sac I与限制性内切酶Pst IUOXMBuffer、pCAMBIA1302_prosystemin 载体、二次蒸懼水的体积比为 1:1:2:6:10。
【文档编号】C12N15/82GK104004747SQ201410234203
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】王喆之, 陈尘, 张璇 申请人:陕西师范大学