一种利用焦磷酸测序技术检测小反刍兽疫病毒的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种焦磷酸测序技术检测小反刍兽疫病毒的试剂盒，其包括检测小反刍兽疫的通用引物及焦磷酸测序引物，其核苷酸序列分别如SEQ?ID?NO.2-4所示。通过提取待测样品的RNA，以上述通用引物进行RT-PCR扩增，若引物扩增片段长度为78bp，再进行焦磷酸测序反应，若测序片段与N基因目标片段（SEQ?ID?NO.1）完全相同的，确定为小反刍兽疫病毒，若测序片段与目标片段有一个或一个以上碱基不同，则判定样品为阴性。本发明试剂盒可用于对小反刍兽疫病毒进行快速检测，具有高通量、低成本的特点，产物可直接用于测序，不需要进行二次处理，操作极为简便，所需样品量小，具有良好的应用前景。
【专利说明】一种利用焦磷酸测序技术检测小反刍兽疫病毒的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及焦磷酸测序技术，特别是涉及利用焦磷酸测序技术检测小反刍兽疫病毒的试剂盒。
【背景技术】
[0002]小反会兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由副粘病毒科麻疫病毒属的小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种高度接触性动物疫病。该病主要感染家养和野生小反刍兽，山羊尤其易感，其致病性与分子学特性与牛瘟(RP)非常相似，被世界动物卫生组织(OIE)规定为A类动物疫病，给发生该病的国家，尤其是非洲、中东、近东和南亚等国家的外贸经济带来了巨大的损失。该病自发生以来，不断向世界各地蔓延，对无该病发生的国家，尤其对呈地方性流行国家的临近国家造成的威胁逐渐加大。长期以来，人们一直认为PPRV是RPV的变异毒株，只是丧失了对牛的致病力，只对小反刍动物有致病作用，加上RP和PPR能够产生交叉免疫保护，可以用RP疫苗预防PPR。因此，在很多国家和地区忽略了对PPR的研究，特别是忽视了 PPRV的病原生物学、分子生物学等方面的研究。本病目前没有有效的治疗方法，只能依靠有效地预防，因此诊断监测技术成为控制该病的重要手段。
[0003]焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是近几年发展起来的一种能够进行定量序列测定的新技术，具有高通量、快速、敏感等特点。目前该技术在物种鉴定、病毒的快速鉴定和分型、微生物的检测以及寄生虫检测鉴定等方面已有广泛的应用。
[0004]焦磷酸测序是不同于Sanger法的一种新的测序技术，它以单链DNA为模板，在荧光素、5'-磷酸化硫酸腺苷(APS)等底物存在，及DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸酶(ATPsulfurylase)、重组突光素酶(Iuciferase)催化下，加入与模板互补的dNTP时发生延伸反应，产生与模板碱基数相应强度的突光信号，不互补的dNTP被三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)降解，无荧光信号产生。焦测序无需荧光染料标记和电泳步骤，能够在短时间内提供基因片段的序列信息，是短片段基因测序的理想平台。焦测序技术已经在SNP检测，微生物分型，基因甲基化检测等领域得到应用，还应用到大规模DNA测序中，使测序技术发生了革命性变化。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有检测技术的不足，提供一种小反刍兽疫病毒通用焦磷酸测序检测方法，以弥补现有检测技术的不足，为我国畜牧业和养殖业、畜产品加工和出口商以及国际畜产品贸易等方面提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法。
[0006]为了实现上述目·的，本发明的主要原理是利用焦磷酸测序技术，通过DNA聚合酶(DNA ploymerase)、三憐酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、突光素酶(Iuciferase)和双磷酸酶(apyrase) 4种酶催化待测序DNA单链和测序引物的酶级联化学发光反应，反应底物为5’ -邻酰硫酸(adenosine5’ phosphosulfate, APS)和突光素。在每一轮测序反应中，加入I种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，光信号由CCD摄像机检测并由Pyrogram?反应为峰,每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序即可从反应光强的信号峰中读出。
[0007]本发明的另一目的在于提供用于检测小反刍兽疫病毒的试剂盒。
[0008]本发明首先提供的一种适用于焦磷酸测序检测小反刍兽疫病毒N基因的特异目标序列，其具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0009]本发明提供了用于检测小反刍兽疫病毒N基因的通用引物，其核苷酸序列为:
[0010]UPPRVF:5，-ACCCTCGTGAGGCTCAAA-3’
[0011]UPPRVR:5’ -Biotin-CCTCCTGGTCCTCCAGAATC-3’。
[0012]本发明提供了与上述通用引物配合使用的焦磷酸测序引物，其核苷酸序列为:
[0013]UPPRVS: 5，-ATCGGCTGAGGCACT—3，。
[0014]本发明所述的设计小反刍兽疫病毒通用引物及焦磷酸测序引物是根据小反刍兽疫病毒N基因的特异区域序列，通过Assay Design SW软件设计小反刍兽疫病毒通用引物序列，以扩增出特异性单一条带，再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列(特异目标序列SEQ ID N0.1所示)设计焦磷酸测序引物以确定小反刍兽疫病毒。小反刍兽疫病毒N基因的目标序列:CTTCAG GCTG CAGGCCATGG CCAAGATTCT GGAGGACCAG (SEQ ID N0.1);其 RT-PCR扩增片段长度为78bp。
[0015]进一步，本发明提供了一种利用焦磷酸测序技术检测小反刍兽疫病毒的试剂盒，含有上述的通用引物和焦磷酸测序引物。
[0016]进一步地，本发明的试剂盒，其工作程序为:
[0017](I)提取待测样品的RNA ;以上述的通用引物进行RT-PCR扩增；
[0018](2)若扩增产物长度为78bp，则制备焦磷酸测序单链模板；
[0019](3)进行焦磷酸测序，若目的序列与SEQ ID N0.1所示特异目标序列一致，则待测样品中含有小反刍兽疫病毒。
[0020]步骤(1)所述的提取待测样品的RNA是利用Trizol裂解液处理待测样品，经酚氯仿抽提，异丙醇沉淀获得RNA，或者采用商业化的RNA提取试剂盒提取。
[0021]更进一步地，步骤(1)的RT_PCR50y L反应体系中含IOXOne Step RNA PCRBuffer5 μ L, MgCL225mmol/L, 10 μ L, dNTP Mixture 各 10mmol/L5 μ L, 40U/ μ L RNA 酶抑制剂 I μ L, 5U/ μ L AMV 反转录酶 XLl μ L，AMV-Optimized Taq (5U/μ L) I μ L，IOpmol/μ L 上、下游引物各1.0 μ L，待测RNAl μ g，无RNA酶H2O补足50 μ L反应体系。
[0022]本发明试剂盒工作程序中，步骤(1)的RT-PCR扩增条件为:50°C反转录30min，94°C预变性2min后；94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共循环50次；然后72°C再延伸8min。
[0023]其中，步骤(I冲RT-PCR扩增产物电泳检测方法为取0.6g琼脂糖，于30mLl X TAE电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入SYBR GreenlOOOO倍稀释的溶液2 μ L，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；取5μ L RT-PCR扩增产物分别和I μ L6 X Loading Buffer混合后，点样；10V/cm恒压电泳,直至溴酹蓝指示剂迁移至凝胶中部，停止电泳，将凝胶置于紫外凝胶成像系统下观察电泳结果并记录。
[0024]更进一步地，步骤(2)的制备焦磷酸测序单链模板方法为:使用20UL标记有生物素的PCR产物与30 ii L ddH20混合后再与200 u g链霉素亲和素包被的磁珠混合，室温下置震荡器上1400rpm震荡孵育15min，用真空吸附泵将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后依次通过70%乙醇5s ;变性缓冲液5s ;冲洗缓冲液5s，最后移至预先每孔加入45 ii L含有
0.3mol/L测序引物的结合缓冲液的96孔板上方，释放磁珠，将96孔板放入80°C烘箱中加热2min后,取出冷却至室温。
[0025]更近一步地，步骤(3)焦磷酸测序反应在20_28°C下于焦磷酸测序仪上进行检测，所采用的碱基加入顺序为15 (ATGC)，每轮测序检测运行时间为65min，引物链随着不同dNTP的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。
[0026]经过上述工序，本发明的试剂盒是根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有小反刍兽疫病毒:小反刍兽疫病毒通用RT-PCR反应为阳性，即扩增片段为78bp，则制备焦磷酸测序单链模板，进行焦磷酸测序分析，测序片段与N基因目标片段完全相同的，确定为小反刍兽疫病毒，若测序片段与目标片段有一个或一个以上碱基不同，则判定样品为非小反刍兽疫病毒。若小反刍兽疫病毒通用RT-PCR反应为阴性，则判定样品为非小反刍兽疫病毒。
[0027]本发明的优点在于:本发明利用焦磷酸测序技术对小反刍兽疫病毒进行检测，与现有技术相比，该技术具有高通量、快速、准确的优点，可以精确的进行短DNA序列分析，测序过程耗时短，便于构建标准化操作流程。PCR产物可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作简便，所 需样品量少。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为本发明对小反刍兽疫病毒RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳结果；其中M为Marker, I为小反刍兽疫病毒。
[0029]图2为本发明对小反刍兽疫病毒RT-PCR扩增产物进行焦磷酸测序的结果。
[0030]图3为本发明对血液样品RNA RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果；其中M为DNA Marker，I，2为小反刍兽疫病毒感染的病羊血液样品，3，4为小反刍兽疫疫苗免疫羊血液，5-7为健康羊血液。
[0031]图4为本发明对病羊、免疫羊和健康羊血液样品RNA RT-PCR扩增产物进行焦磷酸测序的结果，其中图4A为小反刍兽疫病毒感染的病羊血液样品RNA RT-PCR扩增产物的焦磷酸测序图，图4B为小反刍兽疫疫苗免疫羊血液样品RNA RT-PCR扩增产物的焦磷酸测序图，图4C为健康羊血液样品RNA RT-PCR扩增产物的焦磷酸测序图。
[0032]图5为本发明对小反刍兽疫病毒RT-PCR进行特异性检测的琼脂糖凝胶电泳结果，其中M为DNA Marker, I为小反刍兽疫病毒,2为小反刍兽疫疫苗毒,3为口蹄疫病毒,4为水泡性口炎病毒，5为空白阴性对照。
[0033]图6为本发明对小反刍兽疫病毒RT-PCR扩增产物进行焦磷酸测序的特异性检测结果，其中图6A为小反刍兽疫病毒的焦磷酸测序图，图6B为小反刍兽疫疫苗毒的焦磷酸测序图，图6C为口蹄疫病毒的焦磷酸测序图，图6D为水泡性口炎病毒的焦磷酸测序图。【具体实施方式】
[0034]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0035]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。
[0036]实施例1检测小反刍兽疫病毒的引物的设计
[0037]通过对美国国立生物信息中心NCBI基因库(GenBank)中已公布的各个国家和地区的PPRV N基因序列进行对比分析，确定PPRV N基因的高度保守序列，根据该特异性序列采用Assay Design SW软件设计通用RT-PCR引物和焦磷酸测序引物,选取得分较高的引物组进行Blast分析，根据分析结果选取一组最佳引物进行后续的RT-PCR和测序工作。
[0038]本发明根据小反刍兽疫病毒N基因的特异区域序列设计的小反刍兽疫病毒通用引物可针对小反刍兽疫病毒RNA扩增出特异性单一条带，其RT-PCR扩增片段长度为78bp。再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列(特异目标序列SEQ ID N0.1所示)设计焦磷酸测序引物以确定小反刍兽疫病毒。小反刍兽疫病毒N基因的目标序列:CTTCAGGCTGCAGGCCATGG CCAAGATTCT GGAGGACCAG (SEQ ID N0.1)。
[0039]本发明经过筛选，设计得到的小反刍兽疫病毒通用RT-PCR引物及测序引物分别为:
[0040]UPPRVF:5，-ACCCTCGTGAGGCTCAAA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0041]UPPRVR:5，-CCTCCTGGTCCTCCAGAATC-3’(5，端标记 Biotin) (SEQ ID N0.3)
[0042]UPPRVS:5，-ATCGGCTGAGGCACT-3’ (SEQ ID N0.4)
[0043]实施例2利用焦磷酸测序技术检测小反刍兽疫病毒
[0044]1、小反刍兽疫疫苗RNA的提取
[0045]以灭活的PPRV Nigeria75/1病毒(购自中国兽医药品监察所)为原料，采用TRIZOL法提取RNA。具体步骤为:
[0046](I)取灭活的病毒培养液上清200uL加入灭菌1.5ml Eppendorf管内，然后加入Trizoll.0mL,反复混匀，冰上放置5min。
[0047](2)加入200uL氯仿，小心盖上帽盖，用力摇动Eppendorf管15s，室温放置5min。4°C, 12000r/min,离心15min,溶液分为3层,上层水相含RNA。
[0048](3)转移水相至一新Eppendorf管内，加入500uL异丙醇，混匀，_20°C放置15min。4°C, 12000r/min,离心IOmin,离心后在Eppendorf管边和底部可见有胶样RNA沉淀(对于细胞毒而言，也可能看不到沉淀)。
[0049](4 )小心吸弃上清，加入500uL75%乙醇，小心颠倒以漂洗沉淀及管壁，4 °C，12000r/min,离心 5min。
[0050](5)小心吸弃上清，室温干燥RNA沉淀5~lOmin。然后加入IOuL灭菌ddH20溶解沉淀，_20°C冰箱保存备用。
[0051 ] 2.RT-PCR反应体系及条件
[0052]以提取的 PPRV 疫苗·毒 RNA 为模板，用 TAKARA One Step RNA PCR Kit (AMV)(DRR024A)试剂盒进行一步法RT-PCR，扩增目的片段，上下游引物为实施例1设计得到的UPPRVF和UPPRVR引物，RT-PCR反应体系如下:
[0053]
【权利要求】
1.一种适用于焦磷酸测序检测小反刍兽疫病毒N基因的特异目标序列，其具有SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列。
2.用于检测小反刍兽疫病毒N基因的通用引物，其核苷酸序列为:
UPPRVF:5，-ACCCTCGTGAGGCTCAAA-3’
UPPRVR:5’ -Biotin-CCTCCTGGTCCTCCAGAATC-3’。
3.与权利要求2所述通用引物配合使用的焦磷酸测序引物，其核苷酸序列为:
UPPRVS:5， -ATCGGCTGAGGCACT-3，。
4.一种利用焦磷酸测序技术检测小反刍兽疫病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的通用引物和权利要求3所述的焦磷酸测序引物。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为: (1)提取待测样品的RNA；以权利要求2所述的通用引物进行RT-PCR扩增； (2)若扩增产物长度为78bp，则制备焦磷酸测序单链模板； (3)进行焦磷酸测序，若目的序列与权利要求1所述特异目标序列一致，则待测样品中含有小反刍兽疫病毒。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤(1)的RT-PCR50iiL反应体系中含 IOXOne Step RNA PC`R Buffer5 u L, 25mmol/L MgCL2IOu L, dNTP Mixture 各 IOmmoI/L5 u L, 40U/ u L RNA 酶抑制剂 I U L, 5U/ u L AMV 反转录酶 XLl u L, 5U/ u L AMV-OptimizedTaql u L，IOpmol/ u L上、下游引物各1.0 y L，待测RNAl y g，无RNA酶H2O补足50 y L反应体系。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤(1)的RT-PCR扩增条件为:50°C反转录30min，94°C预变性2min后；94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共循环50次；然后72°C再延伸8min。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤(1)中RT-PCR扩增产物电泳检测方法为取0.6g琼脂糖，于30mLlXTAE电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入SYBR GreenlOOOO倍稀释的溶液2 u L，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；取5 u LRT-PCR扩增产物分别和I y L6 X Loading Buffer混合后，点样；10V/cm恒压电泳,直至溴酹蓝指示剂迁移至凝胶中部，停止电泳，将凝胶置于紫外凝胶成像系统下观察电泳结果并记录。
9.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤(2)的制备焦磷酸测序单链模板方法为:使用20 ii L标记有生物素的PCR产物与30 ii L ddH20混合后再与200 u g链霉素亲和素包被的磁珠混合，室温下置震荡器上1400rpm震荡孵育15min,用真空吸附泵将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后依次通过70%乙醇5s ;变性缓冲液5s ;冲洗缓冲液5s，最后移至预先每孔加入45 ii L含有0.3mol/L测序引物的结合缓冲液的96孔板上方，释放磁珠，将96孔板放入80°C烘箱中加热2min后，取出冷却至室温。
10.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤(3)焦磷酸测序反应在20-28°C下于焦磷酸测序仪上进行检测，所采用的碱基加入顺序为15 (ATGC)，每轮测序检测运行时间为65min，引物链随着不同dNTP的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。
【文档编号】C12Q1/68GK103667539SQ201310741568
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】王彩霞, 吴绍强, 林祥梅, 吕继洲, 袁向芬, 邓俊花 申请人:中国检验检疫科学研究院