有效建立诱导的多能干细胞的方法

专利名称：有效建立诱导的多能干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及改善诱导的多能干细胞(下文称为iPS)建立效率的方法。更 具体而言，本 发明涉及改善iPS细胞建立效率的方法，其包括在其核重编程(nuclear reprogramming)步骤中在低氧条件下培养体细胞。
背景技术：
近年来，小鼠和人iPS细胞已相继建立。Yamanaka等人通过下列诱导iPS细胞 将0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因引入来自报道小鼠(reporter mouse)的成纤维细胞 内，其中将新霉素抗性基因敲入Fbx 15基因座内，并且迫使细胞表达该基因(1，2)。Okita 等人(3)通过下列成功地建立了 iPS细胞(Nanog iPS细胞)，所述iPS细胞显示与胚胎干 (ES)细胞中的那些几乎相同的基因表达和后生修饰产生转基因小鼠，其中绿色荧光蛋白 (GFP)和嘌呤霉素抗性基因整合到Nanog的基因座内，它们的表达比Fbxl5表达更集中于 多能细胞中，迫使得自小鼠的成纤维细胞表达上述4种基因，以及选择嘌呤霉素抗性和GFP 阳性的细胞。相似结果也由其他小组获得(4，5)。其后，揭示iPS细胞也可以利用除c-Myc 基因之外的3种因子来产生(6)。此外，Yamanaka等人通过将与小鼠中所使用的那些相同的4种基因引入人皮肤成 纤维细胞内成功建立了 iPS细胞(1，7)。另一方面，Thomson等人的小组使用Nanog和Lin28 代替Klf4和c-Myc产生了人iPS细胞(8，9)。Park等人(10)使用TERT和SV40大T抗原 加上4种因子0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc产生了人iPS细胞，其中所述TERT被认为是人 细胞无限增殖基因。因此，已证实就通过将所限定的因子引入到体细胞内在人和小鼠二者 中所能够产生的多能性而言，iPS细胞与ES细胞相当。然而，iPS细胞建立效率低至小于1%。特别地，当通过引入除c-Myc外的3种因 子(0ct3/4、SoX2、Klf4)而产生它们时，会出现极低效率的iPS细胞建立的问题，其中，担心 c-Myc在组织中会引起肿瘤发生和由iPS细胞分化的个体成为体细胞。顺便提及，可获得关于细胞的未分化状态和多能性的维持与低氧条件之间的关联 的某些报告。Ezashi等人(11)观察到在低氧条件下培养的人ES(hES)细胞的分化被抑制， 暗示在低氧条件下培养以维持关于hES细胞的足够多能性的必要性。Covello等人(12) 显示在低氧条件下早期被诱导的转录调节因子(HIF-2ci)能够诱导0ct3/4的表达，并且 调节干细胞的功能和分化。此外，Grayson等人(13，14)显示低氧条件参与人间质干细胞 (hMSCs)的未分化状态和多能性的维持。然而，没有关于已经分化的体细胞中的核重编程过 程和低氧条件之间的关系的报告。提及的参考文献1.W0 2007/069666 Al2. Takahashi，K.禾口 Yamanaka，S. , Cell, 126 663-676 (2006)3. Okita, K.等人，Nature，448 :313_317 (2007)4. ffernig, M.等人，Nature，448 :318_324 (2007)5. Maherali, N.等人，Cell Stem Cell，1 :55_70 (2007)
6. Nakagawa，Μ.等人，Nat. Biotethnol.，26 :101_106 (2008)7. Takahashi，K.等人，Cell，131 :861_872 (2007)8. WO 2008/118820 A29. Yu, J.等人，Science，318 1917-1920 (2007) 10. Park, I. H.等人，Nature，451 141-146 (2008)11. Ezashi，T.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 :4783_4788 (2005)12. Covello, K. L.等人，Genes & Dev.，20 :557_570 (2006)13. Grayson, W. L.等人，J. Cell. Physiol.，207 :331_339 (2006)14. Grayson, W. L.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun.，358 :948_953 (2007)发明概述本发明的目的是提供改善iPS细胞建立效率的手段和提供使用该手段有效产生 iPS细胞的方法。本发明人以实现上述目的为目标进行了广泛研究，并且成功地显著改善了 iPS细 胞建立效率，并且已开发了本发明。因此，本发明提供了 [1]改善iPS细胞建立效率的方法，其包括在其核重编程步骤中在低氧条件下培 养体细胞。[2]上述[1]的方法，其中在环境大气(ambient atmosphere)中的氧浓度为 1% -10%。[3]上述[2]的方法，其中在环境大气中的氧浓度为_5%。[4]根据上述[1]_[3]中任一项的方法，其中核重编程物质是下述物质，或编码它 们的核酸；(i)0ct3/4 和 Klf4，或(ii)0ct3/4 和 c-Myc，或(iii)0ct3/4、Klf4 和 Sox2，或(iv) 0ct3/4、Klf4 和 c_Myc，或(v)0ct3/4、Klf4、Sox2 和 c_Myc。[5]根据上述[1]-[4]中任一项的方法，其包括将丙戊酸在核重编程步骤中用作 效率改进剂的进一步步骤。[6]根据上述[1]_[5]中任一项的方法，其中在接触核重编程物质后，在低氧条件 下执行培养体细胞超过3天。因为在核重编程步骤中的低氧条件使得能够显著增加iPS细胞建立效率，所以这 在借助于除c-Myc或Sox2外的3种因子诱导iPS细胞中特别有用，所述除c-Myc或Sox2外 的3种因子已通常与极低的iPS细胞建立效率相关。这在借助于2种因子(例如，0ct3/4 和Klf4 ；0ct3/4和c-Myc)诱导iPS细胞中也是有用的。因为当被再活化时，尤其担心c_Myc 引起肿瘤产生，所以使用2或3种因子的改善iPS细胞建立效率，在将iPS细胞应用于再生 药物中具有首要效用。因为可以使用广泛使用的允许控制氧浓度的CO2培养箱非常容易地 产生此种低氧条件，所以无需辛苦步骤或技术技能即可有效地制备iPS细胞。附图简述


图1是比较在正常氧浓度(20% )和低氧浓度(5% )下通过将2种基因0ct3/4 和Klf4引入MEF内建立的iPS细胞集落(GFP阳性集落)数目的图示Γρ < 0. 05)。图2显示通过将2种基因0ct3/4和c_Myc引入MEF内建立的iPS细胞集落(GFP 阳性集落)的图像[a)相差图像；b)GFP阳性集落的图像]。图3是使用来自在低氧浓度下建立的iPS细胞的RNA执行的RT-PCR结果的照片示图。检查了关于未分化状态的标记0ct3/4 (末端)、Sox2 (末端)、Klf4 (末端)、c-Myc (末 端)、Nan0g、Rexl和ECATl的表达，和引入的外源0ct3/4(Tg)的表达。对应于各个泳道的 样品如下· 521AH5-1 和 535AH5-2 引入 4 种基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c_Myc)；细胞在 5% 氧浓度下培养· 535AH1-1 引入4种基因；细胞在氧浓度下培养· 535BH5-1 和 521BH5-3 引入 3 种基因(0ct3/4、Klf4、Sox2)；细胞在 5%氧浓度 下培养· 527CH5-U527CH5-2 和 547CH5-1 引入 2 种基因(0ct3/4、Klf4)；细胞在 5%氧 浓度下培养.RF8:对照 ES 细胞· 20D17 对照 Nanog-iPS 细胞[Nature，448，313-317 (2007)]在每个小图右侧上的数字表示PCR循环数目。图4中的上图显示通过将在低氧浓度(5% )下用0ct3/4和Klf4建立的小鼠iPS 细胞(527CH5-2)皮下注射到免疫缺陷小鼠内而形成的畸胎瘤照片。图4中的下图显示所获 得的畸胎瘤的组织学染色图像(苏木精-伊红染色)[a)软骨组织，b)内胚层上皮组织， c)肌肉组织，d):角质化上皮组织]。图5显示通过将在低氧浓度(5%)下由引入2、3或4种细胞建立的iPS细胞显微 注射到来自ICR小鼠的胚泡内而产生的成年嵌合体照片，在2周龄时获取。a)得自通过引入4种基因建立的iPS细胞的嵌合小鼠(雄性)(521AH5-1)b)得自通过引入3种基因建立的iPS细胞的嵌合小鼠(雄性)(535BH5-1)c)得自通过引入3种基因建立的iPS细胞的嵌合小鼠(雌性)(535BH5-1)d)得自通过引入2种基因建立的iPS细胞的嵌合小鼠(雄性)(527CH5-1)e)得自通过引入2种基因建立的iPS细胞的嵌合小鼠(雄性)(527CH5-2)图6显示关于实施例7的时间表。图7是在实施例7中在各种培养条件下建立的iPS细胞集落数目的图示。“预先 (Pre)”显示在低氧条件下具有预培养获得的结果。“4F”、“3F”和“模拟”分别显示由引入 4 种基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc)、3 种基因(0ct3/4、Klf4、Sox2)和空载体获得的结^ ο图8是在实施例7中由引入4种基因获得的iPS细胞集落形态的照片示图，在感 染后第40天时获取。上和下图分别显示不具有预培养在低氧条件下获得的集落和具有预 培养在低氧条件下获得的那些集落的图像。图9是比较通过下列获得的iPS细胞集落数目与在正常氧浓度(20% )下获得的 那些的图示引入4种基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc)，并且在5%氧浓度下从感染后第7天开始培养细胞1、2或3周，或直至感染后第40天。3次独立实验的结果显示在一起。图10是使用来自在低氧浓度下建立的iPS细胞的RNA执行的RT-PCR结果的照片示图。检查了关于未分化状态的标记0ct3/4 (末端)、Sox2 (末端)、Klf4 (末端)、c-Myc (末 端)、Nanog、Rexl、⑶Fl和ESGl的表达。对应于各个泳道的样品如下‘ 96AH5-2 和 96AH5-3 引入 4 种基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c_Myc)；细胞在感染后 第7天到第40天之间在5%氧浓度下培养· 96AH5W3-4、96AH5W3-5、96AH5W3-6 引入4种基因；细胞在感染后第7天开始在
5%氧浓度下培养3周· 96BH5-1 引入3种基因(0ct3/4、Klf4、Sox2)；细胞在5%氧浓度下预培养· 201B2 对照 iPS 细胞(Cell, 131，861—872 (2007))在每个小图右侧上的数字表示PCR循环数目。图11显示在5%氧浓度下产生的人ES样集落(a)和所建立iPS集落的碱性磷酸 酶染色(b)的代表性相差图像。在5%氧浓度下所产生未分化的人iPS细胞的免疫组织化 学染色。Nanog (c)、SSEA3 (d)、SSEA4 (e)。图12是证实通过引入4种基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc)且在5%氧浓度下 培养起始细胞(70AH5-2、70AH5-6)建立的人iPS细胞具有三胚层分化潜力的结果的照片示 图，通过用针对甲胎蛋白、平滑肌肌动蛋白、β III-微管蛋白、GFAP、结蛋白和波形蛋白的抗 体进行染色而获得。[左相差图像；右免疫荧光图像]。图13显示通过将人iPS细胞注射到SCID小鼠的睾丸内获得的畸胎瘤的组织学 染色图像(苏木精-伊红染色)，所述人iPS细胞通过引入4种基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、 c-Myc)且在5%氧浓度下培养起始细胞而建立(70AH5-2) [a)神经上皮组织，b)视网膜上 皮组织，c)骨样组织，d)平滑肌组织，e)内胚层上皮组织]。图14(a)至(d)是比较在第21天时(a)和在第28天时(b)来自4因子转导的 MEF、在第21天时(c)和在第28天时(d)来自3因子转导的MEF的Nanog-GFP-阳性集落 计数的图示。图14(e)和(f)是比较在第21天时来自4因子转导的MEF(e)和3因子转导 的MEF(f)的总集落中的GFP阳性集落百分比的图示。图15(a)显示在第9天时在低氧和正常氧条件下含和不含丙戊酸(VPA)培养的来 自4因子转导的MEF的GFP-阳性细胞百分比的图示。图15(b)至(e)显示在20%氧(b) 和5%氧(c)不含VPA、以及在20%氧(d)和5%氧(e)含VPA的4因子转导的MEF的代表 性流式细胞术分析。图16显示在转导后第21天时在20%氧((a)；相差，(b) ；GFP)和5%氧((c)；相 差，(d) ；GFP)下的GFP-阳性集落的代表性图像。比例条表示200 μ m。图17显示在第21天时在20%氧(a)和5%氧(b)下4因子感染的MEF、在第28 天时在20%氧(c)和5%氧(d)下3因子感染的MEF的代表性图像。图18显示527CH5-1的核型分析。图19显示比较凋亡细胞ES细胞(RF8) (a)和4因子转导的MEF (b)百分比的图示。 将ES细胞以1 X IO5细胞/孔的密度接种到STO细胞的饲养层上，并且从第1到3天在正常 氧或低氧下培养。在第3天时，细胞用膜联蛋白V-FITC进行处理，并且进行流式细胞术分 析。条形图表示凋亡细胞(膜联蛋白V-FITC阳性)的百分比。在转导后第4天时将4因子转导的MEF接种到STO细胞上，并且从第5天到第9天在正常氧或低氧下培养，并且对细 胞实施膜联蛋白-V亲和力测定法。条形图表示凋亡细胞百分比。显示了 3次实验的平均 值和标准差。图20显示比较ES细胞(RF8) (a)以及4因子和模拟转导的MEF (b)的细胞数目的 图示。将ES细胞以1 X IO5细胞/孔的密度接种到STO细胞的饲养层上，并且从第1到3天 在正常氧或低氧下培养。在第3天时，计数细胞数目。条形图显示ES细胞的细胞计数。显 示了 3次实验的平均值和标准差。从第1到4天4因子和模拟转导的MEF分别在低氧或正 常氧条件下培养，并且计数细胞数目。条形图显示细胞计数。显示了 4次实验的平均值和 标准差。> 0. 05
图21显示比较在5%氧下的4因子转导的MEF与在20%氧下的那些的ES细胞特 异性基因(a)和MEF特异性基因(b)的表达模式的散布图。选择在ES细胞和MEF中特异 性表达的基因(超过10倍差异)。在用低氧处理的4因子转导的MEF中上调和下调的基因 分别以红色和蓝色显示。绿色线表示基因表达水平中的5倍改变。图22显示通过定量实时RT-PCR的内源0ct3/4和Nanog的相对表达。图23(a)显示在第21天时比较Nanog-GFP-阳性集落计数的图示。显示了 3次实 验的平均值和标准差。比例条，200μπι。*表示ρ>0.05。图23(b)至(e)显示在20%氧 ((b)；相差，(c) ；GFP)和5%氧((d)；相差，(e) ；GFP)下获得的GFP-阳性集落的代表性图 像。图24 (a)显示在第21天时比较来自通过piggybac转座重编程的MEF的 Nanog-GFP-阳性集落的每种计数的图示。显示了 3次实验的平均值和标准差。*和#分别 表示 ρ > 0. 01 和 ρ > 0. 001。图 24(b)至(e)显示在 20%氧((b)；相差，(c) ；GFP)和 5% 氧((d)；相差，(e) ；GFP)下获得的GFP-阳性集落的代表性图像。发明详述本发明提供了改善iPS细胞建立效率的方法，其包括在其核重编程步骤中在低氧 条件下培养体细胞。(a)低氧条件如本文所使用的，术语低氧条件表示在细胞培养过程中在环境大气中的氧浓度 显著低于在空气中的氧浓度。特别地，此种条件包括比通常用于普通细胞培养的5-10% C02/95-90%空气的环境大气中的氧浓度更低的氧浓度；例如，在环境大气中18%或更少的 氧浓度是可应用的。优选地，在环境大气中的氧浓度是15%或更少(例如，14%或更少、 13%或更少、12%或更少、11 %或更少等)、10%或更少(例如，9%或更少、8%或更少、7% 或更少、6 %或更少等)、或5 %或更少(例如，4%或更少、3 %或更少、2 %或更少等)。在环境 大气中的氧浓度优选是0. 或更多(例如，0.2%或更多、0.3%或更多、0.4%或更多等)、 0. 5%或更多(例如，0. 6%或更多、0. 7%或更多、0. 8%或更多、0. 9%或更多等)、或或 更多(例如，1. 或更多、1.2%或更多、1.3%或更多、1.4%或更多等)。关于在细胞环境中如何创造低氧条件没有限制；最容易的合适方法是在允许控制 氧浓度的CO2培养箱中培养细胞。此种CO2培养箱可从许多设备制造厂家商购获得(例如， 可以使用由 Thermo Scientific、Ikemoto Scientific Technology、Juji Field Inc、禾口 Wakenyaku Co.，Ltd.制造的用于低氧培养的CO2培养箱)。
在低氧条件下开始细胞培养的时机选择并无具体限制，只要与在正常氧浓度 (20%)下所获得的比较，它不干扰改善iPS细胞建立效率。起始时间可以在核重编程物质 与体细胞接触之前或之后，并且可以在接触的同时。例如，优选在低氧条件下的细胞培养紧 接在使核重编程物质与体细胞接触后开始，或在接触后的给定时间后(例如，1-10 (例如， 2、3、4、5、6、7、8 或 9)天)开始。在低氧条件下的细胞培养持续时间并无具体限制，只要与在正常氧浓度(20% ) 下所获得 的比较，它不干扰改善iPS细胞建立效率；例子包括但不限于，3天或更多、5天或 更多、7天或更多或10天或更多至50天或更少、40天或更少、35天或更少或30天或更少。 在低氧条件下的细胞培养的优选持续时间还依赖环境大气中的氧浓度而变；适当时，本领 域技术人员可以根据所使用的氧浓度来调整细胞培养持续时间。例如，通过使在低氧条件 下与在正常氧浓度下重编程细胞中的ES细胞特异性基因表达比较来决定优选持续时间。 在本发明的一个实施方案中，当用药物抗性作为指示物选择iPS细胞候选集落时，优选到 药物选择开始时从低氧条件恢复正常氧浓度。此外，优选的起始时间和在低氧条件下的细胞培养持续时间还依赖所使用核重编 程物质的选择、在涉及正常氧浓度的条件下的iPS细胞建立效率和其他因素而变。例如，当 3种因子0ct3/4、Klf4和Sox2被引入人体细胞内时，优选在与核重编程物质接触后相对较 早开始(例如，在0-3 (例如，1、2)天后)，细胞在低氧条件下培养3-10 (例如，4、5、6、7、8、 9)天。(b)体细胞来源哺乳动物起源(例如小鼠、人)的任何细胞但除生殖细胞外都可以用作原材料用 于在本发明中产生iPS细胞。例子包括角质化上皮细胞(例如，角质化的表皮细胞)、粘膜 上皮细胞(例如，舌浅层的上皮细胞)、外分泌腺上皮细胞(例如，乳腺细胞)、激素分泌细 胞(例如，肾上腺髓质细胞)、用于代谢或贮藏的细胞(例如，肝细胞)、构成界面的内膜上 皮细胞(例如，I型肺泡细胞)、闭膜管的内膜上皮细胞(例如，血管内皮细胞)、含具有运 输能力的纤毛的细胞(例如，气道上皮细胞)、用于细胞外基质分泌的细胞(例如，成纤维细 胞)、收缩细胞(例如，平滑肌细胞)、血液和免疫系统细胞(例如，T淋巴细胞)、感觉相关 细胞(例如，杆状细胞)、自主神经系统神经元(例如，胆碱能神经元)、感觉器官和外周神 经元的支持细胞(例如，卫星细胞)、中枢神经系统的神经细胞和神经胶质细胞(例如，星形 胶质细胞)、色素细胞(例如，视网膜色素上皮细胞)、其祖细胞(组织祖细胞)等。关于细 胞分化程度并无限制；即使未分化的祖细胞(包括体干细胞)和终末分化的成熟细胞也同 样可以在本发明中作为体细胞来源。未分化的祖细胞的例子包括组织干细胞(体干细胞) 例如神经干细胞、造血干细胞、间质干细胞和牙髓干细胞。作为体细胞来源的哺乳动物选择并无具体限制；然而，当获得的iPS细胞将用于 在人中的再生医学时，从预防移植物排斥的观点来看，特别优选的是体细胞是患者自己的 细胞或从与患者具有相同或基本上相同的HLA类型的其他人(供体)收集。如本文所使用 的，“基本上相同的HLA类型”表示供体的HLA类型与患者的HLA类型匹配，其程度达到当它 们借助于免疫抑制剂等移植给患者时，可以移入已通过诱导得自供体的体细胞的iPS细胞 分化获得的移植细胞。例如，基本上相同的HLA类型包括这样的HLA类型，其中3种主要的 HLAHLA-A、HLA-B和HLA-DR与受体相同(在下文中将应用相同含义)。当获得的iPS细胞并非施用于(移植给)人，而是用作例如用于筛选用于评估患者的药物敏感性或不良反应 的细胞来源时，可能必须收集来自患者或具有相同的与药物敏感性或不良反应相关遗传多 态性的其他人的体细胞，。(C)核重编稈物质在本发明中，“核重编程物质”指能够由体细胞诱导iPS细胞的任何一种或多种物质，其可以由任何物质例如蛋白质性质因子或编码它们的核酸(包括掺入载体中的形式) 或低分子化合物组成。当核重编程物质是蛋白质性质因子或编码其的核酸时，例如下述组 合是优选的(在下文中，仅显示关于蛋白质性质因子的名称)。(l)0ct3/4、Klf4、c_Myc(2)0ct3/4、Klf4、c_Myc、Sox2(Sox2 可由 Soxl、Sox3、Soxl5、Soxl7 或 Soxl8 代替； Klf4可由Klfl、Klf2或Klf5代替；c-Myc可由T58A (活性突变体),N-Myc或L-Myc代替)(3) 0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、Fbxl5、Nanog、Eras、ECAT15-2, Tell、β -连环蛋 白(活性突变体S33Y)(4) 0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、TERT、SV40 大 T(5) 0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、TERT, HPV16E6(6) 0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、TERT, HPV16E7(7) 0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、TERT, HPV6E6、HPV16E7(8) 0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、TERT, Bmil[关于上述显示因子的更多信息，参见WO2007/069666 (关于在上述组合(2)中 用 Soxl8 代替 Sox2 和用 Klfl 或 Klf5 代替 Klf4 的信息，参见 Nature Biotechnology, 26，101-106(2008))；关于组合“0ct3/4、Klf4、c_Myc、Sox2”，还参 β Cell, 126, 663-676(2006)，Cell，131，861-872 (2007)等，关于组合“0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、 hTERT、SV40 大 T”，还参见 Nature，451，141-146 (2008).](9) 0ct3/4、Klf4、Sox2 [参见 Nature Biotechnology, 26，101-106 (2008)](10) 0ct3/4、Sox2、Nanog、Lin28 [参见 Science, 318，1917-1920 (2007)](11)0ct3/4、Sox2、Nanog、Lin28、hTERT、SV40 大 T(参见 Stem Cells,26, 1998-2005(2008))(12)0ct3/4、Klf4、c-Myc , Sox2、Nanog、Lin28 [参见 Cell Research(2008)600-603](13)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、SV40 大 T(还参见 Stem Cells, 26， 1998-2005(2008))(14)0ct3/4、Klf4[还参 β Nature, 454,646-650 (2008) ；CellStem Cell, 2 525-528(2008)](15) 0ct3/4、c-Myc [参见 Nature，454，646-650 (2008)](16) 0ct3/4、Sox2 [参见 Nature, 451,141-146 (2008)、W02008/118820](17) 0ct3/4、Sox2、Nanog (参见 W02008/118820)(18)0ct3/4、Sox2、Lin28(参见 W02008/118820)(19)0ct3/4、Sox2、c_Myc、Esrrb (此处，Essrrb 可由 Esrrg 代替；参见 Nat. Cell Biol. ，11，197-203(2009))
(20) 0ct3/4、Sox2、Esrrb (参见 Nat. Cell Biol.，11，197-203 (2009))(21) 0ct3/4、Klf4、L-Myc(22) 0ct3/4、Nanog (23)0ct3/4(24)0ct3/4、Klf4、c_Myc、Sox2、Nanog、Lin28、SV40LT (参见 Science, 324 797-801(2009))在上述(l)-(24)中，代替0ct3/4，还可以使用Oct家族的其他成员，例如，OctlA、 0ct6等。代替Sox2 (或Soxl、Sox3、Soxl5、Soxl7、Soxl8)，还可以使用Sox家族的其他成员， 例如，Sox7等。代替c-Myc，还可以使用Myc家族的其他成员，例如，L-Myc等。代替Lin28， 还可以使用Lin家族的其他成员，例如，Lin28b等。未落入上述(1)_(24)中，但包含上述(1)_(24)中任一项的所有组成成分，并且进 一步包含任选选择的其他物质的任何组合也可以包括在本发明中的“核重编程物质”范围 中。前提是经历核重编程的体细胞以足以引起核重编程的水平内源表达上述(1)_(24)中 任一项的一种或多种组成成分，除去一种或多种组成成分仅其余组成成分的组合也可以包 括在本发明中的“核重编程物质”范围中。在这些组合中，作为优选核重编程物质的例子，可以提及选自0ct3/4、Sox2、Klf4、 c-Myc、Nanog、Lin28和SV40大T的至少一种、优选2种或更多、更优选3种或更多。如果获得的iPS细胞将用于治疗目的，则优选使用3种因子0ct3/4、Sox2和 Klf4[上述的组合(9)]。如果获得的iPS细胞并非用于治疗目的(例如，用作研究工具用 于药物开发筛选等)，那么5种因子0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2和Lin28，或由5种因子和 Nanog组成的6种因子[上述的组合(12)]是优选的。在这些优选组合中，也可以代替c-Myc 使用L-Myc。参考WO 2007/069666 (在该出版物中，Nanog描述为ECAT4)中提及的NCBI登记号 可获得关于上述蛋白质性质因子的小鼠和人cDNA序列的信息。关于Lin28、Lin28b、ESrrb 和Esrrgd的小鼠和人cDNA序列信息可以分别通过提及下述NCBI登记号获得)；本领域技 术人员能够容易地分离这些cDNA。基因名称小鼠人Lin28NM_145833NM_024674Lin28bNM_001031772 NM_001004317EsrrbNM_011934NM_004452EsrrgNM_011935NM_001438用于用作核重编程物质的蛋白质性质因子可以通过下列制备将获得的cDNA插 入合适的表达载体内，将载体引入宿主细胞内，并且从培养细胞或其条件培养基中回收重 组蛋白质性质因子。同时，当所使用的核重编程物质是编码蛋白质性质因子的核酸时，将获 得的cDNA插入病毒或质粒载体内，以构建表达载体，并且对载体实施核重编程步骤。当物质是蛋白质性质因子时，核重编程物质与体细胞的接触可以使用本身已知的 用于将蛋白质转移到细胞内的方法来达到。此种方法包括例如，使用蛋白质转移试剂的 方法，使用蛋白质转移结构域(PTD)-或细胞穿透肽(CPP)-融合蛋白的方法，显微注射法 等。蛋白质转移试剂是商购可得的，包括基于阳离子脂质的那些，例如BioPOTERProteinDelivery Reagent (Genlantis)、Pro-Ject Protein TransfectionReagent(PIERCE)、 PULSin 递送试剂(Polyplus-转染)和ProVectin(IMGENEX)；基于脂质的那些，例如 Profect-I (Targeting Systems)；基于可透过膜的肽的那些,例如 Penetrain Peptide (Q biogene)和Chariot Kit (Active Motif)等。转移可以根据这些试剂所附的方案——如下 所述的通用操作来达到。在合适溶剂(例如，缓冲溶液例如PBS或HEPES)中稀释一种或多 种核重编程物质，加入转移试剂，使混合物在室温下温育5-15分钟，以形成复合物，在将培 养基更换成无血清培养基后，将这种复合物加入细胞中，并且在37°C下温育细胞1至数小 时。其后，去除培养基，并且替换成含血清培养基。使用蛋白质转移试剂的具体方法公开于 2009/073523 或 WO 2009/032456 中。开发的PTD包括使用蛋白质的跨细胞结构域的那些，例如果蝇衍生的AntP、HIV 衍生的 TAT(Franke 1, A.等人，Cell 55,1189-93(1988)或 Green, Μ. & Loewenstein, P. Μ. Cell 55,1179-88(1988))、穿膜肽(Penetratin) (Derossi, D.等人，J. Biol. Chem. 269，10444-50(1994))、Buforin II (Park, C. B.等人 Proc.Natl Acad. Sci· USA 97， 8245-50(2000))、Transportan (Pooga，Μ·等人 FASEB J. 12，67-77 (1998) )、MAP (模型 兼性肽)(Oehlke，J.等人 Biochim. Biophys. Acta. 1414,127-39 (1998)), K-FGF (Lin, Y. Ζ.等人 J. Biol. Chem. 270，14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M.等人 Nature Cell Biol. 5，352-7 (2003))、朊病毒(Lundberg, P.等人 Biochem. Biophys. Res. Commun. 299， 85-90 (2002))、ρVEC (Elmquist, A.等人 Exp. CellRes. 269，237-44 (2001))、Pep-I (Morris, M. C.等 A Nature Biotechnol. 19，1173-6 (2001))、P印-7 (Gao，C.等 A Bioorg. Med. Chem. 10，4057-65 (2002))、SynBl (Rousselle，C.等人 Mol· Pharmacol. 57，679-86 (2000))、 HN-I(Hong，F. D. & Clayman，G L. Cancer Res. 60，6551-6 (2000))、和 HSV 衍生的 VP22。得自 PTDs 的 CPPs 包括聚精氨酸例如 IlR(Cell Stem Cell，4，381-384 (2009))和 9R(CellStem Cell，4，472-476 (2009))。制备掺入核重编程物质的cDNA和PTD或CPP序列的融合蛋白表 达载体，以允许融合蛋白的重组表达，并且回收融合蛋白用于在转移中使用。这种转移可以 如上所述达到，除不添加蛋白质转移试剂外。使用CPP的具体方法公开于CellStem Cell, 4:472-6(2009)或 Cell Stem Cell,4 :381_4(2009)中。显微注射(在具有约1 μ m的尖端直径的玻璃针中放置蛋白质溶液并且将溶液注 射到细胞内的方法)确保将蛋白质转移到细胞内。核重编程基因的持续过表达增加了癌发生的风险；然而，因为蛋白质性质的重编 程因子在转染的细胞中经历经由蛋白酶的降解并且逐渐消失，所以蛋白质性质因子的使用 在其中需要高安全性的情况下可以是合适的，如在其中获得的iPS细胞用于治疗目的的情 况下。然而，考虑到易于转移到体细胞内，核重编程物质还可以优选以编码蛋白质性质 因子的核酸，而不是实际因子的形式使用。核酸可以是DNA或RNA、或DNA/RNA嵌合体，并且 可以是双链或单链的。优选地，核酸是双链DNA，特别是cDNA。将核重编程物质的cDNA插入合适的表达载体内，所述表达载体包含能够在宿主 体细胞中起作用的启动子。可以使用的表达载体包括例如病毒载体，例如逆转录病毒、慢 病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和仙台病毒，用于在动物细胞中表达的质粒(例如， pAl-ll、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。适当时，可以根据获得的iPS细胞的预期用途进行选择所使用的一类载体。在表达载体中所使用的启动子的例子包括EF-α启动子、CAG启动子、SRa启动 子、SV40启动子、LTR启动子、CMV (巨细胞病毒)启动子、RSV (劳斯(Rous)肉瘤病毒)启 动子、MoMuLV (莫洛尼(Moloney)小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK (单纯疱疹病毒胸苷激酶) 启动子等，优先考虑EF-α启动子、CAG启动子、MoMuLV LTR、CMV启动子、SR α启动子等。
需要时，除启动子外，表达载体还可以包含增强子、多腺苷酸化信号、可选标记基 因、SV40复制起点等。可以使用的可选标记基因的例子包括二氢叶酸还原酶基因、新霉素 抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。当2种或更多核酸被引入细胞内作为核重编程物质时，核酸可以由分别的载体携 带，并且多个核酸可以串联连接，以获得多顺反子载体。在后面的情况下，为了实现有效的 多顺反子表达，希望口蹄疫病毒的2A自身切割肽(参见Science，322，949-953，2008等)、 IRES序列等，优选2A序列连接在各个核酸之间。具有核酸作为核重编程物质的表达载体可以通过本身已知的技术根据选择的载 体引入细胞内。在病毒载体的情况下，例如将包含核酸的质粒引入合适的包装细胞(例如， Plat-E细胞)或互补细胞系(例如，293细胞)内，回收在培养上清液中产生的病毒载体， 并且通过适合于病毒载体的方法使细胞感染载体。例如，使用逆转录病毒载体的具体方法 公开于 W02007/69666、Cell，126，663-676 (2006)和 Cell，131，861-872 (2007)中。使用慢 病毒载体的具体方法公开于Science，318，1917-1920 (2007)中。使用腺病毒载体的具体方 法公开于 Science, 322，945-949 (2008)中。如上所述，当iPS细胞用于治疗目的时，核重编程基因的持续过表达潜在增加了 在由iPS细胞分化的组织和器官中的癌发生风险；因此，作为核重编程物质的核酸优选瞬 时表达，而不整合到细胞的染色体内。根据这个观点，优选使用罕见其整合到染色体内的腺 病毒载体。使用腺病毒载体的具体方法公开于Science，322，945-949 (2008)中。因为腺伴 随病毒载体整合到染色体内的频率也很低，并且就细胞毒性和炎症诱导性而言低于腺病毒 载体，所以它可以作为另一种优选载体提及。因为仙台病毒载体能够稳定存在于染色体外， 并且需要时可以使用siRNA进行降解且去除，所以它也是优选利用的。关于仙台病毒载体， 可以使用 J.Biol. Chem.，282，27383-27391 (2007)和 JP-3602058B 中描述的那种。当使用逆转录病毒载体或慢病毒载体时，即使转基因的沉默已发生，它也可以变 得再活化；因此，例如，优选可以使用其中作为核重编程物质的核酸当变得不需要时使用 Cre-IoxP系统切掉的方法。即，用预先排列在核酸的2个末端处的IoxP序列，诱导iPS细 胞，其后使用质粒载体或腺病毒载体允许Cre重组酶作用于细胞，并且可以切掉由IoxP序 列夹在中间的区域。因为LTR U3区域的增强子-启动子序列可能通过插入突变上调在其 附近的宿主基因，所以更优选避免内源基因通过保留在基因组中的未切掉IoxP序列外的 LTR的表达调节，使用通过如下制备的3'自身灭活的(SIN)LTR 缺失序列，或用例如SV40 的多腺苷酸化序列置换序列。使用Cre-IoxP系统和SIN LTR的具体方法公开于Chang等 人，Stem Cells, 27 1042-1049 (2009)中。同时，作为非病毒载体，可以使用脂转染法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙共沉淀 法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、基因枪法等将质粒载体转移到细胞内。此外，当使用质粒 载体时，它整合到染色体内是罕见的，转基因通过细胞中的DNA酶得到降解且去除；因此，当iPS细胞用于治疗目的时，质粒载体的使用可以是另一种优选的实施方案的模式。使用 质粒作为载体的具体方法在例如Science，322，949-953 (2008)等中描述。另一种优选的非整合型载体是附加型载体，它可在染色体外自主复制。使用附加型载体的具体方法公开于Science，324，797-801 (2009)中。此外，当使用腺病毒或质粒时，转基因可以被整合到染色体内；因此，最终需要通 过Southern印迹或PCR证实不存在基因插入染色体内。为此，如同上述Cre-IoxP系统， 使用其中转基因整合到染色体内其后去除基因的方法可以是有利的。在另一种优选的实 施方案的模式中，可以使用一种方法，其中转基因使用转座子被整合到染色体内，其后使用 质粒载体或腺病毒载体允许转座酶作用于细胞，以便从染色体中完全消除转基因。作为优 选转座子的例子，可以提及piggyBac，得自鳞翅目昆虫的转座子等。使用PiggyBac转座 子的具体方法公开于 Kaji，K.等人，Nature, 458 :771_775 (2009)、Wolt jen 等人，Nature, 458:766-770(2009)中。在另一个实施方案中，在启动子区中的四环素应答元件(Tet-OnR & Tet-Off R Gene Expression Systems, Clontech)可以用于切除转基因。将腺病毒或非病毒表达载体引入体细胞内的操作重复次数并无具体限制，转染可 以执行一次或更多任选选择的次数(例如，1-10次、1-5次等)。当2个或更多种类的腺病 毒或非病毒表达载体被引入体细胞内时，所有这些种类的腺病毒或非病毒表达载体被同时 引入体细胞内是优选的；然而，即使在这种情况下，转染也可以执行一次或更多任选选择的 次数(例如，1-10次、1-5次等)，优选地转染可以重复执行2次或更多次(例如，3次或4 次)。当核重编程物质是低分子化合物时，它与体细胞的接触可以这样达到将所述物 质以合适的浓度溶解于含水或非含水溶剂中，将溶液加入适合于培养从哺乳动物例如人或 小鼠中分离的体细胞的培养基中[例如，包含约5-20%胎牛血清的最小必需培养基(MEM)、 达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基及其组合 等]，从而使得核重编程物质浓度将落入到足以引起体细胞中的核重编程并且不引起细胞 毒性的范围中，并且培养细胞给定的时间段。核重编程物质浓度依赖所使用的核重编程物 质种类而变，并且适当时选择为在约0. InM-约IOOnM的范围内。接触的持续时间并无具体 限制，只要它足以引起细胞的核重编程；通常，可以允许核重编程物质在培养基中共存直至 出现阳性集落。(d) iPS细胞建立效率改进剂近年来，改善通常很低的iPS细胞建立效率的各种物质已相继提出。当与体细胞 连同上述核重编程物质一起接触时，这些建立效率改进剂预期进一步提高iPS细胞建立效率。iPS细胞建立效率改进剂的例子包括但不限于，组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑 制剂[例如，丙戊酸(VPA) (Nat. Biotechnol.，26 (7) =795-797 (2008)]，低分子抑制剂 例如曲古抑菌素A、丁酸钠、MC 1293和M344，基于核酸的表达抑制剂例如针对HDAC的 siRNA 禾Π shRNA(例如，HDACl siRNA Smartpool (Millipore)、针对 HDACl 的 HuSH29 聚 体shRNA构建体(OriGene)等)，等]、DNA甲基转移酶抑制剂(例如，5'-氮杂胞苷) [Nat. Biotechnol. ,26(7) :795_797 (2008) ]，G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂[例如，低分 子抑制剂例如BIX-01294 (Cell Stem Cell，2 :525_528 (2008)]，基于核酸的表达抑制剂例如针对 G9a 的 siRNA 和 shRNA[例如，G9a siRNA (人)(Santa CruzBiotechnology)等)， 等]，L-通道钙激动剂(例如，Bayk8644) [CellStem Cell, 3，568-574 (2008) ]，p53 抑制 剂[例如，针对 p53 的 siRNA 和 shRNA (Cell Stem Cell，3，475-479 (2008) )、UTFl [Cell Stem Cell，3，475-479 (2008)]，Wnt 信号诱导物(例如，可溶性 Wnt3a) [CellStem Cell, 3，132-135 (2008) ]，2i/LIF[2i是丝裂原活化蛋白激酶信号和糖原合酶激酶_3的抑制剂， PloS Biology, 6 (10)，2237-2247 (2008)]等。如上所述，基于核酸的表达抑制剂可以为具有 编码siRNA或shRNA的DNA的表达载体形式。
在上述核重编程物质的组成成分中，例如SV40大T等也可以包括在iPS细胞建立 效率改进剂的范围中，因为它们被视为体细胞核重编程的非必需的但是辅助的因子。在关 于核重编程的机制仍不明了的情况下，并非核重编程必需的辅助因子可以方便地被视为核 重编程物质或iPS细胞建立效率改进剂。因此，因为体细胞核重编程过程被理解为起因于 一种或多种核重编程物质和一种或多种iPS细胞建立效率改进剂与体细胞接触的总体事 件，所以似乎本领域技术人员无需总是区分重编程物质和iPS细胞建立效率改进剂。如上所述对于下列3种情况的每一种都可以达到iPS细胞建立效率改进剂与体细 胞的接触(a)改进剂是蛋白质性质因子，(b)改进剂是编码蛋白质性质因子的核酸，和(c) 改进剂是低分子化合物。iPS细胞建立效率改进剂可以和核重编程物质同时与体细胞接触，或任何一种可 以预先接触，只要与不存在改进剂的情况下比较，iPS细胞由体细胞的建立效率得到显著改 善。在一个实施方案中，例如，当核重编程物质是编码蛋白质性质因子的核酸和iPS细胞建 立效率改进剂是化学抑制剂时，iPS细胞建立效率改进剂可以在基因转移处理后细胞培养 给定时间长度后被加入培养基中，因为核重编程物质涉及从基因转移处理到蛋白质性质因 子的大量表达的给定延时长度，而iPS细胞建立效率改进剂能够快速作用于细胞。在另一 个实施方案中，当核重编程物质和iPS细胞建立效率改进剂都以病毒或非病毒载体形式使 用时，例如，2种可以被同时引入细胞内。从哺乳动物例如小鼠或人中分离的体细胞可以使用本身已知适合于其培养的培 养基进行预培养，这依赖于细胞的种类。此种培养基的例子包括但不限于包含约5-20%胎 牛血清的最小必需培养基(MEM)、达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、 199培养基、F12培养基及其组合等。可获得通过在5%或更少的低血清浓度下进行预培养， 改善iPS细胞建立效率的报告(例如，W02009/006997)。当在使细胞与一种或多种核重编 程物质和一种或多种iPS细胞建立效率改进剂的接触中使用例如转染试剂，例如阳离子脂 质体时，有时优选先用无血清培养基替换培养基，以防止转染效率中的减少。在一种或多种 核重编程物质(和一种或多种iPS细胞建立效率改进剂)与细胞接触后，可以在适合于培 养例如ES细胞的条件下培养细胞。在小鼠细胞的情况下，通过向普通培养基中添加作为分 化抑制剂的白血病抑制因子(LIF)进行培养。同时，在人细胞的情况下，希望加入碱性成纤 维细胞生长因子(bFGF)和/或干细胞因子(SCF)代替LIF。通常，在作为饲养细胞的小鼠 胚胎衍生的成纤维细胞(MEF)的共存在下培养细胞，所述MEF用辐射或抗生素处理，以终 止其细胞分裂。通常，STO细胞等通常用作MEF，但对于诱导iPS细胞，通常使用SNL细胞 [McMahon，A. P. & Bradley, A. Cell 62，1073-1085 (1990)]等。与饲养细胞的共培养可以在 核重编程物质接触前、接触时或接触后(例如，10天后)开始。
iPS细胞的候选集落可以通过用药物抗性和报道物活性作为指示剂的方法，以及 通过基于形态目测的方法进行选择。作为前者的例子，使用重组体细胞选择对于药物抗 性和/或报道物活性阳性的集落，在所述重组体细胞中药物抗性基因和/或报道基因靶 向在多能细胞中高度特异性表达的基因的基因座(例如，Fbxl5、Nanog, 0ct3/4等，优选 Nanog或0ct3/4)。此种重组体细胞的例子包括来自具有敲入Fbxl5基因座中的β geo (其 编码β-半乳糖苷酶和新霉素磷酸转移酶的融合蛋白)基因的小鼠的MEF[Takahashi & Yamanaka, Cell，126，663-676 (2006)]、来自具有整合在Nanog基因座中的绿色荧光 蛋白(GFP)基因和嘌呤霉素抗性基因的转基因小鼠的MEF[Okita等人，Nature, 448, 313-317(2007)]等。同时，基于形态目测的后面一种方法的例子包括由Takahashi等人在 Cell, 131,861-872(2007)中描述的方法。尽管使用报道细胞的该方法是方便和有效 的，但 从安全性的观点来看，当iPS细胞制备用于人治疗目的时，希望通过目测选择集落。当3种 因子0ct3/4、Klf4和Sox2用作核重编程物质时，建立的集落数目减少，但所得到的集落大 多数是与ES细胞相当的高质量的iPS细胞，从而使得甚至无需使用报道细胞也可以有效建 立iPS细胞。选择的集落细胞作为iPS细胞的同一性可以这样加以证实通过对Nanog(或 0ct3/4、Fbxl5)报道物(GFP阳性、β -半乳糖苷酶阳性等)的阳性应答和对选择标记(嘌 呤霉素抗性、G418抗性等)的阳性应答，以及通过可见ES细胞样集落的形成，如上所述。然 而，为了确保更高的准确度，可以执行诸如分析各种ES细胞特异性基因的表达且将选择的 细胞移植给小鼠且证实畸胎瘤形成的测试。因此建立的iPS细胞可以用于各种目的。例如，通过利用用于ES细胞的分化诱导 的报道方法，可以诱导iPS细胞分化成各种细胞(例如，心肌细胞、血细胞、神经细胞、血管 内皮细胞、胰岛素分泌细胞等)。因此，使用从患者收集的体细胞诱导iPS细胞将使得基于 自体移植的干细胞治疗成为可能，其中iPS细胞分化成所需细胞(患者的受影响器官的细 胞、对疾病具有疗效的细胞等)，并且将分化细胞移植给患者。不是从患者而是从具有与患 者具有相同或基本上相同的HLA类型的其他人收集的体细胞可以用于诱导iPS细胞，这分 化成所需细胞用于在给患者的移植中使用。此外，因为由iPS细胞分化的功能细胞(例如， 肝细胞)被认为比相应的现有细胞系更好地反映功能细胞在体内的实际状态，所以它们还 可以适合于用于就药物候选化合物的有效性和毒性的体外筛选等。本发明在下文借助于下述实施例进一步详细描述，然而，本发明决不限制于所述 实施例。
实施例实施例1 低氧培养法对iPS细胞建立的作用(1)具有Nanog报道物的小鼠用作实验系统。通过将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和 嘌呤霉素抗性基因插入购自BACPAC Resources的BAC (细菌人工染色体)的Nanog基因座 内制备所使用的 Nanog 报道物[Okita K.等人，Nature 448，313-317 (2007)]。小鼠 Nanog 基因在多能细胞例如ES细胞和早期胚胎中特异性表达。已变得对这种报道物阳性的小鼠 iPS细胞已知就分化潜能而言几乎等价于ES细胞。对得自具有这种Nanog报道物的Nanog 报道小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和尾尖成纤维细胞(TTF)借助于逆转录病毒进行转染，以建立iPS细胞，并且计算表达来自Nanog报道物的EGFP的集落，以评估iPS细胞建立效率。通过将每种逆转录病毒表达载体[pMXs_0ct3/4、pMXs_Sox2、pMXs_Klf4、 pMXs-cMyc :Cell，126，663-676 (2006)]引入在前一天以 2 X IO6 细胞 /IOOmm 培养皿 (Falcon)接种的Plat-E细胞(Morita，S.等人，Gene Ther. 7，1063-1066)内，制备用于重编 程的逆转录病毒。所使用的培养基是DMEM/10 % FCS [补充有10 %胎牛血清的DMEM (Nacalai Tesque)]，并且细胞在5% CO2的存在下于37°C进行培养。对于载体引入，将27 μ L FuGene6 转染试剂(Roche)置于 300 μ IOpti-MEM I Reduced-Serum Medium(Invitrogen)中，并且 允许培养基在室温下静置5分钟。其后，加入9 μ g每种表达载体，并且允许培养基在室温 下静置15分钟，并且随后加入Plat-E培养肉汤。在第2天时，用新鲜培养基替换Plat-E 培养上清液。在第3天时，回收培养上清液并且过滤通过0. 45 μ m无菌滤器(Whatman)，加 入聚凝胺(Nacalai Tesque)以获得4 μ g/mL的浓度，并且将其用作病毒液体。从在Nanog报道小鼠受精后13. 5天时的胎儿分离小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，并且用培养基(DMEM/10% FCS)进行培养。所使用的尾尖成纤维细胞(TTF)是如下获得的将 Nanog报道小鼠的尾尖切碎，将组织小片静置在明胶包被的6孔皿上，将它们在原代培养细 胞起始培养基(Toyobo Life Science Department)中培养5天，并且用DMEM/10% FCS培 养基进一步培养从尾尖组织移动到皿上的成纤维细胞。不表达Nanog基因，则MEF和TTF不表达EGFP，并且不发出绿色荧光。不表达嘌 呤霉素抗性基因，则MEF和TTF对抗生素嘌呤霉素敏感。像这样，将MEF和TTF以IXlO5 细胞/孔接种至用0. 1 %明胶(Sigma)包被的6孔培养板(Falcon)。所使用的培养基是 DMEM/10% FCS,并且细胞在37°C和5% CO2下进行培养。第二天，加入每种逆转录病毒液体 以通过过夜感染引入基因。在病毒感染后第3天开始，使用补充LIF的ES细胞培养基[通过向DMEM(Nacalai Tesque)中加入15 %胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、100 μ M非必需氨基 B. (Invitrogen)UOOyM 2- Jfl S Zi Il (Invitrogen) >50U/mL ^MM (Invitrogen)禾口 50mg/mL链霉素(Invitrogen)制备]培养细胞。在感染后第4天时，回收MEF和TTF的 培养基，并且通过加入ImL PBS洗涤细胞。在去除PBS后，加入0.25%胰蛋白酶/ImM EDTA(Invitrogen)，并且允许反应在37°C下进行约5分钟。细胞浮起后，通过加入ES细胞 培养基使它们悬浮；将IX IO4MEF细胞(当引入4种因子0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc时) 或IX IO5MEF细胞(当引入3种因子0ct3/4、Sox2和Klf4时)接种至具有先前接种在其 上的饲养细胞的100-mm皿。对于TTF细胞，以相同方式接种2X IO4TTF细胞(当引入上述 4种因子时)UXlO5TTF细胞(当引入上述3种因子时)、或1.5X IO5TTF细胞(当引入3 种因子0ct3/4、Klf4和c-Myc时)。所使用的饲养细胞是用丝裂霉素C处理以终止其细胞 分裂的 SNL 细胞[McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62，1073-1085 (1990)]。随后，每 2 天 用新鲜供应更换ES细胞培养基，直至集落变得可被观察到。在感染后第5至14天之间，在设为正常氧浓度(20%)或低氧浓度(5%、1%)的 培养箱(Thermo Scientific)中培养细胞。对于用 4 种因子(0ct3/4、Sox2、Klf4、c_Myc) 感染的细胞，用嘌呤霉素(1.5yg/mL)的选择在第14天时开始，并且对于用3种因子 (0ct3/4、Sox2、Klf4或0ct3/4、Klf4、c-Myc)感染的细胞在第21天时开始。对于4种因子集落在约第10天时出现，并且对于3种因子在约第20天时出现，并且逐渐变得GFP阳性。在感染后第21和28天时，计数GFP阳性集落；在正常氧浓度(20%)下培养的细 胞和在低氧浓度(5%、1% )下培养的那些之间进行比较。关于MEF的结果显示于表1中； 关于TTF的结果显示于表2和3中。这些结果证实iPS细胞建立效率由于在低氧条件下的 细胞培养而增加。特别地，当氧浓度为5%时，获得良好结果(表1-3)。在引入3种因子的 情况下，发现不仅可以用0ct3/4、Sox2和Klf4，还可以用0ct3/ 4、Klf4和c_Myc建立iPS 细胞(表2)。表 1
b)、c)和d))。此外，低氧处理增加在来自4或3因子转导的MEF的总集落中的GFP阳性集 落百分比(图14e)和f))。在低氧处理后获得的GFP阳性集落在形态和大小方面与在正常 氧浓度条件下获得的那些相当(图16)。碱性磷酸酶染色显示在5%氧下的培养增加具有 阳性碱性磷酸酶活性的集落数目(图17)。为了研究GFP阳性细胞是否较早检测出，从转导后第5天到第9天，在20 %氧下或 在5%氧下含或不含2mM丙戊酸(VPA)培养4因子转导的MEF，并且在第9天时实施流式细 胞术分析。在转导后第9天时，4种因子的逆转录病毒表达诱导0. 01%的细胞成为GFP阳 性。用低氧或用VPA处理4因子转导的MEF4天分别使GFP阳性细胞百分比增至0. 40%和 0.48%。此外，用低氧和VPA的共处理使GFP阳性细胞百分比增至2. 28%。这些数据暗示 GFP阳性细胞可以较早被检测出，并且低氧培养与VPA具有协同作用(图15a)、b)、c)、d) 和 e))。随后，使用成人表皮成纤维细胞(HDF)检查低氧培养的作用。借助于逆转录病毒 引入全都得自人的4种因子(0CT3/4、S0X2、KLF4、c-MYC)或3种因子(0CT3/4、S0X2、KLF4)， 如Cell，131,861-872(2007)中所述。病毒感染后6天，回收细胞并且再接种到饲养细胞 上。所使用的饲养细胞是用丝裂霉素C处理以终止其细胞分裂的SNL细胞[McMahon，A. P. & Bradley, A. Cell 62，1073-1085 (1990)]。第二天，用通过将 4ng/ml 重组人 bFGF (WAKO)加 入灵长类动物ES细胞培养(ReproCELL)中制备的培养基使细胞开始细胞培养。在感染后第7天和集落计数日(感染后第24和32天)之间，在设为正常氧浓度 (20%)或低氧浓度(5%、1%)的培养箱中培养细胞。结果显示于表4中。当引入4种因 子时，与正常氧浓度比较，iPS细胞建立效率在5%的氧浓度下升高。同时，当氧浓度为 时或当引入3种因子时，在这个实验中检查的培养条件下未获得iPS细胞，这涉及细胞在低 氧条件中的长期维持。这暗示用更极端的低氧条件，例如的氧浓度，或利用3种因子的 引入，这基本上产生比4种因子更低的iPS细胞建立效率，可能必须使在低氧条件下的细胞 培养具有较短的持续时间。表 4
实施例2 低氧培养法对iPS细胞建立的作用(2)进行实验以测定低氧培养法对于仅引入2种基因0ct3/4和Klf4是否有效。实验 使用来自与实施例1中相同的Nanog报道小鼠的MEF。以与实施例1相同的方式，使MEF感在感染后第5至14天之间，在设为正常氧浓度(20%)或低氧浓度(5%)的培养 箱(Thermo Scientific)中培养细胞。无需药物选择继续培养，直至第28天计数GFP阳性 集落时。结果显示于图1中。执行4次独立实验。当氧浓度为20%时，集落仅在4次实验 之一中出现，而当氧浓度为5%时，集落在所有4次实验中都出现。如图1中所示，与20% 氧浓度比较，GFP阳性集落的数目对于在5%氧浓度下的细胞培养显著增加&<0.05)；发 现低氧培养在提高iPS细胞建立效率方面有效。执行进一步的实验以测定低氧培养法是否对于2种基因0ct3/4和c-Myc的转 移也有效。以与上述用0ct3/4和Klf4描述相同的方式使用Nanog-MEF执行实验。在感 染后第5至14天之间，在设为正常氧浓度(20%)和低氧浓度(5%)的培养箱(Thermo Scientific)中培养细胞。无需药物选择继续培养，直至第42天检查GFP阳性集落时。因此， 当培养在正常氧浓度(20% )下进行时，未出现GFP阳性集落，而当培养在低氧浓度(5% ) 下进行时，集落出现(图2)。这些发现显示iPS细胞建立效率可以通过在低氧条件下培养 起始细胞得到改善，即使引入2种基因0ct3/4和c-Myc。实施例3 在小鼠iPS细胞中关于未分化状态标记的表达使用Rever Tra Ace试剂盒(Takara)通过RT-PCR分析检查在实施例1和2中建 立的MEF衍生的iPS细胞中关于未分化状态标记的表达。所使用的引物序列由SEQ ID NO 1-18显示。RT-PCR结果显示于图3中。通过在低氧浓度(5%、1%)下的细胞培养由引入4 种基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc)、3 种基因(0ct3/4、Klf4、Sox2)或 2 种基因(0ct3/4、 Klf4)建立的iPS细胞全都表达在ES细胞中特异性表达的基因，即0ct3/4、Sox2、Klf4、 c-Myc、Nanog、Rexl和ECAT1，表达的量等价于在小鼠ES细胞(RF8)和过去用4种基因建立 的iPS细胞[20D17 :Nature, 448, 313-317 (2007)]中的那些。因为未观察到引入的0ct3/4 基因(0ct3/4(Tg))的表达，所以证实沉默发生。基于这些结果，在低氧条件下建立的细胞 被鉴定为iPS细胞。实施例4 建立的iPS细胞用于畸胎瘤形成的潜力在低氧浓度(5% )下用0ct3/4和Klf4建立的小鼠iPS细胞(527CH5-2)允许形 成畸胎瘤，如Cell，126，663-676 (2006)中所述。具体地，将1 X 106iPS细胞皮下注射到免 疫缺陷小鼠内；4周后，分离呈现的畸胎瘤(图4中的上图)。将每个畸胎瘤切碎，并且在含 4%甲醛的PBS(-)中固定。石蜡包膜的组织进行切片并且用苏木精-伊红进行染色。结果 显示于图4中的下图中。在组织学上，肿瘤由多种细胞组成，其中观察到软骨组织、内胚层 上皮组织、肌肉组织和角质化上皮组织。因此，证实了 iPS细胞的多能性。实施例5 嵌合小鼠的产生将在实施例1和2中在低氧浓度(5%)下由引入2、3或4种基因建立的iPS细胞 显微注射到来自ICR小鼠的胚泡内。因此，产生成年嵌合体。结果显示于图5中。实施例6 :iPS细胞系的核型在实施例1和2中在低氧处理后获得的iPS细胞系(521AH5-1和527CH5-1)的核 型，并且这些细胞系显示正常核型(图18)。
实施例7 低氧培养的持续时间对人iPS细胞建立的作用检查了在低氧条件(5%)下的细胞培养起始时间和持续时间对人iPS细胞建立效 率的作用。所使用的体细胞是成人表皮成纤维细胞(成人HDF)。关于低氧培养的时间表显 示于图6中。首先，如Cell，131,861-872(2007)中所述，使用慢病毒允许HDF表达小鼠同 向性病毒受体Slc7al基因。借助于逆转录病毒将全都得自人的4种因子(0ct3/4、Sox2、 Klf4、c-Myc)或 3 种因子(0ct3/4、Sox2、Klf4)引入这些细胞(8X105 细胞)内，如 Cell， 131,861-872(2007)中所述。病毒感染后6天，回收细胞并且再接种到饲养细胞上(在引入 4种基因的情况下，1 X 105细胞/100mm皿；在引入3种基因的情况下，5X 105细胞/100mm 皿)。所使用的饲养细胞是用丝裂霉素C处理以终止其细胞分裂的SNL细胞[McMahon，A. P. & Bradley, A. Cell62,1073-1085 (1990)]。第二天，使用通过将 4ng/ml 重组人 bFGF (WAK0)加 入灵长类动物ES细胞培养(ReproCELL)中制备的培养基开始细胞培养。细胞培养在6种条件下继续(1)在正常氧浓度(20%)下直至感染后第40天时， 或在低氧浓度(5%)下从感染后第7天开始1周(2)、1.5周(3)、2周(4)、或3周(5)，并 且随后在正常氧浓度(20%)下直至感染后第40天时，和(6)在低氧浓度(5%)下在感染 后第7到40天之间。还检查的是通过在低氧浓度(5%)下在感染后当天到再其接种到饲 养细胞上之间预培养细胞，并且在上述的条件(1)至(6)中的任何下进一步培养它们获得 的结果。计数到感染后第24、32和40天时出现的iPS细胞集落。这3种计数的结果一起 显示于图7中。利用4种基因的引入，与正常氧浓度(20% )比较，当细胞在上述的低氧浓度条件 (2)至(6)的任何下培养时，iPS细胞建立效率较高。此外，即使利用在低氧浓度下的预培 养，也观察到在增加iPS细胞建立效率中的作用。利用4种基因的引入在感染后第40天时 获得的集落图像显示于图8中。利用3种基因的转移，与正常氧浓度比较，当在低氧浓度下执行预培养时建立更 大数目的iPS细胞(图7)。利用4 种基因(0Ct3/4、Klf4、SOX2、C-MyC)的引入，在上述的条件(1)、(2)、(4)、 (5)和(6)下执行3次独立实验。结果一起显示于图9中。在所有情况下，与正常氧浓度 (20%)比较，当培养在低氧浓度(5%)下进行时，iPS细胞建立效率提高。特别地，通过在 低氧浓度下从感染后第7天开始2周或更久的细胞培养获得显著作用。实施例8 在人iPS细胞中关于未分化状态标记的表达使用Rever Tra Ace试剂盒(Takara)通过RT-PCR分析检查在实施例7中建立的 成人HDF衍生的iPS细胞中关于未分化状态标记的表达。所使用的引物序列由SEQ ID NO 19-36显示；RT-PCR结果显示于图10中。通过在低氧浓度(5% )下的细胞培养由引入4种 基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc)或 3 种基因(0ct3/4、Klf4、Sox2)建立的 iPS 细胞全都 表达在ES细胞中特异性表达的基因，即0ct3/4、Sox2、Klf4、c_Myc、Nanog、Rexl、⑶F3和 ESG1，表达的量等价于过去用4种基因建立的iPS细胞[201B2 :Cell，131，861—872 (2007)] 中的那些。基于这些结果，在低氧浓度下建立的细胞被鉴定为iPS细胞。此外，这些iPS细胞对于碱性磷酸酶都是强阳性的，并且免疫细胞化学染色显示 所有iPS细胞都表达Nanog、SSEA3和SSEA4 (图11)。实施例9 体外分化诱导
将人iPS细胞接种至低结合皿，并且如Cell，131,861-872(2007)中所述培养8 天以形成胚状体(EB) (100mm皿)，其中，通过引入4种基因0ct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc, 并且在5%氧浓度下在感染后第7天到第40天之间培养起始细胞建立所述人iPS细 胞(70AH5-2、70AH5-6)。培养8天后，使用抗体使胚状体染色，所述抗体针对内胚层细 胞分化标记甲胎蛋白(R&D systems)，中胚层细胞分化标记平滑肌肌动蛋白(DAK0)、结 蛋白(NeoMarkers)和波形蛋白(Santa Cruz)，以及外胚层分化标记0III-微管蛋白 (Chemicon)和GFAP(DAKO)。结果显示于图12中。这种染色证实这些标记的表达，证实建 立的人iPS细胞具有用于三胚层分化的潜力。实施例10 关于建立的iPS细胞的畸胎瘤形成的潜力就畸胎瘤形成的潜力检查人iPS细胞，其中，通过引入4种基因并且在5%氧浓度 下培养起始细胞建立所述人iPS细胞(70AH5-2)。在补充有重组人bFGF(4ng/ml)和Rho 激酶抑制剂Y-27632 (10 u M)的灵长类动物ES细胞培养基(IteproCELL)中培养人iPS细胞 (70AH5-2)。1小时后，用胶原IV处理并且收集细胞，这之后经由离心回收它们，并且悬浮于 补充有Y-27632(10iiM)的DMEM/F12中。将已变得汇合(100mm皿)的四分之一细胞量注 射到SCID小鼠的睾丸内。9周后，将所得到的肿瘤切碎，并且在含4%甲醛的PBS(-)中固 定。对石蜡包埋的组织进行切片并且用苏木精-伊红进行染色。结果显示于图13中。在 组织学上，肿瘤由多种细胞组成，其中观察到神经上皮组织、视网膜上皮组织、骨样组织、平 滑肌组织和内胚层上皮组织。因此，证实了 iPS细胞的多能性。实施例11 低氧培养对增殖、存活和基因表达的作用使用膜联蛋白V的流式细胞术分析证实低氧培养对小鼠ES细胞或4因子转导的 MEF无保护作用(图19)。此外，低氧培养显示对小鼠ES细胞的增殖没有作用(图20a))。 尽管从转导后第1天到第4天的低氧温育对模拟转导的MEF的增殖没有显著作用，但它对 4因子转导的MEF有显著作用(图20b))。为了研究细胞在重编程过程中的表达谱，执行微 阵列分析和定量实时RT-PCR。从第1天到第4天，在低氧和正常氧浓度下培养的4因子转 导的MEF的微阵列分析显示，73. 2%的ES细胞特异性基因(总共1045种基因中的765种 基因)在用低氧处理的细胞中上调，并且85.8%的MEF特异性基因(总共1142种基因中的 980种基因)下调(图21a)和b))。此外，定量实时RT-PCR分析证实，在低氧处理3天后， 内源0ct3/4和Nanog的表达在4因子转导的MEF中分别增加3. 4倍和2. 1倍(图22a)和 b))。为了排除低氧通过刺激ST0细胞来增强iPS细胞产生的可能性，在不含ST0细胞 的饲养层的低氧培养下检查了 iPS细胞的生长情况。图23显示在5%氧下的培养增加了 GFP阳性集落的数目，暗示重编程的低氧增强并非由ST0细胞介导。实施例12 通过在低氧培养下表达质粒载体的瞬时转染建立iPS细胞如先前所述(0kita，K，等人Science 322，949-953，(2008))执行由质粒转染产生 iPS细胞。简言之，将包含Nanog-GFP-IRES-Puror报道物的MEF以1. OX 105细胞/孔接种 在6孔板中(第0天)。在第1、3、5和7天时，用pCX-0KS-2A和pCX-c-Myc转染细胞，并且 在第9天时，用胰蛋白酶收获细胞，并且再接种到具有ST0饲养细胞的100-mm皿上。在第 25天时，计数GFP阳性集落的数目。对于低氧处理，从第10天到第24天，细胞在5%氧下 培养。
25 表5显示低氧培养使GFP阳性集落数目增加2. 0倍。表5
实施例13 通过在低氧培养下的piggyback转染系统建立iPS细胞
如先前所述且具有某些修改(Woltjen等人，Nature ；458 =766-70, (2009))执行由
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26piggyback(PB)转座的直接重编程。简言之，将包含Nanog-GFP-IRES-Purc/报道物的MEF以 1. 0X105细胞/孔接种在6孔板中。培养24小时后，Fugene HD (Roche, Switzerland)用于 为细胞转染PB-TET-MKOS、PB-CA-rtTA Adv和PB转座酶表达载体。24小时后，用含多西环 素的培养基(1. 5ug/ml)替换培养基(第0天)。细胞在低氧或正常氧条件下进行培养，并且 在第 12 天时计数 GFP 阳性集落数目。PB-TET-MK0S 和 PB-CA-rtTA adv 由 Addgene (Addgene 质粒20910和20959)提供。PB转座酶构建体通过PCR由pBSII-IFP2_orf (来自Dr. Malcolm J. Fraser, Jr，University of Notre Dame的慷慨赠予)进行扩增，并且插入经由CAG-启 动子(pCX-EGFP)驱动的表达载体内。图24显示低氧处理5和10天分别使GFP阳性集落数目增加2. 9倍和4. 0倍。这 些数据暗示低氧可以增加通过非病毒载体例如Piggybac转座系统的iPS产生效率。虽然本发明已着重于优选实施方案进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的 是，优选实施方案可以进行修改。本发明意欲本发明可以通过除本说明书中详细描述的那 些外的方法来实现。因此，本发明包含了在所附“权利要求”的要旨和范围中包含的所有修 改。此外，本文引用的所有出版物包括专利和专利申请中公开的内容在此通过参考整 体引入，其程度与它们已在本文中公开一样。本申请基于美国临时专利申请号61/084，842,61/141, 177和61/203，931，所述美 国临时专利申请的内容在此通过参考引入。
权利要求
改善诱导的多能干细胞建立效率的方法，其包括在其核重编程步骤中在低氧条件下培养体细胞。
2.权利要求1的方法，其中在环境大气中的氧浓度为_10%。
3.权利要求2的方法，其中所述在环境大气中的氧浓度为-5%。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中核重编程物质是下述物质，或编码它们的 核酸
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其包括将丙戊酸在所述核重编程步骤中用作效 率改进剂的进一步步骤。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中在接触核重编程物质后，在低氧条件下执 行培养体细胞超过3天。
全文摘要
提供的是改善诱导的多能干细胞建立效率的方法，其包括在其核重编程步骤中在低氧条件下培养体细胞。
文档编号C12N5/10GK101848994SQ20098010006
公开日2010年9月29日 申请日期2009年7月30日 优先权日2008年7月30日
发明者吉田善纪, 山中伸弥 申请人:国立大学法人京都大学