。
[0065] 本申请所用的"严格条件"指在该条件下一种核酸分子可以以比与其他序列可检 测的更高的程度与其靶杂交（例如至少高于背景2倍）。严格条件可以是序列依赖性的，在 不同的环境下有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与核酸分子 100%互补的靶序列（即同源探测）。可供选择地，可调整严格条件以允许序列中的一些错 配，从而检测较低程度的相似性（即异源探测）。
[0066] 通常，严格条件可以是盐浓度小于约I. 5M Na+,通常约0.0 lM到1.0 M Na+(或其他 盐），约pH 7. 0到8. 3,对于短分子（例如10到50个核苷酸）温度至少约30°C，对于长分 子（例如大于50个核苷酸）至少约60°C。也可以通过添加甲酰胺之类的去稳定剂实现严 格条件。
[0067] 本申请中所用的〃约〃指统计学意义范围内的值，如所称的浓度、长度、分子量、 pH、序列同一性、时间范围、温度或体积。这种值或范围可以在一个数量级的范围内，通常在 给定数值或范围的20%以内，更通常在10%以内，更加通常在5%以内。"约"所包含的可 允许的变化依赖于研宄中的具体系统，本领域技术人员可以容易地理解。
[0068] 示例性的低严格条件包括于约37°C下，在约30%到约35%甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS(十二烷基硫酸钠）的缓冲溶液中杂交，在约50°C到约55°C下，在约IX至2X SSC(20X SSC = 3. OM NaCl/0.3M柠檬酸钠）中清洗。清洗缓冲液任选地可包含约0.1 %到约1 % SDS0
[0069] 示例性的中等严格条件于约37°C下，在约40%到约45%甲酰胺，1.0 M NaCl, 1% SDS的缓冲溶液中杂交，在约55°C到约60°C下，在约0. 5X至IX SSC中清洗。清洗缓冲液任 选地可包含约0. 1 %到约1% SDS。
[0070] 示例性的高等严格条件于约37°C下，在约50%甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS的缓冲 溶液中杂交，在约60°C到约65°C下，在约0.1 X SSC中清洗。清洗缓冲液任选地可包含约 0· 1%到约 1% SDS。
[0071] 杂交过程一般可以是小于约24小时，常为约4到约12小时。清洗过程可以是 至少足以达到平衡的时间长度。有关此种条件的其他教导是在本领域容易获得的，例如 在 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed. (Sambrook&Russell eds. , Cold Spring Harbor Press 2001);以及 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等6(18.，]〇1111町167&3〇118 1995)中。
[0072] 异源病原体-特异性蛋白酶识别序列可以是从约5个氨基酸到约15个氨基酸。植 物病原体-特异性蛋白酶，植物病原体起源，蛋白酶底物蛋白质以及内源蛋白酶识别序列 的列表示于表1，其可用作异源蛋白酶识别序列资源。
[0073] 表1:植物病原体-特异性蛋白酶，植物病原体起源，蛋白酶底物蛋白质和内源 蛋白酶识别序列.
[0074]
【主权项】
1. 重组核酸分子，其包含编码至少一种具有异源病原体-特异性蛋白酶识别序列的、 植物病原体-特异性蛋白酶的底物蛋白质。
2. 权利要求1的重组核酸分子，其中所述底物蛋白质选自AvrPphB敏感I (PBSl)和抗 丁香假单胞菌斑点致病变种I(RPMl)相互作用蛋白质4(RIN4)。
3. 权利要求2的重组核酸分子，其中所述底物蛋白质选自拟南芥AvrPphB敏感 I(PBSl)和拟南芥抗丁香假单胞菌斑点致病变种I(RPMl)相互作用蛋白质4 (RIM)。
4. 权利要求1的重组核酸分子，其中所述异源病原体-特异性蛋白酶识别序列为约5 个氨基酸到约15个氨基酸。
5. 权利要求1的重组核酸分子，其中所述异源病原体-特异性蛋白酶识别序列选自 ⑶KSHVS(SEQ ID NO:1)，VPKFGDW(SEQ ID NO:2) ,QEHGCQL(SEQ ID NO:3) ,ENLYFQG(SEQ ID NO:4)，EPVSTQG(SEQ ID NO: 27)和 PWQAQS (SEQ ID NO: 28)。
6. 权利要求2的重组核酸分子，其中当所述底物蛋白质是PBSl时，所述异源病原 体-特异性蛋白酶识别序列位于第约240位氨基酸到第约250位氨基酸之间。
7. 权利要求2的重组核酸分子，其中当所述底物蛋白质是RIM时，所述异源病原 体-特异性蛋白酶识别序列位于第约142位氨基酸到第约164位氨基酸之间。
8. 经修饰的植物病原体-特异性蛋白酶的底物蛋白质，其包含具有异源蛋白酶识别序 列的氨基酸序列，其中所述底物蛋白质由权利要求1的重组核酸分子编码。
9. 载体，其包含权利要求1的重组核酸分子。
10. 经转化的植物细胞，其包含权利要求1的重组核酸分子。
11. 权利要求10的经转化的植物细胞，其中所述植物细胞来自选自单子叶植物和双子 叶植物的植物。
12. 经转化的植物，其包含权利要求1的重组核酸分子。
13. 权利要求12的经转化的植物，其中所述植物选自单子叶植物和双子叶植物的植 物。
14. 权利要求12的植物的经转化的种子。
15. 保护植物免受植物病原体感染的方法，所述植物病原体分泌至少一种特异性蛋白 酶，所述方法包含以下步骤： 将编码至少一种植物病原体-特异性蛋白酶的底物蛋白质的核苷酸序列引入所述植 物，所述底物蛋白质内具有异源病原体-特异性蛋白酶识别序列。
16. 权利要求15的方法，其中所述底物蛋白质选自AvrPphB敏感I (PBSl)和抗丁香假 单胞菌斑点致病变种I(RPMl)相互作用蛋白质4 (RIM)。
17. 权利要求15的方法，其中所述异源病原体-特异性蛋白酶识别序列选自 ⑶KSHVS(SEQ ID NO:1)，VPKFGDW(SEQ ID NO:2) ,QEHGCQL(SEQ ID NO:3) ,ENLYFQG(SEQ ID NO: 4)，EPVSTQG (SEQ ID NO: 27)和 PWQAQS (SEQ ID NO: 28)。
18. 权利要求15的方法，其中所述核苷酸序列编码与选自SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8的氨基酸序列至少90%同一的多肽，其中所述多肽是植 物病原体-特异性蛋白酶的底物蛋白质。
19. 重组核酸分子，其包含编码与选自SEQ ID N0:5，SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7和 SEQ ID N0:8的氨基酸序列至少90%同一的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽是植物病原 体-特异性蛋白酶的底物蛋白质。
20.由权利要求19的重组核酸分子编码的经分离的多肽，其包含与选自SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列约90%的同一性，其中所述 多肽是植物病原体-特异性蛋白酶的底物蛋白质。
【专利摘要】本申请涉及赋予对植物病原体的抗病性的组合物，系统和方法，所述植物病原体利用蛋白酶靶向植物细胞内的植物底物蛋白质。简要地，所述组合物，系统和方法基于被病原体-特异性蛋白酶靶定的底物蛋白质，当被所述蛋白酶切割时所述底物蛋白质激活核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复(NB-LRR)抗病性蛋白质。这些底物蛋白质被修饰，以使得内源蛋白酶识别序列被特异于不同的病原体蛋白酶的蛋白酶识别序列(即，异源蛋白酶识别序列)替代。所述经修饰的植物底物蛋白质可与其相应的NB-LRR蛋白质一起，应答异源病原体-特异性蛋白酶的切割，激活抗性。当被植物病原体-特异性蛋白酶激活时，所述蛋白质对启动包括细胞程序性死亡在内的宿主防御性应答。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-57, C12N15-82
【公开号】CN104812901
【申请号】CN201380058718
【发明人】R.英尼斯, S.H.金, D.祁
【申请人】美国印第安纳大学研究和技术公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2013年9月4日
【公告号】EP2895610A1, US20150247163, WO2014042923A1