利用胃息肉和胃癌特异性甲基化检测胃息肉和胃癌标记基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多配体聚糖-2(syndecan，SDC2 ;NM_002998)基因作为胃息肉和胃癌 特异性的甲基化生物标记物的新用途，并且更具体地，涉及多配体聚糖-2基因作为生物标 记物的用途，其使得能够通过测量多配体聚糖-2基因的甲基化水平在早期阶段诊断出胃 息肉和胃癌。
【背景技术】
[0002] 即使医学发展到今天，癌症患者，特别是实体瘤患者（除了血癌患者以外）的5年 存活率仍小于50%，并且所有癌症患者中约2/3在晚期被诊断出来，几乎所有都在癌症诊 断后的2年内死亡。在癌症治疗中这样差的结果不仅是治疗方法的问题，还是由于这样的 事实，即不容易在早期诊断癌症和准确地诊断晚期癌症，并在癌症治疗后对癌症患者进行 随访。
[0003] 在目前的临床实践中，癌症的诊断是由后询问病史、体检及临床评估后进行组织 活检，而如果怀疑是癌症，随后进行射线检测和内窥镜检查来确认的。然而，由现有临床实 践对癌症的诊断只有当癌细胞的数目超过十亿并且癌的直径大于Icm时才可能。在这种情 况下，癌细胞已经具有转移能力，并且其至少一半已经转移。同时，用于监测从癌直接或间 接产生的物质的肿瘤标记物被用于癌症筛查，但是它们由于准确性有限而引起混乱，因为 其中高达约半数即使在癌症存在时也显示为正常，它们即使在没有癌症时也表现为阳性。 此外，主要用于癌症治疗的抗癌剂的问题在于只有当癌体积很小时才显示出效果。
[0004] 之所以难以诊断和治疗癌症是因为癌细胞是高度复杂和可变的。癌细胞过度生长 并且连续地侵入周围组织以及转移到远端器官导致死亡。尽管有免疫机制或抗癌治疗的攻 击，但癌细胞仍旧存活，不断地发展并且选择性繁殖最适宜存活的细胞群。癌细胞是具有高 度生存能力的生物体，通过大量基因的突变而产生。为了使一个细胞转变为癌细胞并发展 成临床上可检测到的恶性癌症肿块，必须发生大量基因的突变。因此，为了从根本上诊断并 治疗癌症，在基因水平的方法是必要的。
[0005] 最近，已积极尝试用遗传分析来诊断癌症。最简单的典型方法是通过PCR检测血 液中ABL :BCR融合基因（白血病的遗传特征）的存在。该方法具有大于95%的准确率，并 且在使用这个简易的基因分析来诊断并治疗慢性髓细胞性白血病后，这一方法被用于结果 评估和后续研宄。但是，这种方法的缺点在于它只能适用于某些血癌。
[0006] 此外，已尝试另一种方法，其中通过RT-PCR和印迹法检测由癌细胞表达的基因 的存在，从而诊断血细胞中癌细胞的存在。但是，这种方法的缺点在于它只能适用于包 括前列腺癌和黑色素瘤在内的某些癌症，并且具有较高的假阳性率。此外，难以对该方 法中的检测和读数标准化，并且它的效用也很有限（Kopreski, M. S. et al.，Clin. Cancer Res.，5:1961，1999 ;Miyashiro, I. et al.，Clin. Chem.，47:505, 2001) 〇
[0007] 最近，已积极尝试使用血清或血浆中的DNA的基因检测。这是一种检测从癌细 胞中分离并释放到血液中并游离DNA的形式存在于血清中的癌症相关基因的方法。据发 现，血清中的DNA浓度在实际癌症患者中比正常人中增加5-10倍，并且这种增加的DNA 大多从癌细胞释放。使用这样的从癌细胞中分离的DNA来分析癌症特异性基因的异常， 例如原癌基因和肿瘤抑制基因的突变、缺失和功能丧失，允许诊断癌症。在这项工作中， 出现了通过检查血清中突变的K-ras癌基因、p53肿瘤抑制基因和pl6基因中的启动子 甲基化，以及微卫星的标记和不稳定性来诊断肺癌、头颈癌、乳腺癌、结肠癌和肝癌的积极 尝试（Chen, X.Q.et al·，Clin. Cancer Res. ,5:2297, 1999 ;Esteller，M.et al·，Cancer Res.，59:67, 1999 ;Sanchez_Cespedes，M. et al.，Cancer Res.，60:892, 2000 ;Sozzi，G. et al. , Clin. Cancer Res. , 5:2689, 1999) 〇
[0008] 同时，在血液以外的样品中，也可以检测癌细胞的DNA。尝试一种通过基因或 抗体测试来检测肺癌患者的痰或支气管肺泡灌洗术中癌细胞或原癌基因的存在的方 法(Palmisano, ff. A. et al. , Cancer Res.,60:5954, 2000 ；Sueoka, E. et al. , Cancer Res.，59:1404, 1999)。此外，尝试了检测结肠和直肠癌患者的粪便中原癌基因的存在 (Ahlquist, D. A. et al.，Gastroenterol.，119:1219-27, 2000)和检测尿液和前列腺液中启 动子甲基化异常（Goessl，C.et al·，Cancer Res. ,60:5941，2000)的其他方法。然而，为了 准确地诊断引起大量基因异常的癌症并显示每种癌症的各种突变特性，需要一种以准确且 自动的方式同时分析大量基因的方法。然而，尚未建立这样的方法。
[0009] 为了准确诊断癌症，重要的是不仅检测突变基因，而且检测此基因发生突变的机 制。在此之前，进行了侧重于编码序列的突变，即，微变化，如点突变、缺失和插入，或宏观染 色体异常的研宄。然而，近几年，表观遗传改变被报道为与这些突变一样重要，并且表观遗 传改变的典型例子是启动子CpG岛的甲基化。
[0010] 在哺乳动物细胞的基因组DNA中，除了 A、C、G和T以外还有第五碱基，即5-甲基 胞嘧啶，其中甲基是结合到胞嘧啶环的第五个碳（5-mC)上。5-mC总是只连接至CG二核苷 酸（5'-mCG-3'）的C，这是经常被标示的CpG。CpG的C通过结合甲基而主要被甲基化。这 一 CpG的甲基化抑制基因组中的重复序列（如Alu或转座子）被表达。另外，该CpG是在 哺乳动物细胞中表观遗传学改变出现次数最多的位点。这一 CpG的5-mC天然脱氨基为T， 并且因此，在哺乳动物基因组中的CpG仅示出了 1%的频率，这远低于正常频率（1/4X1/4 =6. 25% )。
[0011] CpG异常地整合的区域被称为CpG岛。CpG岛是指长度为0. 2-3kb，并且C+G含量超 过50%且CpG比率超过3. 75%的位点。在人类基因组中大约有45, 000个CpG岛，并且发现 它们大多数在调控基因表达的启动子区中。实际上，在持家基因的启动子中发现的CpG岛 约占人类基因的 50% (Cross, S. et al.，Curr. Opin. Gene Develop.，5:309, 1995)。最近，已 经积极地进行了检查血液、痰、唾液、粪便或尿液中的肿瘤相关基因的启动子甲基化，和使 用检测结果诊断并治疗各种癌症的尝试（Esteller，M. et al.，Cancer Res.，59:67, 1999 ; Sanchez-Cespedezj M. et al. , Cancer Res. , 60:892, 2000 ；Ahlquist, D. A. et al., Gastroe nterol.，119:1219, 2000)。因此，本发明人根据相关的研宄已证明，配体蛋白聚糖2基因可 以特异地用于诊断结肠癌（KR 10-1142131B)。然而，该文献没有建议使用配体蛋白聚糖2 基因来诊断包括胃癌的其他癌症。同时，本发明人发现，配体蛋白聚糖2基因并不适合作为 各种实体癌症如肺癌、乳腺癌等的生物标记物，因此它仅作为结肠癌特异性生物标记物，而 不是诊断一般癌症的生物标记物。
[0012] 因此，本发明人已进行了广泛的努力来开发有效的胃癌特异性甲基化标记物，这 使得能够在早期阶段诊断癌症和癌变的风险并预测癌症预后。结果是，本发明人发现，配体 蛋白聚糖2(SDC2 ;NM_002998)基因在胃息肉和胃癌细胞中特异性甲基化，而在肺癌组织、 乳癌组织、肝癌组织、宫颈癌组织和甲状腺癌组织中没有特异性甲基化并且通过使用SDC22 基因作为生物标记物测量其甲基化水平可以在早期阶段诊断胃息肉和胃癌，从而完成了本 发明。
[0013] 在此【背景技术】部分公开的上述信息仅用于增强对本发明背景的理解，因此它可能 包含不形成本领域的普通技术人员已知晓的现有技术的信息。
【发明内容】
[0014] 本发明的主要目的是提供一种胃息肉或胃癌特异性的甲基化生物标记物及其在 为胃癌的早期诊断提供信息中的应用，所述生物标记物在胃息肉或胃癌中被特异性甲基 化，因此可以有效地用于胃息肉或胃癌的诊断。
[0015] 本发明的另一个目的是提供一种检测胃息肉或胃癌特异性甲基化标记基因 SDC2 基因的甲基化的方法，以及使用SDC2基因诊断胃息肉或胃癌的试剂盒和核酸芯片。
[0016] 为了达到上述目的，本发明提供了用于诊断胃息肉或胃癌的试剂盒，其包含：用于 扩增包含多配体聚糖2 (SDC2)基因的CpG岛的片段的PCR引物对；和用于对由所述引物对 扩增的PCR产物进行焦磷酸测序的测序引物。
[0017] 本发明还提供了用于检测胃息肉或胃癌的方法，包括步骤：
[0018] (a)分离来自临床样品的DNA ;和
[0019] (b)在分离的DNA中测量SDC2(多配体聚糖-2)基因的CpG岛的甲基化以检测胃 息肉或胃癌，所述SDC2(多配体聚糖-2)基因是胃息肉或胃癌生物标记物。
[0020] 本发明还提供了用于诊断胃息肉或胃癌的组合物，其含有能够检测多配体聚糖 2 (SDC2)基因的CpG岛的甲基化的物质。
[0021] 本发明提供了用于诊断胃息肉或胃癌的核酸芯片，该核酸芯片上固定有能够在严 谨条件下杂交到包括多配体聚糖2 (SDC2)基因的CpG岛的片段的探针。
[0022] 本发明的其它特征和实施方式将从以下的详细说明和所附权利要求中更加显而 易见。
【附图说明】
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