经修饰的人轮状病毒及其用图
【专利说明】
[0001] 递交数据
[0002] 本申请与于2012年8月27日提交的标题为"Modified human rotaviruses and uses therefor"的澳大利亚临时专利申请No. 2012903702相关，并要求其优先权，其全部内 容均通过引用并入本文。
技术领域
[0003] 本公开内容总体上涉及病毒疫苗领域。具体地，本公开内容提供了一种经修饰的 人轮状病毒毒株和产生高滴度病毒的培养方法、轮状病毒疫苗、疫苗接种方案以及诊断和 预后测定。
【背景技术】
[0004] 本说明书中参考的任何现有技术不是且不应被认为是承认或以任何形式暗示该 现有技术形成了任何国家中公知常识的一部分。
[0005] 作者在本说明书中引用的出版物的目录细节按字母顺序收录在说明书结尾处。
[0006] 在世界范围内，轮状病毒（RV)是婴幼儿中腹泻相关的发病率和死亡率的主 要原因。RV感染每年导致超过500,000人死亡，主要在发展中国家。世界卫生组织 (World Health Organization，WHO)已声明，当务之急是开发安全且有效的疫苗（Bern 和 Glass(1994)Impact of diarrheal diseases worldwide In Kapikian AZ(ed)Viral Infections of the grastrointestinal tract，第 2 版，New York Marcel Dekker, Inc.： 1-26 Jiang 等（2002)Clin Infect Dis 34 ;1351-1361)〇
[0007] 特别地，RV导致急性胃肠炎，这是一种需要婴幼儿住院治疗的疾病。在美国、澳大 利亚和日本的研宄已证明34%至63%因急性腹泻病而住院治疗的儿童与RV感染相关。据 估计，在美国健康保障组织中进行住院治疗的RV胃肠炎的发病率在13至24月龄的儿童中 为十万分之222,而在小于1岁的儿童中为十万分之362。在该儿科群体中，RV感染与因急 性腹泻而导致的全部住院治疗的63%有关。对美国1973至1983年的死亡率数据的综述表 明在小于4岁的儿童中，每年有500例腹泻病导致的死亡，并且在美国，20%至80%因腹泻 而导致的过多冬季死亡与RV感染相关。在第三世界国家中，RV还导致相当大比例与腹泻 病相关的死亡率。因此，在世界发达区域和发展中区域两者中，有效的RV疫苗对儿童的健 康具有重要影响。
[0008] RV是未包膜的二十面体病毒，其衣壳由三个病毒蛋白（VP)同心层形成。最内层 由60个VP2二聚体以及分别为12个拷贝的VPl (RV聚合酶）和VP3(病毒加帽酶（copping enzyme))形成，所述VP2二聚体围绕由11条双链RNA片段构成的病毒基因组。第二层蛋白 质由280个VP6的三聚体形成，其位于VP2的顶部，形成双层颗粒（DLP)。最后，向DLP添加 280个糖蛋白VP7的三聚体和60个VP4蛋白的二聚体刺突用以形成代表成熟感染性RV的 三层颗粒（TLP)。所述VP7构成RV的最外层。
[0009] VP7是一种外衣壳蛋白。VP7是一种糖蛋白并且与VP4和VP6相互作用。另一组 蛋白质为"非结构蛋白"（NSP)。例如，已经提出，NSP5与NSP2 -起在装配病毒粒质和病毒 复制方面具有结构性作用。
[0010] Sato 等（1981)Arch Virol. 69 :155-160 描述了使用 MA104 细胞（来自猕猴的胎 肾细胞）的滚动培养物成功培养了来自粪便样品的人RV。然而，MA104细胞是相对未被表 征的，至少在用于作为产生疫苗之病毒的载体时。需要开发用于在充分表征的细胞系统中 培养RV的方案以用于开发RV疫苗。还需所述病毒具有足够的滴度以在对象中产生保护性 免疫应答。
【发明内容】
[0011] 核苷酸和氨基酸序列通过序列标识号（SEQ ID NO)而被提及。SEQ ID NO在数值 上与序列标识符<400>1(SEQ ID N0:1)、〈400>2(SEQ ID N0:2)等相对应。序列标识符的 总结提供于表1中。序列表提供在权利要求书之后。
[0012] 提供了 Vero细胞中的轮状病毒（RV)培养方法。提及的"Vero细胞"包括Vero细 胞来源的细胞系。将RV称为"Vero适应性（Vero-adapted) "RV或"RV3-Vero"或"RV3BB"。 所述方法涉及对RV接种物进行胰蛋白酶消化以及在Vero细胞中培养经胰蛋白酶消化的 RV。与其他RV生产中使用的方法相比，本胰蛋白酶方法使用高得多浓度的胰蛋白酶来激 活病毒以使RV3能够在Vero细胞中生长。提及的"胰蛋白酶消化"指用来自任何来源的胰 蛋白酶处理RV，所述胰蛋白酶包括猪胰蛋白酶、反刍动物（例如牛）胰蛋白酶和重组胰蛋 白酶的一种或更多种。一旦适应在连续细胞系中生长，则RV物质经历基因组修饰，所述基 因组修饰被方便地鉴定为结构蛋白和非结构蛋白之一或两者（包括VP1、VP3、VP4、NSP4、 呢卩5/6)中推导的氨基酸改变和/或￥?1、￥?3、￥?4、呢?2、呢?4和/或呢?5/6中的核苷酸 改变。本公开内容还构想导致其他RV蛋白中氨基酸改变或导致RV基因组中核苷酸改变的 遗传修饰。已提出，Vero适应性RV可用于开发疫苗。还提出了诊断和预后测定来监测RV 感染、疫苗完整性和/或治疗方案或预防方案的有效性。
[0013] 因此，提供了 Vero细胞适应性（"Vero适应性"）RV (也称为RV-Vero或Vero-RV 或RV3BB或Vero适应性RV3BB)，与MA104适应性RV中的相应蛋白质相比，其在VP1、VP3、 VP4、NSP4 和 / 或 NSP5/6 中和 / 或编码 VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4 和 / 或 NSP5/6 之基因中 包含突变。
[0014] 为了方便起见，参照由 Rippinger 等（2010) Virology 405 (I) :1201-1213 公开的 MA104适应性RV3序列进行了核苷酸和氨基酸比较。
[0015] 还构想了在Vero细胞中培养RV的方法，所述方法包括使用相对于其他RV活化方 案更高浓度的胰蛋白酶使RV的接种物或等分试样被胰蛋白酶消化。然后，在存在Vero细 胞的情况下，在足以导致VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6的氨基酸和/或编码VP1、VP3、 VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6的基因之一或两者至少一个发生例如当与MA104适应性RV 相比改变的遗传修饰的时间和条件下，培养RV。如上所述，胰蛋白酶可来自任何来源，例如 猪胰蛋白酶、反刍动物胰蛋白酶或重组胰蛋白酶。反刍动物胰蛋白酶包括来自牛（bovine)、 绵羊（ovine)、山羊（caprine)、长颈鹿、牦牛、骆蛇（camelus)、大羊蛇（llama)、铃羊或袋鼠 (macropod)的胰蛋白酶。在一个实施方案中，胰蛋白酶为猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、绵羊胰 蛋白酶、山羊胰蛋白酶、骆驼胰蛋白酶或重组胰蛋白酶。
[0016] 在一个实施方案中，氨基酸或核苷酸改变发生在NSP4中选自53、76、85、162和165 的密码子、NSP5/6中选自46和112的密码子、VPl中选自886的密码子、VP3中选自643和 785的密码子以及VP4中选自43、374、385、388、442和756