提高轮状病毒vp的制作方法

专利名称：提高轮状病毒vp的制作方法
技术领域：
本发明涉及提高婴幼儿腹泻轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白在转基因植物中表达含量的方法，并进而通过直接食用或肠道给药的方式利用这些含有人轮状病毒抗原蛋白的转基因植物及其衍生物从而引起哺乳动物对该病毒抗原蛋白的免疫应答反应。
轮状病毒(Human rotavirus，HRV)是世界范围内引起婴幼儿传染性重症腹泻的主要病原，在发展中国家尤为突出，亚非拉地区每年约发生30-50亿人次，导致300多万儿童死亡。在中国轮状病毒腹泻每年也广为流行，占儿童腹泻住院病例的60-64％，每年有约10万左右的死亡病例。虽然任何年龄的人都会受到轮状病毒的感染，但只有6月龄-2岁的婴幼儿出现明显症状，2岁以上的感染者较少发生严重腹泻。病毒主要经粪-口传播，流行季节主要发生在秋冬季。
人轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，完整的病毒颗粒呈球形，为具有三层蛋白壳的20面体结构，直径约为75nm，无外衣壳的粗糙型颗粒为60nm，内核直径为40nm。因为病毒颗粒在电镜下内壳蛋白亚基呈20多根辐条状排列，好象边缘整齐的车轮，故而得名。包裹在蛋白壳内的病毒基因组由11个双链RNA(dsRNA)节段组成，总分子量约为12×106。每个节段为一个基因，编码一个多肽，包括核心和内衣壳蛋白4个，外衣壳蛋白2个及非结构蛋白5个。外衣壳蛋白的VP7和VP4，分别称为主要中和抗原和次要中和抗原，用于轮状病毒分型的抗原位点位于这两个蛋白上[1]。
VP7是一种糖蛋白(Glycoprotein)，约占病毒蛋白量的30％，可由基因节段9、8或7编码，是外衣壳的主要蛋白，分子量38KD，根据VP7抗原性的不同，轮状病毒分成14个血清型，其中10个可感染人(G1-G6、G8-G10和G12)。有流行病学重要意义的是G1、G2、G3和G4四型。
VP4由第4基因编码，是外衣壳的次要蛋白，仅占病毒蛋白量的1.5％，它以棘突形式分布在病毒外壳上，分子量约88KD。VP4对蛋白酶敏感，在胰酶作用下离解为VP5(60KD)和VP8(28KD)。根据VP4基因核苷酸序列的不同，采用RT-PCR区分轮状病毒，目前已确定了20个P基因型，其中9个可感染人。有流行学重要意义的的是P[8]和P[4]。
轮状病毒G型和P型的关系，根据我国和世界各地的分型资料表明，G型和P型最常见的组合为P[8]G1、P[8]G3、P[8]G4和P [4]G2[2]。
病毒血清型调查对研制和应用轮状病毒疫苗是十分重要的。已知人轮状病毒有14个G血清型，其中10个可感染人。在全球范围内，有文献资料表明95％的轮状病毒分离株为G1-G4型，分别占54％、18％、12％和11％。2000年，方肇寅研究员对中国10个地区(北京、长春、秦皇岛、郑州、杭州、福州、广州、兰州、成都和昆明)分离到的1293株份儿童轮状病毒进行了分型研究，结果发现，上述10个地区1998-2000年轮状病毒以G1型为主要流行株，占72.7％，其次为G3(14.2％)、G2(12.1％)和G4(2.5％)，有3.1％的标本为混合感染。结合1982-1997多年的分型结果来看，中国婴幼儿轮状病毒也以G1、G2、G3和G4血清型最为常见，但因年份和地区不同，这四个血清型发生和所占的比例又有所差异。上述研究结果为中国轮状病毒疫苗的开发和应用提供了较清晰和系统的流行病学背景资料[2]。
目前对于轮状病毒引起的婴幼儿腹泻没有特效药，只能采取口服补液法，以减少因腹泻脱水所致的死亡人数，营养状况对人轮状病毒的发病危险影响不大，改善卫生条件对预防轮状病毒并不十分有效，发达国家和发展中国家都有约90％以上的3岁以下婴幼儿均感染过HRV，因此，发展疫苗控制HRV腹泻受到世界各国一致的重视。
轮状病毒的自然感染不能保护人轮状病毒的再感染，但可以防止严重腹泻。因此发展轮状病毒疫苗的目标是预防婴幼儿发生严重腹泻。肠道sIgA抗轮状病毒感染比血清抗体IgG更为重要，小肠上皮表面的sIgA在抗感染的机制上具有重要意义，因此人们一直在努力寻找一种能直接刺激肠粘膜的口服疫苗。然而，尽管人们在探索生产婴幼儿腹泻轮状病毒疫苗方面已做了许多工作，并相继研制出第一代口服弱毒活疫苗和第二代多价重配体疫苗，但在临床使用中均发现存在安全性差、效果不稳定和生产成本较高等诸多问题，因此未能在全球范围内推广使用。
轮状病毒疫苗的研究经过了几个阶段，最早的是口服弱毒活疫苗，实验过几种疫苗能适应组织培养生长的Wa(G1)株，从新生儿分离的低致病性M37(G1)、1076(G2)、MCN13(G3)、ST3(G4)以及冷适应株W179(G1)和SC2(G2)等。这些毒株对婴幼儿具有潜在的致病性，而冷适应株则因传代次数太多造成免疫原性较差。另外也实验了动物来源的轮状病毒制备疫苗，如牛轮状病毒RIT4237(G6)株、UK(G6)株和WC3(G6)株以及猴轮状病毒MMC18006(G3)株。动物来源的轮状病毒疫苗株虽然毒性较低，但这些侯选的疫苗株保护性不稳定，不易激发人的机体产生针对人轮状病毒的中和抗体，其原因可能是不同地区的流行株的血清型不同，动物毒株有时不能激发异型保护。因此，上述疫苗虽然研究较早，但直到现在还未能取得认可[3]。中国兰州生物制品所分离传代培养的羊轮状病毒LLR-85(G10血清型)株，在对6月龄-6岁的儿童一次接种后，血清中和抗体4倍增长阳性率达60％左右。所有观察对象未发现发热、腹泻和呕吐等症状[4]。其免疫效果较好，现在已获得国家一类新药证书和试生产文号。该疫苗的缺点是价格仍比较高，普通家庭仍难以承担。
第二代轮状病毒疫苗是多价重配株疫苗，其中较为成功的是猴轮状病毒(RRV)四价重配株疫苗。在猴轮状病毒与人轮状病毒同时感染细胞时，两套基因节段相互之间会发生重配，筛选单一VP7基因被人轮状病毒替换的猴轮状病毒重配株，其中只有VP7基因来自于人轮状病毒，其它10个基因节段均来自于猴轮状病毒，该毒株对人类是减毒的，同时有克服了人轮状病毒不易培养生长的特点。通过把分别表达人轮状病毒G1、G2和G4血清型VP7的重配株与亲本猴轮状病毒G3血清型的VP7的重配株混合，构成四价重配株疫苗。在美国、芬兰和委内瑞拉的临床研究发现对婴幼儿严重腹泻的保护率为80％，对一般腹泻的保护率为48-68％[3]。该疫苗由美国国立卫生研究院(NIH)研制，1998年8月美国Wyeth-Ayerst公司获得美国食品和药品管理局(FDA)生产许可，经近一年150万儿童服用后发现儿童发生肠套叠的危险增加10-14倍，因此美国疾病预防与控制中心(CDC)建议该疫苗停止生产，研制其它形式的疫苗则受到更大重视。
第三代轮状病毒疫苗是利用基因工程技术表达相应的病毒亚单位成份，作为疫苗免疫机体。如在重组杆状病毒中分别表达VP2、VP6、VP7和VP4等蛋白并装配成无核酸的病毒粒体，或分别表达它们的融合蛋白，免疫实验动物都可以诱发特异性抗体的产生。近几年，DNA疫苗[5]和微囊化疫苗[6]的研究也取得了一定的进展，但在人轮状病毒疫苗方面的研究还有待于进一步工作。
大量的实验研究表明人或其它哺乳动物在受到病原侵染后会产生免疫应答反应以抵御这种病原的入侵。该过程至少涉及以下三种免疫机制之一粘膜、体液或细胞。粘膜免疫应答产生分泌型抗体IgA，可保护呼吸道、消化道、生殖系统和腺体表面不受侵染。粘膜抗体可阻止病原在粘膜表面定居从而构成第一道防御屏障。粘膜抗体的产生可通过分泌性腺体和组织的局部免疫而获得，也可通过刺激肠道和呼吸道淋巴组织产生。体液免疫主要涉及IgG和IgM，它们在血液中参与侵入病原的吞噬，病毒中和或有补体介导的细胞毒性。
研究人员已经注意到口服接种可诱导血液和粘膜抗体的产生，通常的情况是口服接种需要比较多的抗原，这是因为抗原被实际吸附和利用的数量比较低。因此，口服接种所需要的抗原数量远远超过注射接种(7)。然而，也有例外，业已发现，一些蛋白只需口服少量就能产生体液和粘膜免疫应答，这些蛋白常常能够与粘膜细胞膜表面的糖脂或糖蛋白特异性结合，因此，这些蛋白也被称为粘膜性抗原，例如病毒性血凝素。口服和肌肉注射剂量比较实验表明，粘膜类抗原也能够非常有效地引起体液免疫，与肌肉注射相比，二者之间只有轻微的差别。轮状病毒VP7和VP4蛋白可能也属于粘膜抗原。
基因工程研究领域的最新进展使植物表达外源基因成为可能。含有外源基因的植物细胞可再生出完整植株，并将基因遗传给后代。迄今有些单子叶和双子叶植物都已经进行了成功的转化。例如烟草、马铃薯、番茄、大豆和玉米等。
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的双子叶植物转化已有众多报道。农杆菌介导的叶盘转化法可有效地进行基因转移、选择和再生。
单子叶植物经农杆菌介导转化比较困难，但也可以利用其它的转化方法如PEG和电融合法。有人成功地将外源基因导入玉米、水稻和小麦的原生质体中。然后从转化的原生质体再生出完整的植株。一些新的转化方法如微管注射法和基因枪法在单子叶植物转化和再生中可能更加有效。
植物是一种多样化、低成本和可再生的材料资源，而生物技术的迅速发展则使我们进一步拓宽了植物的使用范围，国外在植物中采用这种“分子农业”的方法，已经成功地生产了越来越多的有用物质，其中包括一些高价值药用蛋白多肽，如人的细胞生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克隆抗体和可作为疫苗用的抗原蛋白等，一些研究机构和公司已经开始从这些药物蛋白的生产中获得巨大的经济效益。
特别值得指出的是，1998年4月，美国国家过敏症和传染病研究所(NationalInstitute of Allergy and Infectious Diseases，NIAID)首次报道了人食用转基因马铃薯后体内能够产生针对大肠杆菌热不稳定毒素B亚基的抗体，在11个志愿者中有10人(91％)血清中抗体增加了4倍，有6人(55％)粘膜抗体也增加了4倍。这一研究结果清楚地表明(1)在植物中高效表达一些病原的蛋白基因是可行的。
(2)病原蛋白在植物中可完成翻译后加工过程，如糖基化和高级结构的空间折叠，从而使这种重组蛋白多肽与天然蛋白具有相同的免疫原性，这是原核生物表达系统无法比拟的，后者无法对源自真核生物的蛋白进行糖基化。
(3)植物中产生的一些抗原蛋白可安全地通过动物的消化道而不会被胃蛋白酶降解，原因是它们能够与肠粘膜细胞膜表面上的糖蛋白分子受体结合并刺激动物机体产生免疫应答。这类蛋白也被称谓粘膜性抗原(mucosalimmunogen)，但并不是所有的蛋白都具有这种能力，现仅发现少数病毒和细菌含有这种抗原蛋白。
(4)研究也证实了粘膜性抗原只需要口服少量蛋白，就可以产生良好的免疫应答反应，并不比肌内注射所需要量大。
这些研究结果预示植物将成为继微生物发酵系统和动物细胞培养系统之后又一个新的蛋白表达系统。而利用植物表达系统生产病原细菌或病毒抗原蛋白具有以下优点(1)更安全转基因植物中除只增加了重组抗原蛋白外，没有改变植物其它的遗传组成，因此，它绝不会含有对人体有害的成份，也完全排除了污染其它病毒的可能性。
(2)价格更低廉因为它不需要纯化和冷藏，抗原蛋白的生产可能只是简单地种植农作物，因此可大大降低生产成本。
(3)使用更方便接种方式只是简单地让食用含有该病原抗原蛋白的植物食用部分或由该植物加工而成的某些产品，省去了较麻烦的注射过程，这种接种方式非常适用于中国或其它发展中国家。
(4)免疫力更持久人或其它哺乳动物每隔一定时间食用这种转基因植物或由其加工而成的某些产品，可使体内抗体始终维持在一个较高的水平，增强了对传染性疾病的抵抗能力。
已有人尝试在植物中表达乙型肝炎病毒包膜小蛋白(S)，发现在植物中产生的乙肝表面抗原(HBsAg)抗原与源自人血液或基因工程酵母中的HBsAg具有相似的抗原特性和物理特性，并进而提出了“食物疫苗”的概念，认为人或哺乳动物直接食用含有该蛋白抗原的转基因植物后可产生免疫应答反应。为此，还申请了相关专利(8)。然而，在本发明之前，还没有人提出将腹泻轮状病毒四个常见血清型G1、G2、G3和G4的VP7基因以及P[4]和P[8]基因型的VP4抗原蛋白基因分别或同时导入植物，以生产植物来源的轮状病毒口服疫苗。表达某一血清型抗原蛋白的转基因植物如G2VP7，在单独口服接种时可预防该血清型病毒毒株，而将表达几种血清型抗原蛋白的转基因植物成份混合后，有可能研制开发出腹泻病毒多价口服疫苗，这是其它生产系统目前无法做到的。
利用转基因植物生产口服疫苗可能遇到的最大难题之一是外源重组抗原蛋白在转基因植物中表达含量比较低，婴幼儿或动物食用这种转基因植物后机体不能够产生免疫应答反应或需食用非常多的转基因植物后才能产生免疫效果。在本发明之前，还没有人提出对轮状病毒VP7或VP4基因按照植物所偏爱的密码子进行优化(核苷酸序列发生改变)，而优化后的VP7或VP4抗原蛋白基因所编码的抗原蛋白氨基酸序列没有任何变化，但蛋白表达含量却大大提高，由此可显著改善转基因植物或其衍生物口服接种后的免疫效果。
尽管在本发明之前，已有人利用烟草花叶病毒5′端的部分非编码序列(Ω序列)作为调控序列以增强外源基因在植物中的表达水平。但没有人在目的基因两端同时插入植物病毒(这里是指马铃薯Y病毒)的5′端和3′端非编码区核苷酸序列作为调控序列以增强轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白基因在转基因植物中的表达效率，在与密码子优化措施结合起来，由此可进一步提高VP7或VP4在转基因植物中的表达含量。
在本发明之前，尽管已有人提出“食物疫苗”的概念，但在具体操作中存在很大困难，因为植物中的表达的重组抗原蛋白含量不确定，且植物不同个体或同一植物个体的不同器官之间存在很大差异，婴幼儿或动物直接食用这种转基因植物就会产生一定风险，长时间食用含少量重组抗原蛋白的植物材料会引起免疫耐受性，而短时间食用过多抗原又会引起超敏反应。本发明提出将含有腹泻轮状病毒重组抗原蛋白的转基因植物食用部分或其提取物加工成冲剂、口服液或其它制剂的方法，由此可对其中所含的重组抗原蛋白进行严格定量，从而对人或哺乳动物的食用间隔时间和食用量有了明确的规定，由此克服了直接食用转基因植物存在的上述缺点。
现有的人轮状病毒活疫苗在安全性、保护范围、疫苗价格和接种方便程度等方面还存在诸多问题，因此，开发和研制新的能够安全、廉价和有效预防婴幼儿腹泻轮状病毒多价疫苗就显得十分必要和迫切，利用转基因植物生产轮状病毒口服疫苗是一种较好的选择，它可能为人类和哺乳动物抵御各种传染性疾病提供一条新途径，其关键是要首先提高重组抗原蛋白VP7或VP4在转基因植物中的表达含量。
本发明提供了提高人轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白在转基因植物中表达含量的方法以及如何应用含该类重组抗原蛋白转基因植物的方法。本项发明特别适用于中国或其它发展中国家。
本发明利用可以食用的转基因植物生产人轮状病毒抗原蛋白，这些重组抗原蛋白在免疫原性方面与天然蛋白类似。按照一个优先的实施方案，就是本发明提供了提高人轮状病毒抗原蛋白在转基因植物中表达含量的方法以及如何具体应用这些含重组抗原蛋白转基因植物的方法。这里所指的人轮状病毒抗原蛋白是轮状病毒VP7或VP4结构蛋白，植物指的是人们日常食用的植物。
本发明提供了提高人轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白在转基因植物中表达含量的方法，首先是编码人轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白的基因被分离出来，基因在按照植物所偏爱的密码子进行修饰和改造后，其5’端和3’端分别添加能够增强在植物表达效率的源自植物病毒的调控序列，然后将修饰和改造后的轮状病毒抗原蛋白基因插入到一个含有选择标记的质粒上，启动子位于该基因的上游，它操纵该基因在植物中的表达。外源基因在植物各器官或可食用部分中表达后，婴幼儿可食用这部分植物组织。
本发明所指的人轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白是指在转基因植物中生产的，它克服了以前一些病毒抗原蛋白生产方法如微生物发酵和动物细胞培养的缺点，它利用转基因植物生产人轮状病毒抗原蛋白，如果直接食用或将其加工成冲剂、口服液或其它制剂，则具有廉价、安全和使用方便的特点，会使更多的人得到保护。按照一个优先的实施方案，婴幼儿只需食用这些转基因植物的果实、汁液、根、茎、叶或植物的其它部分，或以肠道给药的方式利用这些转基因植物或转基因植物粗提取物制备的冲剂、口服液或其它制剂便可获得对该传染病的免疫能力。这里的植物是指人们日常所食用的，同时由于避免了提纯过程，降低了生产成本和消除了存在的其它一些不利因素。
按照一个实施方案，本发明涉及利用转基因植物生产含抗原蛋白冲剂、口服液或其它制剂的方法。生产这种冲剂、口服液或其它制剂的转基因植物材料可以有多种方式，可以是完整植物，或植物的一部分如果实、叶子、茎和块茎，或植物某一部分的粗提物、或经完全纯化以及部分纯化源自转基因植物的病毒抗原蛋白。总之，采用何种方式主要取决于产生粘膜免疫应答反应所需这种源自转基因植物的抗原的剂量以及在这种成份中所含的干扰免疫应答反应的物质的多少，如糖类、热原和毒素等，并尽量降低免疫耐受性的产生。
本发明提供了在植物细胞中生产人轮状病毒重组蛋白的方法，而这些蛋白已知在天然状态下可引起人产生免疫应答反应。或者说，本发明所指的轮状病毒VP7或VP4重组蛋白可作为抗原，具有与源自人或其它常规表达系统产生的该抗原蛋白如酵母或细菌一样的免疫原性。或者更确切说，本发明的抗原蛋白与源自人和其它常规表达系统产生的该抗原蛋白一样，均能够通过口服和肠道给药的方式引起免疫应答反应。按照一个优先的实施方案，这种人轮状病毒重组蛋白是一种抗原蛋白，它可以在植物细胞中表达产生，且具有与源自人或其它常规表达系统所产生的该抗原蛋白相似的免疫原性。
本发明的抗原源自人轮状病毒，它可在植物中表达产生。按照一个优先的实施方案，抗原源自人轮状病毒的结构蛋白VP7或VP4。
本发明的人轮状病毒VP7或VP4抗原可在植物中表达产生，而表达产生该抗原的植物至少有一部分是可以直接食用或经过粗加工后可以食用。这种植物或植物的食用部分不应具有毒性，因此，许多常见的食用植物都包括在本发明所定义的植物范围之内。此外，在某些情况下，如马铃薯，在这里也被认为是可食用植物，尽管它的某些部分被认为是有毒的(马铃薯块茎部分是无毒的，因此属于本发明的权利要求范围之内，但它的果实是有毒的)，在这种情况下，这种植物也应包括在本发明的权利要求范围之内。
本发明的重组抗原蛋白可以是人轮状病毒天然抗原蛋白VP7或VP4的全部。按照一个优先的实施方案，不同血清型的VP7抗原蛋白(例如G1、G2、G3和G4)或基因型的VP4抗原蛋白(例如P[4]和P[8])可以先分别在植物中表达，然后再根据需求部分或全部混合起来以满足不同的治疗目的。按照另外一个较优先的实施方案，这些抗原也可以2种或两种以上在同一个植物中同时表达，这样就省去了以后的混合过程。在某些具体实施方案中，抗原也可能只是该天然蛋白分子的一部分。有时，抗原可与另外一个多肽或蛋白分子如细菌病原蛋白多肽结合在一起形成融合蛋白。蛋白的融合可以通过蛋白翻译后加工、共价结合的方式，或者通过DNA重组技术使基因在翻译前就连接在一起。这两种技术是本领域专家早已熟知的技术。
在本发明的其它实施方案中，一种或几种表达人轮状病毒重组抗原蛋白的转基因植物被构建。就本发明而言，一种转基因植物至少应该在该植物的部分细胞中表达了某种病毒抗原。按照本发明的某些优先实施方案，本发明的转基因植物至少有一部分是可以食用的，其所表达的抗原是轮状病毒某一血清型VP7或基因型的VP4，或多种血清型的VP7和基因型的VP4，它或它们能够引起免疫应答反应，特别是粘膜免疫应答反应，就如同天然蛋白或其它表达系统产生的抗原蛋白一样。
本发明涉及到了一种食物的组成问题，该食物中至少含有转基因植物的某些食用部分，这里的转基因植物应能够表达人轮状病毒抗原蛋白。就本发明而言，植物或植物的某一部分被认为应该具有某些营养价值，它能够为人或其它哺乳动物提供代谢所需的能量，维生素和其他辅助因子。尽管水果并不大量提供能量、蛋白质、碳水化合物和脂肪，但就因为它含有人轮状病毒重组抗原蛋白而被人们特意食用的话，水果也应包括在本发明的权利要求范围内。
本发明涉及到了一种冲剂、口服液或其它制剂的组成成份问题，冲剂、口服液或其它制剂中至少含有转基因植物的某些食用部分，这里的转基因植物应能够表达一种人轮状病毒重组抗原蛋白。就本发明而言，冲剂、口服液或其它制剂中含有的抗原蛋白应该能够精确定量，以避免婴幼儿食用后产生免疫耐受性。按照本发明的一个优先实施方案，本发明的冲剂、口服液或其它制剂所含有的抗原是人轮状病毒一种抗原蛋白或几种抗原蛋白的混合物，它能够引起免疫应答反应，特别是粘膜免疫应答反应，就如同天然蛋白或其它表达系统产生的抗原蛋白一样。
正如上面所述，按照本发明的某些实施方案，这里的食物将包括含有粘膜性抗原蛋白的食物，这种粘膜性抗原蛋白能够与粘膜细胞表面糖基化分子受体结合，它是一种源自人轮状病毒的抗原蛋白。因此，按照一个更加具体的实施方案，本发明所指的食物将至少包括转基因植物的一部分，它具有某些营养价值，并含有人轮状病毒某一血清型或基因型的抗原蛋白，而该抗原蛋白能够与粘膜细胞表面的糖基化分子受体结合。在任何情况下，本发明的食物都包括植物的根、茎、叶、果实或所说的植物种子。
对本发明所使用的方法和其它相关事项极为重要的是一些质粒载体的构建，它们在获得本发明所指的转基因植物以及转基因植物的加工应用中起重要作用。用于转化植物的质粒载体由编码人轮状病毒某一血清型或基因型的DNA序列、操纵该DNA序列在所说的植物中表达的一个植物启动子以及能增强表达调控序列组成。在某些具体实施方案中，质粒载体还包括一个选择或标记基因，主要用于转基因植物或细胞的检测。在某些具体实施方案中，本发明的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。正如上面所述，按照某些具体的实施方案，本发明的质粒载体用于转化可食用植物，它编码的抗原是一种粘膜抗原，更进一步说，质粒载体所编码的抗原能够诱导免疫应答反应，特别是粘膜性免疫应答反应，就象天然蛋白和源自其它表达系统所产生的该抗原蛋白一样。在一个优先的实施方案中，本发明用于转化植物的质粒载体含有编码人轮状病毒某一血清型VP7或基因型VP4抗原蛋白的基因、源自植物病毒的增强表达调控序列以及一个植物启动子，该基因编码的蛋白抗原可引起免疫应答反应、特别是粘膜免疫应答反应就如同天然蛋白或源自其它表达系统的该抗原蛋白一样，源自植物病毒核苷酸序列主要作用是增强该基因表达，而植物启动子主要是操纵该基因在植物中的表达。在一个类似的实施方案中，本发明提供的DNA片段可用于基因枪法转化植物。
本发明也提供了获得转基因植物细胞的方法，它包括以下步骤1.构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码人轮状病毒某一血清型VP7或基因型VP4抗原蛋白的基因，在该基因两端添加增强表达调控序列，然后将上述DNA序列被置于一个植物启动子的操纵之下；2.用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞。按照一个优先的实施方案，还包括从转化的植物细胞再生出完整的转基因植株的方法。
本发明提供了各种植物细胞或植物的转化方法。尽管在下面描述的某些优先实施方案中仅利用了特定的转化方法，但显而易见的是，本领域专家所早已熟知的其它植物转化方法也应包括在本发明的权利要求范围之内，这些方法包括微管注射、PEG融合、电融合。按照某些优先实施方案，使用的是农杆菌介导的转化方法，特别指Ti质粒参与的农杆菌转化系统。在其它一些优先实施方案中，还可以使用基因枪法转化植物细胞或植物。
本发明在详细介绍转化方法时仅提到了马铃薯和番茄，然而，正如本领域专家所早已熟知的植物转化方法那样，许多种植物都可以利用本发明提供的方法进行转化。因此，所有这些植物都应包括在本发明的权利要求范围之内，这些植物可以是了单子叶植物或双子叶植物。
就象下面实例中所要详细描述的那样，本发明植物转化方法中所用的质粒载体是一个双元载体系统。按照一个实施方案，本发明使用的质粒是一个整合性载体。按照一个更加优先的实施方案，本发明所使用的质粒是pBI121。
本发明提供了含人轮状病毒一种血清型VP7或基因型VP4抗原蛋白转基因食物的生产方法。它包括以下步骤1.构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有一个编码人轮状病毒一种血清型VP7或基因型VP4抗原蛋白的基因，而且该基因两端在插入了增强表达调控序列后，然后被置于一个植物启动子操纵之下；2.用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞；3.从转基因植物细胞中再生出完整的转基因植物；4.收获转基因植物的食用部分；5.食用一定量的这种转基因植物，尽量避免产生免疫耐受性，以达到预防人轮状病毒该血清型或基因型所引起腹泻的效果。
本发明提供了含人轮状病毒多种血清型或基因型抗原蛋白转基因食物的生产方法。它包括以下步骤1.构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码人轮状病毒2个或2个以上的血清型或基因型抗原蛋白的基因，基因的两端都插入有植物病毒增强表达调控序列，而且这些基因被分别置于不同的植物启动子或同一个植物启动子操纵之下；2.用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞；3.从转基因植物细胞中再生出完整的转基因植物；4.收获转基因植物的食用部分；5.将含有人轮状病毒不同血清型或基因型抗原蛋白植物食用部分等量或不等量混合起来；6.食用一定量的这种转基因植物混合物，以达到预防人轮状病毒多种血清型所引起腹泻的效果。
本发明也提供了人轮状病毒一种血清型VP7或基因型VP4抗原蛋白含量确定的冲剂、口服液或其它制剂的生产方法，它包括以下步骤1.构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有一个编码人轮状病毒一种血清型或基因型抗原蛋白的基因，基因的两端在插入增强表达的调控序列之后，被置于一个植物启动子操纵之下；2.用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞；3.从转基因植物细胞中再生出完整的转基因植物；4.自转基因植物细胞或完整植物中提取出抗原蛋白加工成冲剂、口服液或其它制剂。按照一个优先的实施方案，含有抗原蛋白的完整转基因植物或者其某些食用部分可直接进行冷冻、干燥和粉碎，然后加工成冲剂、口服液或其它制剂，并确定其中抗原蛋白的含量；5.食用一定量的这种冲剂、口服液或其它制剂，尽量避免产生免疫耐受性，以达到预防人轮状病毒该血清型所引起腹泻的效果。
本发明也提供了人轮状病毒多种血清型或基因型抗原蛋白含量确定的冲剂、口服液或其它制剂的生产方法，它包括以下步骤1.构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有一个编码人轮状病毒一种血清型或基因型抗原蛋白的基因，基因的两端在插入增强表达的调控序列之后，被置于一个植物启动子操纵之下；2.用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞；3.从转基因植物细胞中再生出完整的转基因植物；4.自转基因植物细胞或完整植物中提取出抗原蛋白；5.将含有人轮状病毒不同血清型或基因型抗原蛋白提取物等量或不等量混合起来，然后再加工成冲剂、口服液或其它制剂。按照一个优先的实施方案，含有抗原蛋白的完整转基因植物或者其某些食用部分可直接进行冷冻、干燥和粉碎，然后加工成冲剂、口服液或其它制剂，并确定其中抗原蛋白的含量数量；6.食用一定量的这种冲剂、口服液或其它制剂，尽量避免产生免疫耐受性，以达到预防人轮状病毒多种血清型所引起腹泻的效果。
为了详细描述本发明的某些优先实施方案，并以相应的绘图作参考

图1轮状病毒VP7和VP4基因的克隆。
图2A轮状病毒G2VP7基因改造和修饰前后的核苷酸序列序列比较。N代表通过RT-PCR扩增获得的天然的轮状病毒血清型G2VP7基因；M代表完全人工合成的轮状病毒MG2VP7基因编码部分及植物病毒调控序列，序列全长1209bp，其中编码区共978个核苷酸，编码326个氨基酸，修饰后共改变了221个核苷酸，见序列中标出部分，横线表示未改变序列，框架内序列为人工合成的马铃薯Y病毒5’端和3’端非编码区(增强表达调控序列)；下划线序列代表BamHI或SacI切点；天然的G2VP7基因G+C％含量为31.3％(306/978)，修饰后MG2VP7基因G+C％含量为53.9％(527/978)；密码子优化前后的氨基酸序列没有发生改变。
图2B轮状病毒G1VP4基因改造和修饰前后的核苷酸序列序列比较。N代表通过RT-PCR扩增获得的天然的轮状病毒血清型G1VP4基因；M代表完全人工合成的轮状病毒MG1VP4基因编码部分及植物病毒调控序列，序列全长为2559bp，其中编码区共2325个核苷酸，编码776个氨基酸，修饰后共改变了510个核苷酸，见序列中标出部分，横线表示未改变序列，框架内序列为人工合成的马铃薯Y病毒5’端和3’端非编码区(增强表达调控序列)；下划线序列代表BamHI或SacI切点；天然的G1VP4基因G+C％含量为32％(306/978)，修饰后MG1VP4基因G+C％含量为53.9％(527/978)；密码子优化前后的氨基酸序列没有发生改变。
图3经修饰和改造后的轮状病毒VP7和VP4基因的克隆。L代表马铃薯Y病毒5’端部分非编码区序列；Tail代表马铃薯Y病毒3’端部分非编码区序列；MG2VP7代表密码子优化后的G2VP7基因；MG1P[8]VP4代表密码子优化后的G1P[8]VP4基因。
图4 pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7和pBMG1VP4植物表达载体构建示意图。GUS代表β-Glucuronidase(葡萄糖醛酸酶)基因图5 pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7和pBMG1VP4植物表达载结构示意图。N-Pro代表胭脂碱合成酶启动子；nptII代表新霉素磷酸转移酶基因；N-Ter代表胭脂碱合成酶终止子；35S-Pro代表花椰菜花叶病毒35S启动子；L代表马铃薯Y病毒5’端非编码区部分序列；T代表马铃薯Y病毒3’端非编码区部分序列。G2VP7和G1VP4代表未修饰和改造的G2VP7和G1VP4基因；MG2VP7和MG1VP4代表经密码子优化后的G2VP7和G1VP4基因。
图6马铃薯植株叶片中G2VP7、G1VP4、MG2VP7和MG1VP4mRNA的含量的比较。图6A1和6B1是阴性对照马铃薯RNA；图6A2是pBG2VP7转化后获得的转基因马铃薯RNA；图6A3是pBMG2VP7转化后获得的转基因马铃薯RNA；图6B2是pBG2VP7转化后获得的转基因马铃薯RNA；图6B3是pBMG2VP7转化后获得的转基因马铃薯RNA；图7不同转基因马铃薯植株叶片中G2VP7和G1VP4重组抗原蛋白含量。1和2为阴性对照植物；3为pBMG2VP7转化后获得的马铃薯转基因植株；4为pBG2VP2转化后获得的马铃薯转基因植株；5为pBMG1VP4转化后获得的马铃薯转基因植株；6为pBG1VP4转化后获得的马铃薯转基因植株。
图8 PCR检测G2VP7、G1VP4、MG2VP7和MG1VP4基因在不同番茄中的整合情况。图8AM为标准DNA分子量；图8A1为pBG2VP2转化后获得的转基因番茄的扩增产物；图8A2为pBMG2VP2转化后获得的转基因番茄的扩增产物；图8A3为阴性对照植物的扩增产物；图8A4为以pG2VP2质粒作模板的扩增产物(阳性对照)。图8BM为标准DNA分子量；图8B1为pBG1VP4转化后获得的转基因番茄的扩增产物；图8B2为pBMG1VP4转化后获得的转基因番茄的扩增产物；图8B3为阴性对照植物的扩增产物；图8B4为以pG1VP4质粒作模板的扩增产物(阳性对照)。
图9番茄植株叶片中G2VP7、G1VP4、MG2VP7和MG1VP4mRNA的含量的比较。图9A1和9B1是阴性对照番茄RNA；图9A2是pBG2VP7转化后获得的转基因番茄RNA；图9A3是pBMG2VP7转化后获得的转基因番茄RNA；图9B2是pBG2VP7转化后获得的转基因番茄RNA；图9B3是pBMG2VP7转化后获得的转基因番茄RNA。
图10不同转基因番茄植株叶片中G2VP7和G1VP4重组抗原蛋白含量。1和2为阴性对照植物；3为pBMG2VP7转化后获得的番茄转基因植株；4为pBG2VP2转化后获得的番茄转基因植株；5为pBMG1VP4转化后获得的番茄转基因植株；6为pBG1VP4转化后获得的番茄转基因植株。
图11轮状病毒G2VP7重组抗原蛋白在植物汁液中的稳定性测定。含G2VP7重组抗原蛋白的马铃薯块茎(0.1g)在400ul磷酸缓冲液中磨碎后，室温下(15-20℃)放置1-7天后，取100ul上清液酶联免疫反应后测定OD450nm光吸收值。
图12轮状病毒G2VP7重组抗原蛋白在植物汁液中对高温忍耐程度。含G2VP7重组抗原蛋白的马铃薯块茎(0.1g)在400ul磷酸缓冲液中磨碎后，在不同温度下放置3小时后，取100ul上清液酶联免疫反应后测定OD450nm光吸收值。
图13经亲和层析纯化出的G2VP7和G1VP4重组抗原蛋白的PAGE分析。1为蛋白标准分子量；2为经亲和层析从转基因番茄(pBM G1VP4转化)叶片中纯化出的G1VP4重组抗原蛋白；3为转基因番茄(pBM G1VP4转化)叶片总蛋白；4为阴性对照番茄叶片总蛋白；5为为经亲和层析从转基因马铃薯(pBM G2VP7转化)块茎中纯化出的G2VP7重组抗原蛋白；6为转基因马铃薯(pBM G2VP7转化)块茎总蛋白；7为阴性对照马铃薯块茎总蛋白；8为轮状病毒粒体所含蛋白(阳性对照)。
本发明包括以下几个组成部分1.利用DNA重组技术构建高效质粒表达载体，它含有轮状病毒抗原蛋白基因VP7或VP4或其衍生物以及增强基因表达的植物病毒调控序列，婴幼儿在食用这些基因编码的抗原蛋白后有可能产生针对人腹泻轮状病毒的特异性中和抗体；2.选择适宜的受体植物进行转化，使编码抗原蛋白的基因稳定地整合入受体植物的染色体中并可遗传给后代；3.从转化的受体植物细胞中再生出完整的转基因植物，而且该植物能够稳定、高效地产生轮状病毒抗原蛋白；4.婴幼儿直接食用这种转基因植物或以肠道给药的方式口服以这些转基因植物为主要活性成份加工而成的冲剂、口服液或其它制剂后，有可能预防一种血清型或多种血清型人腹泻轮状病毒的侵染。
本发明提供了高效表达轮状病毒抗原蛋白VP7或VP4其衍生物转基因植物的构建方法，这种转基因植物作为食物或者在加工成冲剂、口服液或其它制剂后被婴幼儿食用有可能引起婴幼儿的免疫应答。这种免疫应答的结果使婴幼儿对人腹泻轮状病毒的感染具有抵抗能力。这种免疫应答是由于在转基因植物中高效表达轮状病毒抗原蛋白后而产生的结果，而轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白的产生则是由于这些抗原蛋白基因整合入植物的基因组中并在启动子和植物病毒增强表达序列共同调控下能够稳定、高效地表达的结果。
1.利用转基因植物生产轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白实际上，早在现代医学产生之前，人们便已经自觉或不自觉地利用植物或植物中的某些天然成份来医治人类疾病。
近十几年来，随着生物技术、特别植物基因工程领域的研究进展使人类获得了操纵外源基因在植物中表达的能力。1992年，美国人C.J.Arntzen和H.S.Mason率先提出了用转基因植物生产疫苗的新思路[9]，这一思路促成了利用转基因植物生产疫苗研究的兴起。此后，国内外多个实验室相继在烟草、马铃薯、番茄、苜蓿和莴苣中表达了乙肝表面抗原[9，10]、大肠杆菌热敏毒素B亚基[11，12]、霍乱毒素B亚基[13，14，15]、诺瓦克病毒外壳蛋白[16]和狂犬病毒G蛋白等抗原[17]，并利用在植物中表达的抗原进行了动物和人的免疫实验，获得了大量有价值的研究数据，为今后利用转基因植物生产疫苗奠定了良好基础(见表1)。
表1利用转基因植物生产的人和动物疫苗用抗原蛋白[18]
本发明提供了显著提高婴幼儿腹泻轮状病毒VP7和VP4抗原蛋白在转基因植物中表达含量的方法，除此之外，编码轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白的基因在经过缺失或变异之后也可以应用在本发明中。例如，表达载体含有经过修饰的轮状病毒抗原蛋白基因，结果造成抗原蛋白一个或多个氨基酸残基改变，从而也改变了该抗原蛋白的免疫能力。表达载体也可以同时含有前后衔接2个或2个以上不同血清型或基因型的轮状病毒抗原蛋白编码序列，这些基因表达形成一个大的融合蛋白，不仅改变了抗原蛋白的免疫原性，也省去了以后的混合加工过程。表达载体也可以只含有轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白的部分编码序列，结果只产生一小段多肽或作为融合蛋白的一小部分，在这种情况下，它们也属于本专利的权利要求范围之内。
本发明不仅允许在一种植物中生产一种轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白，而且可以在一种植物中同时生产多种轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白。将多种抗原蛋白的基因构建在同一个表达载体上，然后利用其转化植物，从而在一个转基因植物中可同时表达多种轮状病毒抗原蛋白。此外，转基因植物也可以通过多次转化或者同时用多个含有不同抗原蛋白基因的表达载体同时转化的方法获得。轮状病毒至少有4个不同的血清型和2个不同的基因型，每一个血清型或基因型的抗原蛋白是不同的。按照一个优先的实施方案，在一种植物中表达一种血清型或基因型的抗原蛋白，然后将含有不同血清型或基因型抗原蛋白的转基因植物等量或不等量混合起来，再加工成冲剂、口服液及其它制剂后，食用后可以同时抵御不同病毒亚型的感染。按照一个并不优先的实施方案，是在一种转基因植物中同时表达这几种不同血清型或基因型的抗原蛋白，食用这种转基因植物或以该转基因植物为主要成份加工而成的冲剂、口服液及其它制剂后，也可以同时抵御不同病毒血清型或基因型的感染。
2.提高外源基因在植物表达含量的方法显著提高外源基因在植物在转基因植物表达含量的方法包括选择植物强表达启动子、使用增强表达调控序列以及按照植物所偏爱的密码子进行目的基因的修饰和改造。
本发明首先按照植物所偏爱的密码子，对外源蛋白基因进行了优化，在不改变外源蛋白氨基酸序列的前体下，提高基因中G+C％的含量，使其更接近植物自身基因G+C％的比例，在转录形成mRNA时会比较稳定。
植物病毒正义RNA的5′端非编码区和3′端非编码区对其在植物细胞内超强转录、复制、稳定性和翻译起着非常重要的作用。因此，在除对目的基因进行密码子优化，本发明还提出在目的基因两端添加植物病毒5′端和3′端的非编码序列作为增强目的基因在植物表达效率的调控序列，可更进一步提高外源基因在植物中的表达含量。按照本发明一个优先实施的方案，马铃薯Y病毒5′端和3′端部分非编码区被选用作为增强表达的调控序列。
3.受体植物的选择利用不同的外源DNA转移技术，现已转化了多种植物，包括许多双子叶植物和一些单子叶植物。考虑到遗传转化操作的难易程度，本发明更倾向于使用双子叶植物作为受体植物，尽管某些单子叶植物如小麦、玉米和水稻可能更适于作为人们的食物或加工成冲剂、口服液或其它制剂。
选择受体植物进行遗传转化要考虑到抗原蛋白是否能够在它的食用部分中表达。因为，抗原蛋白在植物的某一部分如果实、叶子、茎、种子、或根中表达后，人可直接食用该部分的植物组织或者在加工以后做成冲剂、口服液或其它制剂供人们口服。按照一个并不优先的实施方案，抗原蛋白也可在不能食用的植物中表达，然后从中完全纯化出所需的抗原蛋白加工成冲剂、口服液和其它制剂。
在选择受体植物时，还要考虑其它一些因素。受体植物的食用部分最好不需加热就可以食用，因为加热会引起抗原蛋白变性，从而降低它的免疫原性。此外，因为轮状病毒抗原蛋白VP7和VP4在人刚出生时最容易诱导免疫应答反应的产生，因此，含有这些抗原蛋白的植物部分最好能加工成液体的方式被饮用。
适于本发明转化的受体植物包括所有可作为人或动物食物的双子叶植物和单子叶植物，植物的一部分或全部可食用，这些植物包括马铃薯、番茄、胡萝卜、莴苣、黄瓜、小麦、大豆、水稻、玉米、香蕉和番木瓜等，但不仅限于此。
4.植物转化方法有许多种方法可以将外源基因导入单子叶植物和双子叶植物。将外源基因稳定整合入植物染色体基因组DNA的主要方法包括1)农杆菌介导法；2)DNA直接摄入法，包括PEG介导的原生质融合法、电激法、微管注射法、花粉管通道法以及使用基因枪将DNA直接送入植物细胞和组织等。
农杆菌介导法是利用质粒载体将特定的DNA片段整合入植物染色体基因组DNA。植物组织的转化方法因植物和农杆菌系统而异。最常用的方法是叶盘法，它适用于任何易于再生成完整植株的植物外植体。农杆菌转化方法特别适用于双子叶植物的转化。
正如上面已提到的各种DNA直接摄入转化方法，电激法是先将原生质体置于放在一个强电场中，在电流作用下将外源DNA送入原生质体内。微管注射法是用微管将DNA直接注射入细胞中。基因枪法是将DNA先吸附在硫酸镁或钨粒上，这些颗粒被加速射入植物细胞或组织中。
按照本发明的一个优先实施方案，农杆菌Ti质粒系统被选用。农杆菌的Ti质粒中含有一段叫做转移DNA(T-DNA)的，它可以进入植物细胞中并整合入植物的染色体中。转移载体的构建分为两步，首先是构建一个可以在大肠杆菌中复制的质粒，这个质粒含有轮状病毒VP4或VP7抗原蛋白基因(VP7在这里是指G1、G2、G3或G4血清型的VP7蛋白，VP4是P[4]或P[8]基因型的VP4蛋白)；抗原基因的两端含有T-DNA边界序列，它负责目的基因在植物基因组中的插入位点。通常另外一个选择标志基因(如卡那霉素抗性基因)也被包含在T-DNA的左右边界序列中，该基因在植物细胞中表达后可提供一个选择标记证实植物或植物细胞是否含有整合的T-DNA序列。载体构建的第二步是将质粒从大肠杆菌转移到农杆菌中。这可以通过三亲交配的方式或DNA直接导入方式完成。为了T-DNA的转移，所用的农杆菌菌株中还要含有一套诱导基因，它们在T-DNA转移到植物细胞中起重要作用。
熟悉植物遗传转化的人应该知道转化用的农杆菌菌株可以有多种选择，质粒构建也有多种方式，其目的都是为了更有利于植物的遗传转化。同样，人们也应该知道除了根癌农杆菌外，在有些情况下，还有其它农杆菌如发根型农杆菌更适于一些植物的转化。
植物组织的转化方法因植物和农杆菌介导系统而异。最常用的是植物叶盘转化法，它适于多种易于再生的植物外植体。在某些情况下，还需要加入一些辅助细胞。其他的转化方法包括原生质体转化，继而由原生质体再生出植物细胞及完整植株。
本发明不仅仅限于使用农杆菌Ti质粒转化系统，还应包括其它物理性的手段将外源基因直接导入植物细胞或原生质体的方法以及其它将外源基因导入植物细胞的方法。
5.基因表达启动子在受体植物和转化方法确定之后，需选择一个组成型的、发育调节型的或组织特异型的表达启动予以便外源基因能够在植物中表达。
所有已知能操纵外源基因在植物细胞中转录的启动子都可以在应用在本发明中。这些启动子可从植物或病毒中获得，如花椰菜花叶病毒35S启动子(包括经过拼接、加倍和突变改造后的35S启动子)；光诱导基因启动子如核糖二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)；逆境诱导基因如乙醇脱氢酶(Adh1)或玉米肌动蛋白基因启动子等，但不仅限于此。本发明也可利用已知在植物可食部分高效表达的启动子如马铃薯质体基因启动子。
用于植物转化的质粒通常含有一个选择标志基因。许多有此功能的基因已被开发出来。
下面以转基因马铃薯和番茄生产轮状病毒抗原蛋白VP7或VP4为例，描述一些优先的实施方案，但本发明的应用不仅限于此。
选择马铃薯和番茄作为受体植物是为了举例说明在植物的不同部分可表达轮状病毒抗原蛋白VP7或VP4。
实施例11.轮状病毒VP7和VP4抗原蛋白基因高效植物表达载体的构建如图1所示，轮状病毒血清型G1和G2(或者是G3和G4血清型)核酸被从婴幼儿轮状病毒腹泻患者的粪便或人工培养物(中国疾病预防控制中心病毒病所提供)中分离出来作为模版，根据已知的人轮状病毒各血清型DNA核酸序列(19)合成两对特定的引物。扩增G2VP7基因，使用的5’端引物序列为5’-AGGATCCATGTACGGTTATGAATATACCACAATTCTAAC-3’，3’端引物序列为5’-AGAGCTCCTAAATTCTATAAAACGCAGCTGTGTC-3’。扩增G1P[8]VP4基因，使用的5’端引物为5’-AGGATCCATGGCTTCACTCATTTATAGACAGCTTCTCAC-3’，3’端引物为5’-AGAGCTCTCACAATTTACATTGTAGAATTAACTGCTCAATTC-3’。通过反式多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增分别获得了轮状病毒血清型G2的VP7基因以及基因型G1P[8]的VP4基因(注若以轮状病毒血清型G2的核酸为模板，利用上述两对特定引物，通过RT-PCR可分别获得G2血清型的VP7基因以及基因型P[4]的VP4基因；G3可获得G3血清型VP7基因以及基因型P[8]的VP4基因；G4可获得G4血清型的VP7基因和基因型P[8]的VP4基因)。将扩增片段直接插入到pGEM-T(Promega公司)质粒中，得到PG2VP7和PG1VP4两个质粒载体，然后，通过核苷酸序列分析，确定轮状病毒G2VP7和G1VP4抗原蛋白基因是否正确和完整(图2A，2B)。
为了提高轮状病毒G2VP7和G1VP4基因在转基因植物中的表达含量，采取了以下三种措施1)轮状病毒G2VP7和G1VP4基因被分别按照植物所偏爱的密码子进行修饰和改造，改造后的MG2VP7基因序列G+C％含量由31.3％提高到53.9％，MG1VP4由32％提高到53.9％，改变后的基因序列及密码子见图2A和2B；2)在轮状病毒MG2VP7和MG1VP4基因起始密码子ATG前分别增加了源自马铃薯Y病毒(PVY)5’端非编码区的一段核苷酸序列(见图2A和2B)作为增强表达调控序列；3)在轮状病毒MG2VP7和MG1VP4基因终止密码子TAG或TGA后增加了源自马铃薯Y病毒3’端非编码区的一段核苷酸序列(见图2A和2B)作为增强表达调控序列。轮状病毒MG2VP7和MG1VP4基因密码子的优化以及与5’端和3’端与PVY核苷酸序列的融合工作是由Takara Biotech公司完成的。改造后的MG2VP7和MG1VP4基因被分别插入到pGEM-T(Promega公司)质粒中，得到pMG2VP7和pMG1VP4两个质粒载体(见图3)。
因为在引物5’端中引入了Bam HI位点，在引物3’端中引入了SacI位点，所以用Bam HI和Sac I双酶切可将轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白基因分别自PG2VP7和pG1VP4两个质粒载体上切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离获得小DNA片段，随后插入到质粒pBI121原GUS基因位点上(Bam HI和Sac I双酶切)便分别构建成两个双元表达载体pBG2VP7和pBG1VP4(图4)，它们在植物中的表达含量实际上将作为参照物以确定目的基因VP7或VP4经修饰和改造后在转基因植物中表达含量有无显著提高。。
在人工改造轮状病毒MG2VP7和MG1VP4基因及添加增强表达调控序列(源自植物病毒)的同时，在该核苷酸序列的5’端和3’端也分别添加了BamHI和SacI位点(见图3)，所以用Bam HI和Sac I双酶切可将改造后的轮状病毒MG2VP7或MG1VP4抗原蛋白基因分别自pMG2VP7和pMG1VP4上述两个质粒载体上切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离获得小DNA片段，随后插入到质粒pBI121原GUS基因位点上(Bam HI和Sac I双酶切)便分别构建成两个双元表达载体pBMG2VP7和pBMG1VP4(图4)。
质粒pBI121购自美国Clonetech公司，它的Bam HI和Sac I限制性酶切位点分别位于花椰菜花叶病毒35S启动子和GUS基因起始密码之间以及GUS基因终止密码子和NOS终止子之间。选用质粒pBI121是因为用Bam HI和Sac I双酶切可将GUS基因删除，而随后可插入另外一个蛋白基因。新基因将能够在植物细胞内表达。质粒pBI121还含有新霉素磷酸转移酶II基因(NPT II)，它编码的酶可为植物细胞提供卡那霉素抗性，从而可将含有T-DNA的细胞和组织筛选出来。NPT II基因有自己的启动子和多聚腺酸信号序列，它们源自胭脂碱(Nopaline)合成酶(NOS)基因。
质粒pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7和pBMG1VP4分别含有1)新霉素合成酶基因II(NPT II)，它提供给植物细胞卡那霉素抗性；2)轮状病毒抗原蛋白基因及操纵该基因的花椰菜花叶病毒35S启动子；3)T-DNA左右边界序列，它可将NPTII基因和轮状病毒抗原蛋白基因基因转移到植物体内并整合到植物染色体中；4)在pBMG2VP7和pBMG1VP4中，在MG2VP7或MG1VP4基因两端还含有能增强基因表达的植物病毒(PVY)调控序列。pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7和pBMG1VP4的结构如图5所示。
2.将植物表达载体导入农杆菌(A.tumefaciens)含有轮状病毒G2VP7、G1VP4、MG2VP7或MG1VP4抗原蛋白基因的质粒pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7或pBMG1VP4被分别通过三亲交配的方式转移到农杆菌LBA4404菌株中，该菌株购自美国Clonetech公司。菌株LBA4404现已被广泛应用是因为它是一改造后的农杆菌，它含有完整Vir基因，但T-DNA已经被删除。Vir基因可反式调节T-DNA自质粒pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7或pBMG1VP4向植物细胞内的转移。
农杆菌在含有25mg/L链霉素50ml YEP(蛋白胨10克，酵母提取物10克，NaCl 5克，加蒸馏水至1升，pH7.0)培养基中振荡培养，在OD600nm值达到0.4-0.7时，4000g离心收集细菌细胞，将农杆菌细胞重新悬浮在1ml不含任何抗生素的YEP培养基中待用。含有表达载体pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7或pBMG1VP4的DH5α(购自美国GIBCO公司)和含有辅助质粒pRK2013(购自美国Clonetech公司)的HB101(购自美国Clonetech公司)分别接种在含有50mg/L卡那霉素50mlLB(蛋白胨5克，酵母提取物10克，NaCl 10克，加蒸馏水至1升，pH7.0)培养基中振荡培养，在OD600nm值达到0.4-0.7时，4000g离心收集细菌细胞，然后将细胞分别悬浮在1ml不含任何抗生素的LB培养基中待用。取上述三种细胞悬浮液各200ul，置于同一1.5ml离心管中，28℃静置培养过夜，取该培养物5-10ul，均匀涂抹在YEP固体培养基平板上，该培养基中同时含有25mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素，28℃培养2天后，含有pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7或pBMG1VP4质粒的农杆菌菌落开始产生。
用碱裂解法从农杆菌中提取质粒DNA，并用限制性内切酶酶切可检测pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7或pBMG1VP4质粒DNA是否存在。
3.农杆菌介导的植物遗传转化植物的遗传转化首先是植物组织器官或细胞与农杆菌共培养，在培养约2天后，将植物外植体移置相应的选择培养基中。植物外植体可以是原生质体、愈伤组织或其它器官组织，因植物而异。选用带叶子的器官是最常用的方法。
叶片转化主要依据Horsch等人的方法(20)。马铃薯无菌苗[品种为中薯3号，中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供]保存在22℃光照培养箱中，辅之以中等光照强度下，每隔3个星期剪取顶端幼芽，重新扦插在不含任何抗生素的MS固体培养基中，生长2星期的叶片最适于转化。番茄(品种为中蔬5号，中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供)则以7-10日龄的子叶或下胚轴无菌外植体进行转化。
无论马铃薯还是番茄均以叶片进行转化为最好。含有表达载体pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7或pBMG1VP4的农杆菌LBA4404接种在50ml YEP培养基(含50mg/ml卡那霉素和25mg/ml链霉素)中28℃培养2天，4000g离心5分钟收集菌体，用25ml液体MS培养液(不含抗生素)洗涤一次，再用MS重新悬浮至OD600nm＝0.2-0.4。将有伤口的叶片浸入稀释后的农杆菌培养液中数分钟，用无菌滤纸吸干叶片上多余的菌液，然后将叶片移置不含任何抗生素的再生培养基上23-25℃共培养2天。将叶片移置新鲜的选择培养基上培养，该培养基中含有100-200ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧苄青霉素，以后每两周更换一次培养基。当叶片伤口处愈伤有幼芽形成并长至足够大时，将幼芽切下(通常在转化后6-10星期)转移到生根培养基上生长。当根出现后，将再生植株移置无菌条件下生长或转移到土壤中，给予适宜的温度、光照和营养条件下生长。
4.表达轮状病毒抗原蛋白基因工程植株的筛选在转化大约四个月后(番茄产生果实需10个月)。可检测转基因植株是否含有轮状病毒抗原蛋白VP7和VP4。
1)生物化学和免疫学检测从转基因植物的叶片、茎、块茎或果实采集样品。并将样品在包被缓冲液(1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，加蒸馏水至1升)中以1∶2(W/V)的比例磨碎后，匀浆液在10000g离心10分钟，取上清液，除留一小部分用于Lowry法定量可溶性蛋白外，其余用于轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白含量的测定。通过免疫亲和酶联免疫法测定转基因植物中的VP7或VP4蛋白含量。首先将转基因植株上清液(包括阴性对照植物)分别加入到酶联反应板的各小孔内，每个小孔内100ul，设两个重复。次日，用PBST缓冲液(8.0g NaCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g kCl，0.5ml Tween20，加蒸馏水至1升，pH7.4)洗四次，每次2分钟，甩干后，加入经PBST(含0.2％BSA)1/200倍稀释的抗G2VP7小鼠单克隆抗体(Chemicon公司产品)(注VP4蛋白测定用的是Chemicon公司的人轮状病毒绵羊多克隆抗体，可与G2VP4和G1VP4发生特异血清学反应)，37℃反应2小时。用PBST洗4次，甩干后加入经PBST(含0.2％BSA)1/5000倍稀释的碱性磷酸酶标记的兔抗鼠酶标抗体(对VP7而言)或兔抗绵羊酶标抗体(对VP4而言)(均为Sigma公司产品)100ul，37℃反应2小时，用PBST洗5次，甩干后加入100ul底物缓冲液[9.7ml二乙醇胺，60mg p-nitrophenyl(Sigma公司)，加蒸馏水至100毫升，pH9.8]，室温下反应30分钟，然后加入50ul 3M NaOH终止反应，读取各小孔450nm光吸收值。
2)轮状病毒VP7或VP4蛋白基因的检测转基因植物中VP7或VP4蛋白基因的整合情况可通过PCR扩增目的片段基因或Southern杂交印迹反应进行检测，自转基因植物和对照植物中分别提取其基因组DNA，依此作为模版，用特异性的包膜中蛋白引物进行扩增，或用BamH I和Sac I双酶切后，电泳分离DNA片段，在转移到尼龙膜上后，以地高辛(Digoxigenin)标记的VP7或VP4蛋白核酸编码序列作为探针。此外，可收集转基因植株自交种子，通过卡那霉素抗性萌发实验或PCR分析其后代的外源基因纯合情况。
5.表达轮状病毒VP7或VP4蛋白转基因植物的繁殖和培育在筛选出高效和稳定表达轮状病毒VP7或VP4蛋白的转基因马铃薯或番茄植株后，为生产该抗原蛋白必须大量繁殖该转基因植株。马铃薯是通过营养繁殖的，因此，可通过扦插的方法，在短时间内便可获得大量幼苗和微型薯，且不必担心由于有性生殖而引起后代的遗传重组问题。番茄或其它依靠种子繁殖的转基因植物要获得稳定表达的后代，则需要较长时间，因为种子繁殖有缺点，其后代缺乏均一性，外源基因按照孟德尔遗传规律传给后代。基本上，每个种子遗传上是不同的，具有它自己的遗传特性。因此，转基因植物最好要经过几代筛选，在得到纯系后，外源基因才能稳定地传给后代。
6.含轮状病毒VP7或VP4蛋白抗原转基因食品的制备轮状病毒VP7或VP4蛋白可通过大量繁殖转基因植物进行生产，植物在收获后可直接食用或加工成胶囊、冲剂以及其它制剂。马铃薯块茎虽然不能够生吃，但在冷冻干燥后，磨成细粉并加工成胶囊、冲剂或其它制剂。而番茄果实则可以加工成瓶装番茄汁方便饮用。在一定时间内，人们通过口服一定量的胶囊、冲剂或番茄汁或直接食用番茄(在一定时间内一次或多次)，其中含有的轮状病毒VP7或VP4蛋白有可能激发人体产生免疫应答反应，人们也就具备了对轮状病毒的免疫能力。
实施例21.马铃薯的转化在农杆菌介导下，利用叶盘法转化马铃薯，然后通过在选择培养基上连续培养和筛选，完整的卡那霉素抗性马铃薯植株被再生出来。
按照Horsch等人的方法，利用叶盘法转化马铃薯。马铃薯无菌苗在重新扦插于MS固体培养基中生长2周后，用剪刀自叶柄与茎相连部位处将叶片剪下。含有表达载体pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7或pBMG1VP4的农杆菌菌株LBA4404接种在50ml YEP中，28℃培养2天，4000g离心5分钟，收集菌体，然后重新悬浮在液体的MS培养基中至OD600nm＝0.4，将剪下叶片浸入稀释后的农杆菌中5分钟，然后取出，用滤纸吸干，叶面朝上置于MS固体培养基上，28℃共培养2天。然后将叶片移置新鲜的选择培养基上，该培养基含有200ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧卞青霉素，可抑制农杆菌细胞的生长并可使转化的植物细胞有选择的生长。以后每隔2个星期更换一次选择性培养基直到叶柄伤口处长出愈伤并分化出幼苗。当幼苗出现并长到足够大时，将幼苗切下来(通常在共培养后4-8个星期)，移到生根培养基上(含有100ug/ml卡那霉素)，当根长出后，幼苗被移到无菌的营养土中生长并辅之以适当的温度和光照条件。
2.转基因马铃薯的RNA分析利用地高辛标记的G2VP7、G1VP4、MG2VP7或MG1VP4蛋白基因探针，对pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7或pBMG1VP4表达载体转化后的卡那霉素抗性马铃薯植株RNA进行了杂交分析。
在pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7或pBMG1VP4表达载体转化所获得的转基因植株中，选取VP7或VP4表达含量最高的转基因马铃薯植株的叶片总RNA被提取，方法见参考文献(21)。大约1.0g叶片在液氮中用研钵磨成粉末，加入10ml RNA提取缓冲液(0.2M Tris-HCl，pH6.8；0.2M NaCl；20mM EDTA；2％SDS)，随即加入10ml饱和酚缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA饱和)进行抽提，然后用10ml的氯仿抽提。3000g离心，收集上层水相，加入0.3M醋酸钾(pH5.2)缓冲液和2.5倍体积的无水乙醇，10000g离心收集沉淀，风干后，沉淀重新悬浮在2ml的水中，随后加入2ml 6M的醋酸铵缓冲液和10ml无水乙醇，10000g离心收集沉淀。沉淀在干燥后，重新悬浮在0.4ml水中，RAN浓度可通过测定260nm的吸光值进行估算，假定1mg/ml的RNA吸光值是25单位。
取10ug RNA样品，约5ul，与2倍体积RNA样品缓冲液(10ml去离子甲酰胺，3.5ml 37％甲醛，2ml 5X MOPS)混合后，65℃加热5分钟，冷却后，加入3ulRNA加样缓冲液(50％甘油，1mM EDTA，0.4％溴酚蓝)，然后经过1％的RNA琼脂糖凝胶电泳。核酸通过毛吸管法转移到尼龙膜(Hybond N+)上，所用的缓冲液为20XSSC，pH7.2(3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠)，转移时间为16小时。核酸通过紫外线照射后被交连在尼龙膜上，将膜置于预杂交液中[5XSSC，0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine，0.02％SDS，100ug/m[鲑鱼精DNA]，68℃预杂交3小时，然后更换新的杂交液[5XSSC，0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine，0.02％SDS，1％的封闭剂(Roche公司试剂盒中提供)，5ml杂交液中加入变性的地高辛标记的DNA针60ng进行杂交，探针长度分别为978bp(G2VP7)、2328bp(G1VP4)，它们分别是来自质粒pG2VP7、和pG1VP4、pMG2VP7或pMG1VP4的PCR扩增产物(扩增引物对见实施例1中的1)，包括了轮状病毒VP7或VP4蛋白基因的全部编码序列(包括基因密码子优化后的序列)。在杂交液中68℃杂交24小时后，取出杂交膜，于200ml 2XSSC，0.1％SDS缓冲液中室温下洗膜2次，然后于100ml 0.1XSSC，0.1％SDS缓冲液中68℃洗膜2次。显色反应基本依据试剂盒中提供的方法(Roche公司)，尼龙膜先于洗脱缓冲液
中平衡5分钟，然后用50ml 1X封闭缓冲液封闭30分钟，加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体至浓度为75mU/ml，室温下反应30分钟，用洗脱缓冲液2次，每次15分钟。将膜移置20ml显色缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH9.5；0.1M NaCl；50mMMgCl2)中平衡5分钟，更换新的底物缓冲液(200ul NBT/BCIP底物加入10ml显色缓冲液)，遮光条件下显色16小时，待所期望的条带出现后，用水终止反应。
经质粒pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7或pBMG1VP4转化的转基因植株和阴性对照植物的RNA杂交结果如图示6。pBMG2VP7或pMBG1VP4转基因植株的RNA杂交信号分别pBG2VP7和pBG1VP4强很多，这可能是由于1)在这些转基因植株中VP7和VP4基因被分别按照植物所偏爱的密码子进行优化；2)基因5’端和3’端分别增加了源自PVY的核苷酸调控序列。和标准RNA分子量相比，转录的RNA约有1Kb(G2VP7)、1.2Kb(MG2VP7)、2.3Kb(G1VP4)和2.6Kb(MG1VP4)长，与预先估计的相一致。阴性对照植物的RNA没有观察到杂交信号。在pBMG2VP7或pBMG1VP4转基因植株中，mRNA的稳定、大量表达并能够与编码轮状病毒VP7或VP4蛋白核苷酸序列探针特异性杂交的结果表明目的mRNA的含量在这些转基因植株中得到了显著提高。
3.转基因马铃薯植株VP7或VP4蛋白含量的测定取不同转基因马铃薯植株叶片0.1g，各加入1.5ml去离子水，在4℃下用玻璃匀浆器磨碎。匀浆液10000g 4℃离心5分钟，利用Lowry法(蛋白测定试剂盒购自Sigma公司，货号为P5656)，取部分上清液测定可溶性蛋白含量。利用酶联免疫吸附实验(见实施例1中的4)测定转基因植物上清液中VP7或VP4蛋白含量。以标准含量的人轮状病毒G2血清型(Argene公司产品)为阳性对照，因为无法获得标准含量的G2VP7或G1VP4蛋白，以下所测定的G2VP7或G1VP4蛋白表达量为近似值。阳性对照以倍比稀释成不同蛋白含量水平(1280.0-10.0ng)，在颜色反应后，读取450nm光吸收值，制备一条标准吸收曲线。如图7中所示，通过比较发现，阴性对照植物中(柱1，2)没有发现含有VP7或VP4蛋白，而在转基因马铃薯植株中则可以检测到不同含量的G2VP7或G1VP4蛋白，其中pBMG2VP7转基因植株VP7重组蛋白含量约为720ng，占植物可溶性蛋白的0.15％。比pBG2VP7的0.01％提高约15倍(柱3和株4)。pBMG1VP4转基因植株中VP4重组蛋白含量约为480ng，占植物可溶性蛋白的0.1％，比pBG1VP4的0.005％提高约20倍(柱5和柱6)。
4.转基因马铃薯不同组织器官轮状病毒VP7或VP4蛋白含量的测定取转基因马铃薯叶片、茎和块茎组织各0.1g，处理和测定方法同上。表2中列出了转基因马铃薯(pBMG2VP7和pBMG1VP4)不同组织器官中VP7或VP4蛋白的含量。
表2转基因马铃薯叶子、茎和块茎中的VP7或VP4蛋白含量 如表2，马铃薯叶子中的G2VP7重组抗原蛋白表达量最高约为可溶性蛋白的0.15％，达到720ng/g鲜重叶片。茎中的G2VP7蛋白尽管表达量占植物可溶性蛋白的0.3％，但因茎中含有的可溶性蛋白量比较低，故每g鲜重只含有340ng G2VP7蛋白，约为叶片的一半。马铃薯块茎中的G2VP7蛋白含量最高，约为2450ng/g鲜重，这就为加工和利用马铃薯块茎提供了极大的方便。
5.表达轮状病毒VP7和VP4重组抗原蛋白转基因马铃薯的繁殖转基因马铃薯的繁殖已在实施例1中描述。
实施例31.番茄的转化番茄(Lycopersicom esculentum)品种中蔬5号(购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所)的转化方法如同实施例2的1中所描述的那样，也是在农杆菌LBA4404介导下利用叶盘法进行遗传转化。农杆菌侵染生长7-10天后子叶或下胚轴无菌外植体，该外植体不需预培养，而是在切下后立即浸入农杆菌菌液中5-10分钟，取出后用滤纸吸干多余的菌液，后移置Z1培养基(MS基本培养基中加入1mg/L玉米素)，25℃遮光条件下共培养2天。然后将外植体转移到SM培养基(MS基本培养基中加入1mg/L玉米素，100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素)诱导愈伤组织形成和幼苗分化。切下的幼苗在RM培养基(1/2MS基本培养基中加入0.2mg/L NAA，100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素)诱导生根，待长至一定高度，然后转移到灭菌土壤中，给予适宜的条件培养生长。
2.PCR检测VP7和VP4抗原蛋白基因在番茄中的整合情况番茄基因组DNA的提取方法基本依据Chee的方法(22)。取3g番茄鲜叶片，放入研钵中用液氮研磨，磨碎后的粉末移置20ml离心管中，然后加入9ml CTAB提取液(100mM Tris-HCl，pH7.5含5M NaCl，10mM EDTA，10ml/Lβ-巯基乙醇，10g/L CTAB)，剧烈振荡1分钟，使之充分混匀。在60℃水浴中温浴90分钟，期间每30分钟振荡一次。从水浴中取出离心管，室温下放置4-5分钟，使之冷却，然后加入4.5ml氯仿，轻轻摇动，使之充分混匀。室温下5000g离心10分钟。收集上清液于另一20ml离心管中，加入4.5ml氯仿，重复上述步骤。收集上清液，加入10ml冰冷的异丙醇，轻摇10-15分钟，5000g离心5分钟，收集沉淀，用3ml 76％乙醇含0.2M NaOAc和2ml 76％乙醇含10mM NH4OAc各洗沉淀一次，最后加入TE(pH8.0)缓冲液溶解DNA，将DNA浓度调至1ug/ul。
取上述番茄基因组DNA 1ug约1ul作为模版，分别加入轮状病毒G2VP7或G1VP4蛋白基因核苷酸编码序列特异性引物对(见实施例1中的1)各1ul，10XPCR缓冲液3ul，dNTP(各2.5mM)3ul，Taq酶0.5ul约1.5U，加水至总体积30ul。94℃30秒，50℃45秒，72℃1.5分钟，共进行35个循环。反应结束后，取5ul扩增样品进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。如图8A和8B所示，阴性对照植物中(泳道3)没有发现特异性的条带，而在G2VP7转基因番茄植株中则可扩增出1个约1.0kb的特异性条带(泳道1和2)，在G1VP4转基因番茄植株中则可扩增出1个约2.3kb的特异性条带(泳道1和2)，该结果表明轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白基因已整合进入番茄基因组DNA中。
3.转基因番茄未成熟果实中的RNA分析转基因番茄未成熟果实中RNA的提取方法如同实施例2中的2。RNA样品的电泳、转膜、杂交与显色反应如同实施例2中的2。
经质粒pBG2VP7、pBG1VP4、pBMG2VP7或pBMG1VP4转化的转基因植株和阴性对照植物的RNA杂交结果如图示9。pBMG2VP7或pBMG1VP4转基因植株的RNA杂交信号分别pBG2VP7或pBG1VP4强很多，并且与转基因马铃薯叶片RNA的分析结果相类似，表明目的mRNA的含量在这些转基因植株中得到了显著提高。
在成熟果实中RNA的含量很低，不能进行RNA印迹分析。
4.叶子和果实中VP7或VP4中蛋白含量的测定用研钵将植物组织磨碎，在磨碎过程中加入液氮，植物组织粉末中加入10倍体积灭菌无离子水进行稀释。植物匀浆液10000g 4℃离心5分钟，依据试剂盒(Sigam，p5656)提供的方法，取部分上清液测定可溶性蛋白含量。蛋白测定和定量方法同实施例2中的3。如图10中所示，通过比较发现，阴性对照植物中(柱1，2)没有发现含有G2VP7或G1VP4蛋白，而在转基因番茄植株中则可以检测到不同含量的G2VP7或G1VP4蛋白，其中pBMG2VP7转基因番茄植株叶片中VP7重组蛋白含量约为3200ng，占植物可溶性蛋白的0.13％。比pBG2VP7的0.02％提高约6.5倍(柱3和株4)。pBMG1VP4转基因番茄植株叶片中VP4重组蛋白含量约为1560ng，占植物可溶性蛋白的0.067％，比pBG1VP4的0.005％提高约13.4倍(柱5和柱6)。上述结果表明，使用源自植物病毒(PVY)核苷酸序列作为增强表达调控序列，并结合目的基因密码子的优化等措施，在转基因番茄中同样能够提高VP7或VP4基因在植物中的表达含量。
表3中列出了转基因番茄(pBMG2VP7和pBMG1VP4)叶子和果实中G2VP7或G1VP4重组抗原蛋白的含量。取在温室中生长的转基因番茄的绿叶和红色果实进行植物可溶性蛋白以及G2VP7或G1VP4重组蛋白含量的测定，就象上述所描述的那样。非转基因植物叶子和果实中检测不到G2VP7或G1VP4蛋白。
表3转基因番茄叶子和果实中的轮状病毒VP7或VP4重组蛋白含量 番茄叶子中的包膜中蛋白含量远高于马铃薯叶片，表达量为可溶性蛋白的0.13％。在成熟果实中G2VP7重组蛋白的含量约占可溶性蛋白的0.0091％，或为182ng/g果实鲜重。因为果实的密度比较高，番茄果实中的VP7或VP4蛋白表达量集中了番茄植株VP7或VP4的大部分，，一个重100克的番茄果实含有大约18.2ug G2VP7或7.4ug G1VP4重组抗原蛋白。
实施例41.轮状病毒VP7或VP4重组抗原蛋白在植物组织中的稳定性测定轮状病毒G2VP7或G1VP4重组抗原蛋白在完整的植物细胞中可长时间保存。如以马铃薯块茎方式4℃下低温保存，保存期长达一年，抗原蛋白也不会有任何损失。但当植物细胞结构破坏后，细胞器中的各种蛋白酶就会被释放出来，它们能降解植物汁液中所含的重组抗原蛋白。因此，检测重组抗原蛋白在植物汁液中的稳定性，对于今后在加工过程中尽可能保证抗原蛋白不受损失至关重要。从图11中可以看出，轮状病毒VP7或VP4重组抗原蛋白在植物汁液中放置的时间越长，蛋白的损失就会越大。在室温下放置1天后与新研磨的汁液中G2VP7抗原蛋白含量相差20％，从第2天起，抗原蛋白的量会急剧减少，到第七天后，基本上检测不到抗原蛋白了。该结果表明，在转基因马铃薯块茎加工过程中，应尽快使其脱水干燥，才可以有效防止重组抗原蛋白不会被细胞中释放出的蛋白酶降解破坏。
尽管高温可加速转基因马铃薯块茎脱水干燥，但轮状病毒G2VP7或G1VP4重组抗原蛋白对高温的忍受能力是有限的。从图12可以看出，当温度超过50℃时，处理时间达3小时，植物汁液中能够检测到的G2VP7抗原蛋白的数量急剧下降，这表明该抗原蛋白可忍受的极限高温是50℃。超过此温度，蛋白会变性，从而失去与特异性抗体的反应能力。
综合上述，可以得出如下结论，干燥马铃薯块茎以低温、快速最为适宜，在此条件下可有效保护重组抗原蛋白不受损失。
2.含轮状病毒VP7或VP4重组抗原蛋白冲剂的制备马铃薯块茎不便于食用，可考虑加工成冲剂。1000g鲜重马铃薯块茎在冷冻干燥后可获得干物质约150g，该干物质进而在低温下被磨成150-200目的干粉，经测定，每100mg这种转基因马铃薯块茎制成的干粉中约含有1.5ug VP7或0.54ug VP4重组抗原蛋白。为便于婴幼儿服用，可采用冲剂包装形式，每袋内装入1-5g由转基因马铃薯块茎制成的干粉。以5g包装为例，含有VP7或VP4重组抗原蛋白分别约75ug和27ug。3岁以下儿童只需服用1袋，便可能获得足够的免疫剂量。在服用时，为避免高温导致蛋白变性，可伴以温开水稀释后服下。
3.含轮状病毒VP7或VP4重组抗原蛋白的其它制剂含VP7或VP4重组抗原蛋白的转基因番茄果实在直接食用时存在一些问题，首先是3岁以下婴幼儿无法直接生吃番茄，其次因为不可能对每个番茄中的抗原蛋白含量进行测定，因而也就无法确定每个婴幼儿每次食用几个番茄果实较为适宜。在这种情况下，可考虑将番茄果实加工成果茶或其它饮用形式，只需对每批产品进行抽样检测，便可作为婴幼儿服用剂量的指导依据。当然，马铃薯块茎或其它转基因植物也可以加工成饮料的方式便于服用，其前提是必须保证在液体情况下VP7或VP4重组抗原蛋白不会被蛋白酶所降解，在室温条件下能够长期储存。
植物来源的VP7或VP4重组抗原蛋白还可以有其它应用方式，例如，抗原蛋白在经过完全纯化或部分纯化后，可作为食品添加剂，掺入奶粉、豆粉、果汁和酸奶等食物以及饮料中制备成各种特殊功能性食品。
实施例51.利用亲和层析法从转基因马铃薯或番茄中提纯轮状病毒VP7或VP4重组蛋白轮状病毒绵羊多克隆抗体购自美国Chemicon公司，该抗体可与轮状病毒G1、G2、G3和G4等四个血清型的VP7及基因型P[4]和P[8]的VP4蛋白产生免疫学反应。首先通过酶联免疫吸附试验证实转基因马铃薯块茎或番茄叶片提取物中含有能够与该抗体产生特异性反应的物质，然后通过SDS-PAGE电泳检测植物中重组蛋白的大小。
按照产品说明书中提供的方法，轮状病毒绵羊多克隆抗体被固定在经CNBr活化的Sepharose 4B上(Pharmacia Biotech公司)，得到活化的抗体-凝胶复合物。分别取1000克pBMG2VP7转基因马铃薯块茎或pBMG1VP4番茄叶片，加入等量PBS缓冲液(含有0.1％Triton X-100；0.5mM PMSF)，在4℃下匀浆。匀浆液经40,000g离心后收集上清液。上清液经冷冻干燥后，重新溶解在20ml TSA缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，140mM NaCl，0.025％NaN3)中，然后与上述活化的抗体-凝胶复合物在4℃下充分混合16小时。反应物上柱后，用5倍柱体积pH8.0和pH9.0的Tris缓冲液(50mM Tris-HCl，0.1％Triton X-100，500mM NaCl)分别洗柱，接着用10ml三乙醇胺缓冲液(50mM三乙醇胺，pH11.5，0.1％TritonX-100，150mM NaCl)进行洗脱，洗脱液分别收集在10个1.5ml离心管中。通过酶联吸附反应检测每个离心管中抗原蛋白的有无。将有免疫反应的洗脱液汇集在一起，装入透析袋中进行4℃透析过夜，透析缓冲液为2升PBS。透析完成后从透析袋中吸出透析物，经冷冻干燥后，重新溶解在1ml PBS缓冲液中，然后从中取出20ul进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳检测发现转基因植物中重组G2VP7蛋白的分子量约为38KD，G1VP4为88KD，分别与作为阳性对照的轮状病毒(Argene公司产品)的G1VP7蛋白(分子量38KD)和G1VP4蛋白(88KD)相类似(见图13)。
2.小鼠的注射免疫接种试验供试小白鼠(BALB/c)购自原北京医科大学(现北京大学医学部)，两种性别，但每批实验各处理组的小鼠均为雄性或雌性，体重在15-20克左右。取100ng经亲合层析后的轮状病毒G2VP7(源自马铃薯块茎)或G1VP4抗原蛋白(源自番茄叶片)，分别加入PBS缓冲液至终体积200ul，不加入任何佐剂，以腹腔注射方式免疫每只小鼠，每组接种5只小鼠。每隔10天注射接种1次，在第5次接种后10天通过眼部取血方式收集小鼠抗血清。
抗血清的效价通过酶联免疫吸附反应进行测定，轮状病毒培养物G1或G2血清型(Argene公司产品)经包被缓冲液稀释(1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，加蒸馏水至1升)后，每个小孔内加入100ul(含抗原50ng)，4℃下包被过夜。次日，用PBST缓冲液(8.0g NaCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g kCl，0.5mlTween20，加蒸馏水至1升，pH7.4)洗四次，每次2分钟，甩干后，加入经PBST(含0.2％BSA)稀释成不同浓度的小鼠抗血清100ul，37℃反应2小时。用PBST洗4次，甩干后加入经PBST(含0.2％BSA)1/5000倍稀释的碱性磷酸酶标记的兔抗绵羊酶标抗体(Sigma公司产品)100ul，37℃反应2小时，用PBST洗5次，甩干后加入100ul底物缓冲液[9.7ml二乙醇胺，60mg p-nitrophenyl(Sigma公司)，加蒸馏水至100毫升，pH9.8]，室温下反应30分钟，然后加入50ul 3M NaOH终止反应，读取各小孔450nm光吸收值。
表4不同免疫原小鼠抗血清效价的比较 (1)表中数字为3次实验的平均值(OD450nm吸光值)
如表4所示，在注射接种同样剂量抗原蛋白的情况下，植物来源的VP7和VP4重组抗原蛋白均能够产生特异性的轮状病毒抗体。在用其检测同样数量的轮状病毒抗原时，在相同稀释度的情况下，VP4抗血清其OD450nm的吸光值比VP7要高。这表明VP4的免疫原性似乎比VP7更强一些，这可能与该蛋白分子量比较大有关。VP7和VP4抗血清在各种稀释度下均不与阴性对照蛋白产生免疫学反应。
3.小鼠的口服免疫接种实验供试的小鼠与上面注射接种实验相同。因自然取食无法规范确定每个小鼠的免疫剂量(各小鼠吃的量不一致)，故口服免疫接种采取一次性口腔注入的方法。分别秤取1g G2VP7转基因马铃薯块茎(约含2.4ug VP7重组抗原蛋白)或1gG1VP4转基因马铃薯块茎(约含0.96ug VP4重组抗原蛋白)，与1mlPBS缓冲液混合后，利用玻璃匀浆器研磨成细颗粒状，加入PBS缓冲液至终体积2ml。秤取1g G2VP7转基因马铃薯块茎和1g G1VP4转基因马铃薯块茎，混合在一起后利用玻璃匀浆器研磨成细颗粒状，加入PBS缓冲液至终体积2ml。然后利用针尖为圆球形(可避免对小鼠食道造成伤害)的注射器(购自北京化学试剂商店)将粗匀浆液通过小鼠口腔小心注入小鼠食道内(在操作过程中避免对小鼠消化道造成任何伤害)。小鼠在口服接种前先饥饿24小时，接种后2小时之内不予进水。
所有处理组均每隔10天口服接种1次，共接种8次。在每次口服接种后的第7天，从小鼠尾静脉取血3滴，将每组(5只小鼠)小鼠的血汇集在一起，然后与100ul PBS缓冲液混合后，室温下放置1小时，离心收集上部血清，-20℃下保存待测。小鼠抗体的产生情况通过酶联免疫吸附实验进行检测，具体操作方法如同实施例5中的2。
检测结果如表5所示，用分别含有G2VP7和G1VP4植物重组抗原蛋白的转基因马铃薯块茎口服接种小鼠是可以诱导特异性抗体产生的，但抗体滴度比注射接种要弱，而且首次免疫应答反应出现的时间也比较晚。将含有G2VP7和G1VP4植物重组抗原蛋白的转基因马铃薯块茎混在一起研磨后再口服接种小鼠，获得的抗血清不仅能够与轮状病毒血清型G1发生特异性抗体-抗原反应，同时还能够与血清型G2发生特异性血清学反应，这表明在转基因中表达两种不同血清型或基因型的重组抗原蛋白在同时口服接种时，可分别诱导针对各自免疫原的特异性抗体，这也同时表明利用这种方式生产婴幼儿轮状病毒多价口服疫苗是可行的。食用阴性对照植物的小鼠未出现类似的免疫学应答。
表5转基因植物以口服方式接种后小鼠体内抗体产生情况的比较 (1)表中数字为3次实验的平均值(OD450nm吸光值)4.小鼠食用转基因马铃薯后的安全性评价小鼠(BALB/c)每次饲喂1ml的转基因马铃薯块茎(0.5g)汁液，每隔10天饲喂1次，连续饲喂半年，并在此后观察半年，无论是G2VP7还是G1VP4处理组均没有发现供试小鼠有畸变、死亡或其它异常情况发生。同样地，小鼠每3天饲喂2ml转基因马铃薯块茎(1g)汁液1次，连续饲喂2周，此后的观察无论是G2VP7还是G1VP4处理组也未发现小鼠有畸变、死亡和其它异常情况发生，见表6。这些结果表明食用含有G2VP7或G1VP4重组抗原蛋白的转基因植物是安全的。
表6小鼠食用转基因马铃薯后的安全性评价 (1)每组供试的小鼠有5只。(2)“-”代表没有参考文献1.侯云德著，分子病毒学，学苑出版社，1990
2.方肇寅，齐锦、杨辉等，病毒学报，2001，17(1)17-233.江志奎和李钟铎，中国生物制品学杂志，2000，13(1)61-624.陈冬梅，白植生，刘溯等，中国生物制品学杂志，1994，7(2)53-565.孙茂盛，Giambiagi S.和Safrikanova I.等，中国生物制品学杂志，1998，11(3)129-1326.Chen S.C.，Jones D.H.，Fynan E.F.，et al.，Journal of Virology，1998，72(7)5757-57667.de Aizpurua and Russell-Jones，J.Exp.Med.，1988，167440-4518.Man-kit，L.D.，Arntzen，C.J.and Mason，H.S.，WO 94/20135，19949.Mason H.S.，Lam D.M.-K.and Arntzen C.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89(12)11745-1174910.刘玉乐，王晋芳和邱并生等，中国科学(B辑)，1993年，23(3)57-6011.Tacket C.，Mason H.，Losonsky G.，Clement J.，Levine M.and ArntzenC.，Nature Medicine，1998，4607-60912.Mason H.，Haq T.，Clements J.and Arntzen C.，Vaccine，1998，161336-134313.Arakawa T.，Chong D.，Merritt J.and Langridge W，Trans.Res.，1997，6403-42314.Arakawa T.，Chong D.，and Langridge W，Nat.Biotechnol.，1998，16292-29715.王新国，张国华，方荣祥等，生物技术通讯，2000，11(2)98-10216.Mason H.S.，Ball J.M.，Shi J.J.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，935335-534017.McGarvey P.B.，Hammond J.，Dienelt M.M.，et al.，Bio/Technology.，1995，1484-148718.刘德虎，生物技术通报，1999，41-519.Chen S.C.，Jones D.H.，Fynan E.F.，et al.，Journal of Virology，1998，72(7)5757-576620.Horsch，R.B.，et al.，Science，1985，2271229-123121.Mason，H.，et al.，Plant Molecular Biology，1988，11845-85622.Chee，P.P.，Drong，R.F.and Slightom，J.L.，Plant Molecular BiologyManual，1991，C31-28本发明的进一步描述只是一些特别的优先实施方案，是按照专利申请要求和为了解释和说明本专利的内容。很显然，在不背离本发明的精神和范围之内，可在此基础上，做进一步的改进和变化。
序列表<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>提高轮状病毒VP7或VP4植物表达含量的方法及产品<140>200310117119.9<141>2003-12-03<160>8<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>5’UTP<222>(1)...(28)<223>根据马铃薯Y病毒mRNA 5’端非编码区而设计，以提高轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白基因在转基因植物中的表达含量。
<400>1atcacttcca accaatttca gatcaaca28<210>2<211>981<212>DNA<213>人轮状病毒(huamn rotavirus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(981)<400>2atg tac ggt tat gaa tat acc aca att cta acc att ctg ata ttt atc 48Met Tyr Gly Tyr Glu Tyr Thr Thr Ile Leu Thr Ile Leu Ile Phe Ile1 510 15att cta ctc aac tat ata tta aaa act ata acc aat acg atg gac tac 96Ile Leu Leu Asn Tyr Ile Leu Lys Thr Ile Thr Asn Thr Met Asp Tyr20 25 30att ata ttt aga ttt ttg tta ctc atc gct ttg atg tca cca ttt gtg 144Ile Ile Phe Arg Phe Leu Leu Leu Ile Ala Leu Met Ser Pro Phe Val35 40 45agg aca cag aac tat gga atg tat tta cca ata aca gga tca cta gat 192Arg Thr Gln Asn Tyr Gly Met Tyr Leu Pro Ile Thr Gly Ser Leu Asp50 55 60
gct gta tac aca aac tct act agt gga gaa tca ttt cta aca tcc aca 240Ala Val Tyr Thr Asn Ser Thr Ser Gly Glu Ser Phe Leu Thr Ser Thr65 70 75 80tta tgt ttg tat tat cca act gaa gca aaa aat ggg atc agt gat aat 288Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Lys Asn Gly Ile Ser Asp Asn85 90 95gaa tgg gaa aat act tta tcg caa tta ttt tta aca aaa ggt tgg cca 336Glu Trp Glu Asn Thr Leu Ser Gln Leu Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro100 105 110aca gga tca gtc tat ttt aaa gac tac aat gat att act act ttt tcc 384Thr Gly Ser Val Tyr Phe lys Asp Tyr Asn Asp Ile Thr Thr Phe Ser115 120 125atg aat cca caa tta tat tgt gat tat aac ata gta cta atg aga tat 432Met Asn Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Ile Val Leu Met Arg Tyr130 135 140gat aat aca tct gaa tta gat gga tca gaa tta gct gat ttg ata ttg 480Asp Asn Thr Ser Glu Leu Asp Gly Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu145 150 155 160aat gaa tgg tta tgt aat cca atg gat ata tca tta tat cat tac caa 528Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Ser Leu Tyr His Tyr Gln165 170 175caa aat agt gaa tca aat aag tgg ata tca atg gga aca gac tgt act 576Gln Asn Ser Glu Ser Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Thr Asp Cys Thr180 185 190gtg aaa gtg tgt cca ctg aat aca caa agc ttg gga ata ggt tgt aaa 624Val Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Ser Leu Gly Ile Gly Cys Lys195 200 205aca acg gac gta gac aca ttt gaa att gtc gct tcg tct gaa aaa tta 672Thr Thr Asp Val Asp Thr Phe Glu Ile Val Ala Ser Ser Glu Lys Leu210 215 220gta ata act gat gtc gtt aat ggg gtt aat cat aaa ata aat att tca 720Val Ile Thr Asp Val Val Asn Gly Val Asn His Lys Ile Asn Ile Ser225 230 235 240ata agt aca tgt act att cga aat tgt aat aag tta ggt cca aga gag 768Ile Ser Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Asn Lys Leu Gly Pro Arg Glu245 250 255aat gta gct ata ata caa gtt ggt ggc ccg aat gca tta gac ata aca 816Asn Val Ala Ile Ile Gln Val Gly Gly Pro Asn Ala Leu Asp Ile Thr
260 265 270gct gat cca acg act gtt cca caa gtt caa aga atc atg aga gtg aat 864Ala Asp Pro Thr Thr Val Pro Gln Val Gln Arg Ile Met Arg Val Asn275 280 285tgg aaa aaa tgg tgg caa gta ttt tat act gta gta gat tat att aat 912Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Val Val Asp Tyr Ile Asn290 295 300cag att ata cag gtt atg tcc aaa aga tca aga tca tta gac aca gct 960Gln Ile Ile Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asp Thr Ala305 310 315 320gcg ttt tat tat aga att tag 981Ala Phe Tyr Tyr Arg Ile *325<210>3<211>981<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(981)<223>根据人轮状病毒血清型G2VP7基因而设计，在未改变所编码氨基酸序列的前提下，所有密码子均按照植物所偏爱的密码子进行了修改和人工合成。
<400>3atg tac ggt tac gac tac acc acc atc ctc acc atc ctc atc ttc atc 48Met Tyr Gly Tyr Glu Tyr Thr Thr Ile Leu Thr Ile Leu Ile Phe Ile1 5 10 15atc ctc ctc aac tac atc ctc aaa acc atc acc aat acc atg gac tac 96Ile Leu Leu Asn Tyr Ile Leu Lys Thr Ile Thr Asn Thr Met Asp Tyr20 25 30att atc ttc agg ttc ctc ctc ctc atc gcc ctc atg tcg cca ttc gtg 144Ile Ile Phe Arg Phe Leu Leu Leu Ile Ala Leu Met Ser Pro Phe Val35 40 45agg acc cag aac tac gga atg tac ctc cca atc acc gga tcg ctc gat 192Arg Thr Gln Asn Tyr Gly Met Tyr Leu Pro Ile Thr Gly Ser Leu Asp50 55 60gcc gtg tac acc aac tcg acc agg gga gac tcg ttc ctc acc tcg acc 240Ala Val Tyr Thr Asn Ser Thr Ser Gly Glu Ser Phe Leu Thr Ser Thr
65 70 75 80ctc tgc ctc tac tac cca acc gac gca aag aat ggg atc agg gac aat 288Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Lys Asn Gly Ile Ser Asp Asn85 90 95gac tgg gac aat acg ctc tcg cag ctc ttt ctc aca aag ggt tgg cca 336Glu Trp Glu Asn Thr Leu Ser Gln Leu Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro100 105 110acc gga tcg gtg tat ttt aag gac tac aat gac atc acc acc ttc tcg 384Thr Gly Ser Val Tyr Phe lys Asp Tyr Asn Asp Ile Thr Thr Phe Ser115 120 125atg aac cca cag ctc tac tgc gac tac aac atc gtg ctc atg agg tac 432Met Asn Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Ile Val Leu Met Arg Tyr130 135 140gac aat acc tcg gac ctc gac gga tcg gag ctc gct gac ctc atc ctc 480Asp Asn Thr Ser Glu Leu Asp Gly Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu145 150 155 160aat gag tgg ctc tgc aat cca atg gac atc tcc ctc tat cag tac cag 528Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Ser Leu Tyr His Tyr Gln165 170 175cag aat agc gag tcg aat aag tgg atc tcg atg gga acc gac tgc acc 576Gln Asn Ser Glu Ser Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Thr Asp Cys Thr180 185 190gtg aag gtg tgt cca ctg aat acc cag agc ttg gga ata ggt tgc aag 624Val Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Ser Leu Gly Ile Gly Cys Lys195 200 205acc acc gac gtg gac acc ttc gac atc gtg gct tcg tcg gac aag ctc 672Thr Thr Asp Val Asp Thr Phe Glu Ile Val Ala Ser Ser Glu Lys Leu210 215 220gtc atc act gac gtg gtg aat ggg gtg aat cag aag atc aat ctc tcc 720Val Ile Thr Asp Val Val Asn Gly Val Asn His Lys Ile Asn Ile Ser225 230 235 240atc agc acc tgc act atc cga aat tgc aat aag ctc ggt cca aga gag 768Ile Ser Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Asn Lys Leu Gly Pro Arg Glu245 250 255aat gtg gct atg atc cag gtg ggt ggc ccg aat gca ctc gac atc aca 816Asn Val Ala Ile Ile Gln Val Gly Gly Pro Asn Ala Leu Asp Ile Thr260 265 270gct gac cca acc acc gtg cca cag gtg cag agg atc atg agg gtg aat 864
Ala Asp Pro Thr Thr Val Pro Gln Val G ln Arg Ile Met Arg Val Asn275 280 285tgg aag aag tgg tgg cag gtg ttc tac act gtg gtg gac tac atc aat 912Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Val Val Asp Tyr Ile Asn290 295 300cag atc atc cag gtg atg tcg aag agg tcg agg tcg ctc gac acc gct 960Gln Ile Ile Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asp Thr Ala305 310 315 320gcg ttt tac tac agg atc tag 981Ala Phe Tyr Tyr Arg Ile *325<210>4<211>326<212>PRT<213>人轮状病毒(human rotavirus)<400>4Met Tyr Gly Tyr Glu Tyr Thr Thr Ile Leu Thr Ile Leu Ile Phe Ile1 5 10 15Ile Leu Leu Asn Tyr Ile Leu Lys Thr Ile Thr Asn Thr Met Asp Tyr20 25 30Ile Ile Phe Arg Phe Leu Leu Leu Ile Ala Leu Met Ser Pro Phe Val35 40 45Arg Thr Gln Asn Tyr Gly Met Tyr Leu Pro Ile Thr Gly Ser Leu Asp50 55 60Ala Val Tyr Thr Asn Ser Thr Ser Gly Glu Ser Phe Leu Thr Ser Thr65 70 75 80Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Lys Asn Gly Ile Ser Asp Asn85 90 95Glu Trp Glu Asn Thr Leu Ser Gln Leu Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro100 105 110Thr Gly Ser Val Tyr Phe lys Asp Tyr Asn Asp Ile Thr Thr Phe Ser115 120 125Met Asn Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Ile Val Leu Met Arg Tyr130 135 140Asp Asn Thr Ser Glu Leu Asp Gly Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu145 150 155 160Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Ser Leu Tyr His Tyr Gln165 170 175
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<221>3’UTP<222>(1)...(200)<223>根据马铃薯Y病毒mRNA 3’端非编码区而设计，以提高轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白基因在转基因植物中的表达含量。
<400>5ggcctgactc tatctggtta attccgcatt attaagtttt gaataaaaag tgccgggttg 60tcgttgttgt ggatgattca tcgattaggt gatgttgcga ttctgtcgta gcagtaacta 120tgtctggatc tatctgcttg ggtggtgttg tgatttcgtc ataacagtga ctgtaaactt 180caatcaggag acaaaaaaaa 200<210>6<211>2328<212>DNA<213>人轮状病毒(human rotavirus)
<220>
<221>CDS<222>(1)...(2328)<400>6atg gct tca ctc att tat aga cag ctt ctc act aat tca tat tcg gta 48Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Ser Val1 5 10 15gac ttg cat gac gaa ata gaa cag att gga tcg gag aaa act caa aat 96Asp Leu His Asp Glu Ile Glu Gln Ile Gly Ser Glu Lys Thr Gln Asn20 25 30gtg acg gta aat cca ggc cca ttt gca cag act aga tat gct cca gtt 144Val Thr Val Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Pro Val35 40 45aat tgg gga cac gga gag att aat gat tca act aca gtg gaa cca gtt 192Asn Trp Gly His Gly Glu Ile Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val50 55 60tta gat ggt cct tat caa ccg act aca ttc aaa cca ccc aat gat tat 240Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Lys Pro Pro Asn Asp Tyr65 70 75 80tgg ctg ctt att agt tca aat aca gat gga gta gtt tat gag agt aca 288Trp Leu Leu Ile Ser Ser Asn Thr Asp Gly Val Val Tyr Glu Ser Thr85 90 95aat aat agt gac ttt tgg aca gca gtt atc gct gtc gaa cca cat gtc 336Asn Asn Ser Asp Phe Trp Thr Ala Val Ile Ala Val Glu Pro His Val100 105 110agt caa aca aat agg caa tat gtt tta ttt ggt gag aat aag cag ttt 384Ser Gln Thr Asn Arg Gln Tyr Val Leu Phe Gly Glu Asn Lys Gln Phe115 120 125aac gta gaa aat agt tca gat aaa tgg aaa ttt ttc gaa atg ttt aaa 432Asn Val Glu Asn Ser Ser Asp Lys Trp Lys Phe Phe Glu Met Phe Lys130 135 140ggt aat agt cag agt gat ttt tct aat aga cgg act tta acc tct aat 480Gly Asn Ser Gln Ser Asp phe Ser Asn Arg Arg Thr Leu Thr Ser Asn145 150 155 160aat aga ctt gta gga atg cta aaa tat ggt gga aga gta tgg acg ttt 528Asn Arg Leu Val Gly Met Leu Lys Tyr Gly Gly Arg Val Trp Thr Phe165 170 175cat ggt gaa aca cca aga gct act act gat agt tcg aat act gcg gat 576
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<21l>2328<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(2328)<223>根据人轮状病毒血清型G1VP4基因而设计，在未改变所编码氨基酸序列的前提下，所有密码子均按照植物所偏爱的密码子进行了修改和人工合成。
<400>7atg gct tcg ctc atc tac agg cag ctc ctc acc aat tcg tac tcg gtg 48Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Ser ValI 5 10 15gac ttg cat gac gag atc gag cag atc gga tcg gag aag acc cag aat 96Asp Leu His Asp Glu Ile Glu Gln Ile Gly Ser Glu Lys Thr Gln Asn20 25 30gtg acg gta aat ccc ggc cca ttc gca cac act aga tag gct cca gtt 144Val Thr Val Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Pro Val35 40 45aat tgg ggg cac gga gag atc aat gac tcg acc acc gtg gag cca gtg 192Asn Trp Gly His Gly Glu Ile Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val50 55 60tta gac ggt cct tac cag ccg acc acc ttc aag cca ccc aat gac tac 240Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Lys Pro Pro Asn Asp Tyr65 70 75 80tgg ctg ctc atc agc tcg aat acc gac gga gtg gtg tac gag agc acc 288Trp Leu Leu Ile Ser Ser Asn Thr Asp Gly Val Val Tyr Glu Ser Thr85 90 95aat aat agc gac ttc tgg acc gca gtg atc gct gtg gag cca cac gtg 336Asn Asn Ser Asp Phe Trp Thr Ala Val Ile Ala Val Glu Pro His Val100 105 110agc cag acc aat agg cag tac gtg ctc ttc ggt gag aat aag cag ttc 384Ser Gln Thr Asn Arg Gln Tyr Val Leu Phe Gly Glu Asn Lys Gln Phe115 120 125aac gtg gag aat agc tcg gac aag tgg aag ttt ttc gaa atg ttt aag 432Asn Val Glu Asn Ser Ser Asp Lys Trp Lys Phe Phe Glu Met Phe Lys130 135 140ggt aat agt cag agc gac ttc tcg aat agg cgg acc tta acc tcg aat 480
Gly Asn Ser Gln Ser Asp phe Ser Asn Arg Arg Thr Leu Thr Ser Asn145 150 155 160aat agg ctc gtg gga atg ctc aag tac ggt gga agg gtg tgg acg ttt 528Asn Arg Leu Val Gly Met Leu Lys Tyr Gly Gly Arg Val Trp Thr Phe165 170 175cac ggt gag acc cca agg gct acc acc gac agc tcg aat acc gcg gac 576His Gly Glu Thr Pro Arg Ala Thr Thr Asp Ser Ser Asn Thr Ala Asp180 185 190ctc aat aat atc tcg atc atc atc cac tcg gag ttc tac atc atc cca 624Leu Asn Asn Ile Ser Ile Ile Ile His Ser Glu Phe Tyr Ile Ile Pro195 200 205aga tcc caa gaa tct aaa tgt aat gaa tat att aat aat ggt tta cca 672Arg Ser Gln Glu Ser Lys Cys Asn Glu Tyr Ile Asn Asn Gly Leu Pro210 215 220cca atc cag aat acc agg aat gtg gtg ccg ctc tcg ctc tcg tcg agg 720Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Leu Ser Leu Ser Ser Arg225 230 235 240tcg atc cag tac agg agg gca cag gtg aat gag gac atc acc atc tcg 768Ser Ile Gln Tyr Arg Arg Ala Gln Val Asn Glu Asp Ile Thr Ile Ser245 250 255aag acc tcg ctc tgg aag gag atg cag tac aat agg gac atc atc atc 816Lys Thr Ser Leu Trp Lys Glu Met Gln Tyr Asn Arg Asp Ile Ile Ile260 265 270aga ttc aag ttc ggt aat agc gtg atc aag ctc gga gga ctc gga tac 864Arg Phe Lys Phe Gly Asn Ser Val Ile Lys Leu Gly Gly Leu Gly Tyr275 280 285aag tgg tcg gag atc tcg tac aag gca gcg aat tac caa tac agc tac 912Lys Trp Ser Glu Ile Ser Tyr Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Ser Tyr290 295 300tcg cgt gac ggt gag cag gtg acc gca cac acc acc tgc tcg gtg aat 960Ser Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala His Thr Thr Cys Ser Val Asn305 310 315 320gga gtg aat aat ttc agc tac aat gga ggt tcg ctc cct acc gac ttc 1008Gly Val Asn Asn Phe Ser Tyr Asn Gly Gly Ser Leu Pro Thr Asp Phe325 330 335agc atc tcg agg tac gag gtg atc aag gag aat tcg tac gtg tac atc 1056Ser Ile Ser Arg Tyr Glu Val Ile Lys Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Ile340 345 350
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Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Leu Ser Leu Ser Ser Arg225 230 235 240Ser Ile Gln Tyr Arg Arg Ala Gln Val Asn Glu Asp Ile Thr Ile Ser245 250 255Lys Thr Ser Leu Trp Lys Glu Met Gln Tyr Asn Arg Asp Ile Ile Ile260 265 270Arg Phe Lys Phe Gly Asn Ser Val Ile Lys Leu Gly Gly Leu Gly Tyr275 280 285Lys Trp Ser Glu Ile Ser Tyr Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Ser Tyr290 295 300Ser Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala His Thr Thr Cys Ser Val Asn305 310 315 320Gly Val Asn Asn Phe Ser Tyr Asn Gly Gly Ser Leu Pro Thr Asp Phe325 330 335Ser Ile Ser Arg Tyr Glu Val Ile Lys Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Ile340 345 350Asp Tyr Trp Asp Asp Ser Lys Ala Phe Arg Asn Met Val Tyr Val Arg355 360 365Ser Leu Ala Ala Asn Leu Asn Ser Val Lys Cys Val Gly Gly Ser Tyr370 375 380Asp Phe Arg Leu Pro Val Gly Glu Trp Pro Ile Met Asn Gly Gly Ala385 390 395 400Val Ser Leu His Phe Ala Gly Val Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr Asp405 410 415Phe Val Ser Leu Asn Ser Leu Arg Phe Arg Phe Ser Leu Thr Val Asp420 425 430Glu Pro Ser Phe Ser Ile Ile Arg Thr Arg Thr Met Asn Leu Tyr Gly435 440 445Leu Pro Ala Ala Asn Pro Asn Asn Gly Asn Glu Tyr Tyr Glu Val Ser450 455 460Gly Arg Phe Ser Leu Ile Ser Leu Val Pro Thr Asn Asp Asp Tyr Gln465 470 475 480Thr Pro Ile Met Asn Ser Val Thr Val Arg Gln Asp Leu Glu Arg Gln485 490 495Leu Asn Asp Leu Arg Glu Glu Phe Asn Ser Leu Ser Gln Glu Ile Ala500 505 510Met Ser Gln Leu Ile Asp Leu Ala Leu Leu Pro Leu Asp Met Phe Pro515 520 525
Met Phe Ser Gly Ile Lys Ser Thr Ile Asp Leu Thr Lys Ser Met Ala530 535 540Thr Ser Val Ile Lys Lys Phe Arg Lys Ser Lys Leu Ala Thr Ser Ile545 550 555 560Ser Glu Met Thr Asn Ser Leu Ser Asp Ala Ala Ser Ser Ala Ser Arg565 570 575Ser Ala Ser Ile Arg Ser Asn Leu Ser Thr Thr Ser Asn Trp Ser Asn580 585 590Ala Ser Lys Ser Val Leu Asn Val Thr Asp Ser Val Asn Asp Val Ser595 600 605Thr Gln Thr Ser Thr Ile Ser Lys Lys Leu Arg Leu Lys Glu Met Ile610 615 620Thr Gln Thr Glu Gly Ile Ser Phe Asp Asp Ile Ser Ala Ala Val Leu625 630 635 640Arg Thr Lys Ile Asp Met Ser Thr Gln Ile Gly Lys Asn Thr Leu Pro645 650 655Asp Ile Val Thr Glu Ala Thr Glu Lys Phe Ile Pro Lys Arg Ser Tyr660 665 670Arg Val Leu Lys Asp Asp Glu Val Met Glu Val Asn Thr Glu Gly Lys675 680 685Phe Phe Ala Tyr Lys Val Asp Thr Leu Asn Glu Ile Pro Phe Asp Ile690 695 700Asn Lys Phe Ala Glu Leu Val Thr Asp Ser Pro Val Ile Ser Ala Ile705 710 715 720Ile Asp Phe Lys Thr Leu Lys Asn Leu Asn Asp Asn Tyr Gly Ile Thr725 730 735Arg Ile Glu Ala Leu Asn Leu Ile Lys Ser Asn Pro Asn Val Leu Arg740 745 750Asn Phe Ile Asn Gln Asn Asn Pro Ile Ile Arg Asn Arg Ile Glu Gln755 760 765Leu Ile Leu Gln Cys Lys Leu770 77权利要求
1.一种提高轮状病毒抗原蛋白在转基因植物中表达含量的方法，该方法包括目的基因密码子的优化和使用植物病毒5’端和3’端的部分非编码序列作为目的基因在植物中增强表达的调控序列。
2.如权利要求1中的方法，其中所说的植物至少有一部分是可以食用的。
3.如权利要求1中的方法，其中所说的病毒抗原蛋白是人轮状病毒VP7、VP4抗原蛋白或其衍生物。
4.如权利要求1中的方法，其中所说的植物病毒是马铃薯Y病毒，所说的增强表达调控序列是马铃薯Y病毒RNA的5’端和3’端的部分非编码序列。
5.一种引起人或哺乳动物对轮状病毒抗原蛋白产生免疫应答的方法，该方法包括使用有效和确定免疫剂量的、来源于能产生该抗原蛋白或其衍生物的转基因植物的植物材料或其加工提取物对该哺乳动物进行口服或肠道给药。
6.如权利要求5中的方法，其中所说的植物至少有一部分是可以食用的。
7.如权利要求5中的方法，其中所说的轮状病毒抗原蛋白是VP7、VP4抗原蛋白或其衍生物。
8.抗原来自一种病毒，其中所说的抗原可以在植物中表达生产，且该抗原为蛋白质，在自然状态下具有免疫原性。
9.如权利要求8中的抗原，其中所说的植物至少有一部分是可以食用的。
10.如权利要求8中的抗原，其中所说的病毒是引起腹泻的人轮状病毒。
11.一种转基因植物是能够表达一种或多种病毒蛋白的植物，这些蛋白在自然状态下具有免疫原性。
12.如权利要求11中的转基因植物，其中所说的植物至少有一部分是可食用的。
13.如权利要求11中的转基因植物，其中所说的病毒是人腹泻轮状病毒。
14.一种人腹泻轮状病毒抗原在植物中表达，其中所说的抗原为蛋白质，它在天然状态下具有免疫原性，且可以作为一种药物的有效组成部分。
15.一种食物至少是由转基因植物的某一部分所组成，它被食用是因为它具有一定的营养价值，其中所说的植物是能够表一种或多种人轮状病毒VP7或VP4抗原蛋白的植物，这些抗原蛋白在自然状态下具有免疫原性。
16.如权利要求15中的任何食物，其中所说的植物食用部分包括果实、叶子、茎、根或所说的植物种子。
17.一个用于转化植物的质粒载体至少包括一段编码人腹泻轮状病毒蛋白抗原的DNA序列，该序列是按照植物所偏爱的密码子经过优化的，该蛋白在天然状态下具有免疫原性。编码人腹泻轮状病毒蛋白抗原的DNA序列的两端分别与源自马铃薯Y病毒5’端和3’端的部分非编码序列相连。一个与上述经过修饰的DNA序列连接的植物启动子，该启动子操纵上述基因在所说的植物中表达。
18.如权利要求17中的质粒载体，它含有一个选择或标记基因。
19.如权利要求17中的质粒载体，其中所说的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。
20.如权利要求17中的质粒载体，其中所说的植物至少有一部分是可食用性的。
21.如权利要求17中的质粒载体，其中所说的病毒蛋白抗原是人腹泻轮状病毒VP7、VP4抗原蛋白或其衍生物。
22.一段用于基因枪法转化植物的DNA序列至少包括一段编码人腹泻轮状病毒蛋白抗原的DNA序列，该序列是按照植物所偏爱的密码子经过优化的，该蛋白在天然状态下具有免疫原性。编码人腹泻轮状病毒蛋白抗原的DNA序列的两端分别与源自马铃薯Y病毒5’端和3’端的部分非编码序列相连。一个与上述经过修饰的DNA序列连接的植物启动子，该启动子操纵上述基因在所说的植物中表达。
23.如权利要求22中的DNA序列，它含有一个选择或标记基因。
24.如权利要求22中的DNA序列，其中所说的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。
25.如权利要求22中的DNA序列，其中所说的植物至少有一部分是可食性的。
26.如权利要求22中的DNA序列，其中所说的病毒蛋白抗原是人腹泻轮状病毒抗原蛋白VP4或VP7。
27.一种构建转基因植物细胞的方法包括构建一个质粒载体或一段DNA序列，其中都含有编码一种或一种以上密码子经过优化的人腹泻轮状病毒抗原蛋白VP7、VP4的基因或其衍生物、源自马铃薯Y病毒5’端和3’端的非编码区序列以及可操纵这些基因在所说的植物中表达的植物启动子，这些蛋白在自然状态下具有免疫原性。用该质粒载体或该DNA序列转化植物细胞。
28.如权利要求27中的方法，它包括从所说的转基因植物细胞中再生出完整的转基因植株。
29.生产一种冲剂、口服液或其它制剂的方法包括构建一个质粒载体或一段DNA序列，其中都含有编码一种或一种以上密码子经过优化的人腹泻轮状病毒抗原蛋白VP7或VP4的基因或其衍生物、源自马铃薯Y病毒5’端和3’端的非编码区序列以及可操纵这些基因在所说的植物中表达的植物启动子，这些蛋白在天然状态下具有免疫原性。用该质粒载体或该DNA序列转化植物细胞。将转基因植物的食用部分冷冻、干燥和磨碎，然后直接或混合后制作成冲剂、口服液或其它制剂。
30.如权利要求29的方法，其中还包括在利用转基因植物作为食物以及加工成冲剂、口服液或其它制剂之前，应从所说的转基因植物细胞中再生出完整的转基因植株。
31.如权利要求29中的方法，其中还包括从所说的植物细胞中部分纯化或完全纯化出所说的抗原蛋白然后直接或混合后作为冲剂、口服液或其它制剂的有效组成部分。
32.如权利要求30中的方法，其中包括至少收获所说的转基因植物的某一部分。
33.如权利要求29中的方法，其中所说的植物细胞是通过农杆菌系统转化的。
34.如权利要求33中的方法，其中所说的农杆菌系统是农杆菌Ti质粒系统。
35.如权利要求29中的方法，其中所说的植物是番茄、马铃薯、莴苣、胡萝卜、香蕉、苹果、木瓜、大豆、苜蓿或其它可食用的植物。
36.如权利要求29中的方法，其中所说的质粒载体是一个双元载体系统。
37.如权利要求29中的方法，其中所说的质粒载体是一个整合性载体。
38.如权利要求29中的方法，其中所说的质粒载体是pBI121。
39.如权利要求29中的方法，其中所说的植物细胞是通过除农杆菌转化系统以外的其它转化方法如基因枪法、微管注射法、PEG吸收法以及电融合法等方法转化的。
40.如权利要求29中的方法，其中所说的植物细胞是一个双子叶植物的细胞，或是一个单子叶植物的细胞。
全文摘要
本发明涉及提高婴幼儿腹泻轮状病毒VP
文档编号C07K14/005GK1624141SQ200310117119
公开日2005年6月8日 申请日期2003年12月3日 优先权日2003年12月3日
发明者刘德虎, 李刚强, 徐妙云, 杨培龙, 方肇寅 申请人:中国农业科学院生物技术研究所