专利名称：一种油菜叶片脯氨酸含量快速检测方法
技术领域：
本发明涉及油菜检测领域，尤其涉及一种油菜叶片脯氨酸含量快速检测方法。
背景技术：
油菜是我国主要的油料作物和蜜源作物之一，油菜的种植面积占全国油料作物总 面积的40%以上，产量占全国食用植物油总产量的60%以上，居世界首位。油菜不同时期 的生长状况关系到油菜籽的产量和质量。油菜叶片中的氨基酸含量是油菜生长过程中一项 非常重要的生理指标，对油菜叶片生理和有机物积累等生理过程有重要意义。因此可以通 过检测油菜叶片中的氨基酸含量，得到油菜的生长状况。近年来，由于农村劳动力的减少， 油菜种植中使用了大量的除草剂。有些除草剂是一种生长抑制剂，例如丙酯草醚，可以阻止 直链氨基酸的生物合成，具有对油菜安全、杀草谱较广、除草活性高、持效期长，且低毒、低 残留，与环境相容等特点。当油菜处于逆境胁迫下，由植物体内脯氨酸生物合成激活和脯氨 酸降解的抑制共同导致的脯氨酸的积累，并且在逆境压力解除后迅速被分解利用。普遍认 为，逆境胁迫下脯氨酸大量积累可能对植物在压力解除后的恢复有很大帮助，因为脯氨酸 可以作为碳源和氮源，并且能够为细胞恢复提供大量的能量。因此，其含量可以作为植物抗 逆性的生理指标之一，脯氨酸量高，植物抗性强。对油菜叶片中脯氨酸含量的检测，可以反 映出某些除草剂对油菜生理和逆境胁迫的影响，对实现油菜生长状况的大田检测和连续监 测，提高油菜籽的产量和质量有重要意义。传统的油菜叶片脯氨酸含量检测方法是根据GB/T5009. 124-2003，采用万分之一 天平准确称取粉样0. 05g置于IOml体积的安培瓶中，加入5ml6M HCL，用循环真空泵抽真空 并在酒精喷灯上封口后置于110°C烘箱中消解24h ；将冷却后的消解液完全转移到50ml容 量瓶中定容、摇勻；吸取5ml上清液置于圆底磨口锥形瓶中，在旋转蒸发仪上(60 70°C) 抽真空15min左右蒸干盐酸；重新加入0.02M HCl (pH 2. 2) 10ml，超声波充分溶解后用一次 性针筒吸出，经0. 22 μ m的一次性滤头过滤至氨基酸分析专用样品瓶中，4°C黑暗保存，用 日立L-8900自动氨基酸分析仪(日本)分析测定脯氨酸含量。该方法样本预处理过程和 测量过程费时、费力、化学消耗品昂贵，且对环境造成一定污染。因此，急需研究一种简单、 快速、无损的油菜叶片脯氨酸含量检测方法和技术。可见/近红外光谱可以反映物质内部的有机成分，特别是C-H、0-H、N-H等基团的 倍频和合频吸收，可用于定量测定物质有机物质的含量。光谱技术已广泛应用于农业、食 品、石油化工、制药、饲料等行业。在植物生命信息快速检测研究中具有广泛的应用潜力
发明内容
本发明提供了一种油菜叶片脯氨酸含量快速检测方法，解决了现有检测方法费 时、费力、操作复杂、污染环境等问题。一种油菜叶片脯氨酸含量快速检测方法，包括以下步骤(1)将油菜叶片杀青、烘干后粉碎，得到叶片粉末；
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(2)分别采集波长 2308nm、1444nm、1418nm、l994nm、2432nm、2366nm、2O2Onnu 1100nm、1942nm、2058nm、1338nm、1730nm、2294nm 和 2186nm 光波所对应的油菜叶片的反射 率；(3)将各反射率分别代入多元线性回归方程y = -151770 λ「179. 233 λ 2-156. 08 0 λ 3+90. 881 λ 4-61. 178 λ 5-85. 245 λ 6-97. 499 λ 7+14. 884 λ 8-47. 067 λ 9+39. 998 λ 1(ι-35. 203 λ η_1· 957 λ 12-7· 455 λ 13+60. 409 λ 14+1. 8470，计算油菜叶片中脯氨酸含量；方程中y为油菜叶片脯氨酸含量，单位为mg/100mg DWJ1- λ 14分别为波长 2308nm、1444nm、1418nm、1994nm、2432nm、2366nm、2020nm、llOOnm、1942nm、2058nm、1338nm、 1730nm、2294nm和2186nm光波所对应的油菜叶片粉末样本的反射率。步骤(1)中，叶片粉末为40 80目，杀青温度为95 115°C，杀青时间为20 40min。该杀青温度和杀青时间适宜，有利于油菜叶片中主成分的保留，特别是脯氨酸。步 骤(1)中，烘干温度为70 90°C，将叶片烘干至恒重，该烘干温度适宜，不会烤焦叶片。因为油菜叶片粉末样本是非透明介质，当光波照射在其表面时，除部分被吸收外， 其余均发生反射，而光波吸收的多少(或者反射率)是跟油菜叶片内部化学物质含量是相 关的，而针对脯氨酸含量这类具体物质仅仅跟少数某些特征波长光波的反射率相关。应用连续投影算法在1100 2500nm波长范围内进行特征波长的选取，得到这些 特征波长分别为 2308nm、1444nm、1418nm、1994nm、2432nm、2366nm、2020nm、1 lOOnm、1942nm、 2058nm、1338nm、1730nm、2294nm和2186nm。将上述波长的反射率值作为多元线性回归模型 的输入变量，实际测量的脯氨酸含量作为输出变量，计算得到上述多元线性回归方程。本发明通过少数特征波长进行多元线性回归分析，快速准确检测油菜叶片中脯氨 酸含量，大大缩短了检测的时间，减少了环境污染，降低了检测成本。
图1为本发明建模集样本预测结果散点分布图；图2为本发明预测集样本预测结果散点分布图。
具体实施例方式随机收集248片油菜叶片，为使所采集的油菜叶片样本更具有代表性和多样性， 所采集的248片叶片中不仅包括正常生长状态下的油菜叶片(共62片)，还包括喷施过不 同浓度(100，500，1000mg/L)丙酯草醚除草剂的油菜叶片186片(100，500，1000mg/L每个 浓度梯度采集油菜叶片62片)，喷洒时间为五叶一心期，喷洒方式为叶面喷施。丙酯草醚除 草剂是一种脯氨酸抑制剂，对油菜叶片脯氨酸具有抑制作用，可以使油菜叶片中的脯氨酸 含量具有更大的范围，使得所建模型具有更好的适应性和鲁棒性。将248片油菜叶片放在105°C的烘箱中杀青30分钟后于80°C下烘干至恒重。再 用研钵将烘干后的油菜叶片样品磨成粉末，并过60目筛。在室温下测定油菜叶片粉末样本 在波长 2308nm、1444nm、1418nm、1994nm、2432nm、2366nm、2020nm、1 lOOnm、1942nm、2058nm、 1338nm、1730nm、2294nm和 2186nm处的反射率值(Foss NIR Systems 5000)，同时利用背景 技术所提及的传统方法测量所有叶片的脯氨酸含量。然后随机选择186个样本作为建模集 样本，其余62个作为预测集样本，以建模集样本186片油菜叶片的各特征波长的反射率值
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作为输入变量，以相应的测量的脯氨酸含量作为输出变量，利用多元线性回归法(Multiple linearregression，MLR)得到如下多元线性回归方程y = -151770 λ「179. 233 λ 2-156. 080 λ 3+90. 881 λ 4-61. 178 λ 5-85. 245 λ 6-97. 499 λ 7+14. 884 λ 8-47. 067 λ 9+39. 998 λ 1(ι-35. 203 λ η-1. 957 λ 12-7. 455 λ 13+60. 409 λ 14+1. 8470，计算得到油菜叶片脯氨酸含量。方程中y (mg/lOOmg Dff)为油菜叶片脯氨酸含量，单位为mg/100mgDW ； λ工 X14 分别为波长 2308nm、1444nm、1418nm、1994nm、2432nm、2366nm、2020nm、1100nm、1942nm、 2058nm、1338nm、1730nm、2294nm和2186nm光波所对应的油菜叶片粉末样本的反射率。然后利用上述多元线性回归方程对建模集和预测集油菜叶片样本的脯氨酸含量 进行预测，并对预测结果进行评价。评价指标中相关系数和斜率越接近于1，均方根误差、偏 差的绝对值和截距的绝对值越小，说明模型预测性能越好。预测结果如下表所示 对建模集和预测集进行预测，油菜叶片脯氨酸含量的预测值与真实化学方法测量 值之间的相关系数均大于0. 95，获得了满意的预测精度。对建模集和预测集样本预测结果 的散点分布图如图1和图2所示，图中样本靠近分布于回归直线两侧，具有很好的线性预测 效果。上述结果说明应用本发明的方法能够快速准确地实现油菜叶片脯氨酸含量的检测。
权利要求
一种油菜叶片脯氨酸含量快速检测方法，包括以下步骤(1)将油菜叶片杀青、烘干后粉碎，得到叶片粉末；(2)分别采集波长2308nm、1444nm、1418nm、1994nm、2432nm、2366nm、2020nm、1100nm、1942nm、2058nm、1338nm、1730nm、2294nm和2186nm光波所对应的油菜叶片的反射率；(3)将各反射率分别代入多元线性回归方程y＝ 151770λ1 179.233λ2 156.080λ3+90.881λ4 61.178λ5 85.245λ6 97.499λ7+14.884λ8 47.067λ9+39.998λ10 35.203λ11 1.957λ12 7.455λ13+60.409λ14+1.8470，计算油菜叶片中脯氨酸含量；方程中y为油菜叶片脯氨酸含量；λ1～λ14分别为波长2308nm、1444nm、1418nm、1994nm、2432nm、2366nm、2020nm、1100nm、1942nm、2058nm、1338nm、1730nm、2294nm和2186nm光波所对应的油菜叶片粉末样本的反射率。
2.根据权利要求1所述的油菜叶片脯氨酸含量快速检测方法，其特征在于所述的叶 片粉末为40 80目。
3.根据权利要求1所述的油菜叶片脯氨酸含量快速检测方法，其特征在于步骤(1) 中，杀青温度为95 115°C，杀青时间为20 40min。
4.根据权利要求1所述的油菜叶片脯氨酸含量快速检测方法，其特征在于步骤(1) 中，烘干温度为70 90°C。
全文摘要
本发明公开了一种油菜叶片脯氨酸含量快速检测方法，包括以下步骤将油菜叶片杀青、烘干后粉碎，得到叶片粉末；分别采集波长2308、1444、1418、1994、2432、2366、2020、1100、1942、2058、1338、1730、2294和2186nm光波所对应的油菜叶片的反射率；将各反射率分别代入多元线性回归方程，计算油菜叶片中脯氨酸含量。本发明通过少数特征波长进行多元线性回归分析，快速准确检测油菜叶片中脯氨酸含量，大大缩短了检测的时间，减少了环境污染，降低了检测成本。
文档编号G01N21/49GK101900679SQ20101021903
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月5日 优先权日2010年7月5日
发明者何勇, 刘飞, 孔汶汶 申请人:浙江大学